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Revista de la Facultad de Medicina
Veterinaria y de Zootecnia
ISSN: 0120-2952
[email protected]
Universidad Nacional de Colombia Sede
Bogotá
Colombia
Novoa, C F; Restrepo, L P
INFLUENCIA DE LAS BACTERIAS PSICRÓTROFAS EN LA ACTIVIDAD
PROTEOLÍTICA DE LA LECHE
Revista de la Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia, vol. 54, núm. I, 2007, pp. 9
-16
Universidad Nacional de Colombia Sede Bogotá
Bogotá, Colombia
Disponible en: http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=407642324004
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INFLUENCIA DE LAS BACTERIAS PSICRÓTROFAS
EN LA ACTIVIDAD PROTEOLÍTICA DE LA LECHE
Novoa, CF1, Restrepo Lp2
Departamento de Química, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia.
RESUMEN
La refrigeración
de la leche reduce el ritmo de multiplicación
mos, pero ha generado nuevos problemas relacionados
microorganismos
dependientemente
psicrótrofos,
y actividad de los microorganis-
con el crecimiento y la actividad de los
que son aquellos que crecen a temperaturas
de su temperatura
óptima. Estos microorganismos
inferiores a 7°C, in-
producen enzimas ter-
moestables que degradan algunos componentes de la leche deteriorando su calidad y la de sus derivados,
y disminuyendo
los rendimientos
proteolítica de las bacterias psicrótrofas
tiempo de almacenamiento
queseros.
Con el fin de evaluar
la actividad
sobre las caseínas y su relación con la temperatura y
de la leche, se inocularon diferentes lotes de leche con este tipo de
bacterias, hasta obtener recuentos de 104 Y 105 unidades formadoras
de colonia por mililitro
(ufc/ml); como control se utilizó leche que no recibió inoculación con recuento de psicrótrofos de
103 ufc/ml. Después de almacenarla
leche a4 y 7 °C durante tres y seis días, se evaluó la actividad
proteolítica sobre las caseínas. Al almacenar leche durante tres días a 4 y 7°C, no se presentó actividad proteolítica cuando el recuento inicial de psicrótrofos era del orden de 103 ufc/ml, mientras
que cuando dicho recuento fue superior a 104 ufc/ml se observó actividad proteolítica,
más intensa a 7 °C que a 4 "C. Con almacenamiento
siendo
de seis días, solamente la leche conservada a
4°C con recuento inicial de 103 ufc/ml no presentó actividad proteolítica, los demás tratamientos
mostraron gran actividad proteolítica sobre la fracción de caseínas aumentando dicha actividad a
medida que aumenta el grado de contaminación.
Palabras clave: leche, refrigeración, psicrótrofos, Pseudomonas jluorescens, proteólisis, caseínas.
INFLUENCE OF PSICHROTROPHIC BACTERIA
IN PROTEOLYTIC ACTIVITY OF MILK
ABSTRACT
Refrigeration of milk reduces the rate of multiplication
and activity of microorganisms,
generated new problems related to the growth and activity ofpsichrotrophic
which are those that grow at temperatures
They produce thermostable
but it has
microorganisms,
lower than 7°C, no matter the optimum temperature.
enzymes that degrade some components
of milk, deteriorating
its
quality and the one of dairy products. Proteolytic activity in the milk caused by these microorganisms, has relation with several problems of quality and yield of dairy products. In order to evaluate proteolytic activity ofpsichrotrophic
bacteria on casein and its relation with the temperatu-
re and time of storage of milk, different lots from milk were inoculated with psichrotrophic
bacteria, until obtaining counts of 104 and 105 units of colonies formers/mL (ucf/ml); as control
was used milk that did not receive inoculation with a count of 103 ucf/ml. After storing milk at 4
°C and 7 °C during three and six days, proteolytic activity on casein was evaluated. Milk stored
l
2
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during three days at 4°C and 7°C, did not show difference in proteolytic activity by temperature
effect when the initial count was 103 ucflml, but when count was 104 ucflml or more, proteolytic
activity was observed. When milk was stored during six days, only the milk conserved at 4 °C
with initial count of 103 ucf/ml, did not display proteolytic activity, the other treatments showed
great proteolytic activity on casein being greater at 7 °C than at 4°C, and increasing this activity
as the contamination
level was greater.
Key words: Storage of milk, psichrotrophic,
Pseudomonas jluorescens,
INTRODUCCIÓN
La refrigeración de la leche disminuye la
actividad de los microorganismos, pero favorece la selección de los psicrótrofos; dichos
microorganismos representan menos del 10%
de la microbiota de la leche higiénica sin refrigerar, pero en leches con mala calidad higiénica pueden llegar a constituirse en las bacterias
predominantes, tras permanecer almacenada
de dos a tres días bajo condiciones de refrigeración (1).
