Download Diapositiva 1

Utilidad de las técnicas de
biología molecular en el
manejo de bacterias
fastidiosas.
Estudio rutinario de las bacterias en el
laboratorio
Examen microscópico (en fresco, Gram, ZiehlNeelsen, otros)
Cultivo y aislamiento
Estudio y caracterización fenotípica.
Bacterias fastidiosas
Aquellas donde el estudio se rutina se ve
dificultado:
- 1) Dificultades en la observación microscópica.
- 2) Dificultades en el cultivo o aislamiento:
a) Lento desarrollo: períodos largos de incubación.
b) Requerimientos nutricionales: medios de cultivo
especiales y específicos.
c) Requerimientos de atmósfera gaseosa: generación de
mezclas específicas de gases, uso de jarras.
d) Dificultades en la manipulación en el laboratorio: áreas
de mayor bioseguridad.
Otras complicaciones que pueden dificultar el estudio:
1) Muestras difíciles de tomar.
2) Dificultades para el transporte (medios de transporte
específicos, tiempos cortos de transporte,
refrigeración).
3) Presencia de inhibidores del crecimiento.
4) Bajo inóculo bacteriano: sensibilidad disminuída.
5) Especies directamente incultivables.
Métodos de rutina para bacterias fastidiosas
a) Mayores condiciones de equipamiento e insumos
y
b) Operadores más y mejor entrenados.
Aún así, la sensibilidad de los mismos no siempre es buena.
a) AUMENTO DE COSTOS
b) RESULTADOS DE CALIDAD INFERIOR
Biología molecular Vs. Métodos
tradicionales (en bacteriología) .
RELACIÓN
COSTOBENEFICIO
(para biología
molecular).
Para bacterias “comunes” (no fastidiosas)
es ALTA y sólo se utiliza para situaciones
especiales (por ejemplo, estudios de
microbiología básica o epidemiología).
Para bacterias fastidiosas es OPTIMA y
se puede utilizar aún en estudios
sencillos como identificación .
Utilidad de la biología molecular en
bacterias fastidiosas
Toma de muestra.
Tratamiento específico ( liberación y/o extracción de ácidos
nucleicos).
Técnicas de biología molecular
IDENTIFICACION
Identificación bacteriana mediante
técnica de PCR
a) AMPLIFICACIÓN
CONSERVADOS:
- 16S- r RNA
- 23S- r RNA
- rpoB
DE
GENES
ALTAMENTE
a1) -Utilización de “primers” o cebadores
denominados “universales”: alta afinidad por
regiones conservadas en casi todas las
especies bacterianas
VENTAJAS
- Útil en la identificación de especies
desconocidas.
- Útil en la búsqueda de distintas posibles
especies en una misma muestra.
DESVENTAJAS:
-Requiere siempre posteriores ensayos de
secuenciación, hibridación u otras técnicas
moleculares.
- Sufre frecuentemente contaminaciones que
dificultan el trabajo.
a2) Utilización de “primers” o cebadores género
o especie específico: unen a regiones
conservadas en un género o especie y
amplifican solamente en el mismo.
VENTAJAS
-No requieren técnicas posteriores
completar el estudio.
-Buscan directamente un único blanco.
-Brindan resultados rápidos.
para
DESVENTAJAS:
-En muchos casos, no existen cebadores
altamente específicos para estos genes y no se
puede llegar a la identificación de especie con
alta especificidad.
¿Cómo podemos saber que “primers”
usar y qué utilidad tienen cuando
buscamos una especie definida?
-Buscar en bibliografía publicada (técnicas de
identificación molecular ya puestas a punto
para esa especie).
-Diseñar nuestros propios “primers” mediante
programas útiles (ej: DNA-man). En este caso,
utilizando Banco genético de datos, podemos
conocer la especificidad de los mismos.
b) ¿PODEMOS UTILIZAR OTROS GENES EN
LA IDENTIFICACIÓN BACTERIANA POR PCR?
Sí, de acuerdo al género o especie se eligen
genes característicos, que tengan regiones
altamente específicas.
Ejemplos en distintas bacterias:
-genes omp (proteínas de membrana externa)
(Chlamydia- Rickettsia).
- genes ure (enzimas ureasas)(Helicobacter).
- gen de enzima citrato sintetasa (Bartonella).
c) USO DE TÉCNICAS BASADAS EN PCR
PARA MEJORAR LA IDENTIFICACIÓN.
- Multiplex PCR: dos o más genes target en
una misma reacción.
- Nested PCR: amplificación secuencial de un
gen con dos pares distintos de “primers”.
AMBAS MEJORAN LA ESPECIFICIDAD
DE LA IDENTIFICACION
-PCR en tiempo real (Real-time PCR):
utilizando sondas marcadas altamente
específicas con el producto amplificado.
VENTAJAS:
- Resultados muy rápidos.
- Muy buena especificidad.
- Posibilidad de identificar y cuantificar al
mismo tiempo.
- Posibilidad de medir expresión génica.
DESVENTAJAS:
- Costo y equipamiento.
OTRAS APLICACIONES DE LA BIOLOGÍA
MOLECULAR EN BACTERIAS
FASTIDIOSAS.
-Detección
de
factores
de
bacterianos específicos (PCR).
virulencia
-Detección de resistencia antibiótica (PCRRFLP, secuenciación etc.)
-Estudios de evolución genética (MLST).
-Delineación clonal para realizar estudios
epidemiológicos (PFGE- RAPD- REP-PCR) (no
de muestras directamente).