Los microorganismos psicrótrofos más
prevalentes en leches crudas pertenecen principalmente al género Pseudomonas y dentro
de éste, la especie más comúnmente encontrada es Ps.fluorescens, situación que se observa
en muchos países (2). A medida que aumenta
el número de microorganismos psicrótrofos
en la leche, éstos sintetizan enzimas, muchas
de las cuales son termoestables, causando alteraciones bioquímicas en los componentes de
la leche. La proteólisis de la leche puede causar disminución en el rendimiento quesero y
cambios en e! comportamiento del líquido durante el tratamiento térmico, o cambios en la
calidad de los productos lácteos (3, 4). Se ha
detectado presencia de proteasas en leche, con
recuentos de microorganismos psicrótrofos
del orden de 106 ufc/ml (5). La síntesis de enzimas ocurre óptimamente en la mayoría de
las bacterias psicrótrofas entre 20 y 30°C, sin
embargo, a temperaturas bajas se presenta una
síntesis considerable (6).
proteolysis,
casein.
Tras elevarse el conteo de bacterias psicrotróficas en la leche con una cepa de Pseudomonasfluorescens hasta 1,2 x 107 ufc/ml, con
24 horas de crecimiento a 7°C, se duplica e!
grado de proteólisis con relación al testigo, y
luego de 72 horas de crecimiento también a 7
°C, con W1 conteo de 4,5 x 109 ufc/ml, se incrementa la actividad proteolítica en catorce veces con relación al testigo, mostrando la gran
incidencia de! nivel de contaminación en la actividad proteolítica, cuando la leche se almacena a 7 °C o más (7).
Las proteínas del suero son menos susceptibles de sufrir proteólisis que las caseínas. Las
caseínas son las proteínas más importantes de
la leche desde el punto de vista industrial, pues
la mayoría, imparten propiedades funcionales
a la leche como la tennoestabilidad y capacidad de coagulación, conforman la estructura
del queso determinando el rendimiento industrial, también influyen directamente en las características fisicoquímicas y sensoriales de
los productos lácteos. A medida que se presenta proteólisis de la caseína en la leche durante
el almacenamiento, menor es la cantidad disponible para su incorporación dentro del retículo de la cuajada durante la elaboración de
quesos, ocasionando una disminución en el
rendimiento (8).
El objetivo de la presente investigación fue
estudiar la actividad proteolítica sobre las easeínas de la leche por el almacenamiento refrigerado a 4 y 7 °C durante tres y seis días, cuando se inicia con diferentes recuentos de
bacterias psicrótrofas, con el fin de determinar
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la importancia de la temperatura y el recuento
de psicrótrofos en la conservación de la leche
refrigerada.
MATERIALES Y MÉTODOS
La leche cruda se seleccionó según los criterios fisicoquímicos establecidos en la legislación colombiana con el fin de asegurar que
no presentara alteraciones o deficiencias en la
calidad que pudieran afectar los resultados;
además, se le realizó el recuento en placa de
bacterias psicrótrofas según el método de la
Federación Internacional de Lechería (9), con
el objeto de seleccionar solamente leches con
bajos recuentos iniciales.
Inoculación de la leche con bacterias psicrotróficas. La leche se inoculó con caldo in-
fusión cerebro corazón que contenía 108
ufc/ml de la bacteria psicrótrofaPseudomonas
jluorescens ATCC 31732, hasta lograr recuentos de psicrótrofos de 104 Y 105 ufc/ml. Como
control se utilizó leche sin inóculo con recuento de 103 ufc/ml.
Almacenamiento
de la leche. Después de
la contaminación con el inóculo, la leche se almacenó a 4 y 7 °C durante 3 y 6 días, realizándose un control el día de la inoculación. Los
niveles de contaminación y la temperatura de
almacenamiento se denominarán con las letras
bajo (B), medio (M) y alto (A) correspondientes a los recuentos 103, 104 Y 105 ufc/ml respectivamente, y los números 4 y 7 para las
temperaturas 4 y 7°C, respectivamente.
Fraccionamiento
de las proteínas lácteas.
Después del almacenamiento refrigerado de la
leche, de cada tratamiento se tomó una muestra
de 200 mi, se retiró la grasa por centrifugación a
11.000 x G durante 20 minutos a4 °C; las caseínas se precipitaron a.pH 4,6 con buffer acetato.
La fracción obtenida se dializó contra agua desionizada a 4°C, hasta conseguir fin de acetatos
en 3-4 días, luego se liofilizó y se almacenó a
-40 °C; a los liofilizados se les analizó el contenido de proteína por el método de Kjeldhal uti-
lizando un equipo Foss Tecator, colocando
una cantidad de muestra con un contenido
aproximado de 150 mg de proteína.
Evaluación de la actividad proteolítica. Se
determinó a través del cambio en el perfil electroforético de las caseínas, con electroforesis
unidímensional, discontinua, en gel de poliacrilamida, con 15% T Y 2,7% C, en condiciones
desnaturalizantes, aplicando dodecil sulfato sódico (SDS) y -mercaptoetanol. Las electroforesis se corrieron a voltaje constante -200 V Y 14
W-, en un equipo Bio-Rad Míni protean 11Slab
Cell. Las muestras liofilizadas se diluyeron en
bicarbonato de amonio 20 milimolar (rnM),
aplicando 15 g de proteína en cada carril. Se utilizaron los patrones de peso molecular marca
Sigma, con pesos moleculares entre 6,5 y 205
kdalton (kDa), referencia M4038. Los geles se
tiñeron con solución de azul de Comassie
R-250, metanol y ácido acético. El perfil electroforético de las caseínas se examínó por densitometría utilizando un analizador de geles Gene
Snap Analiza, Genetic System CM 615, marca
Hitachi.
Análisis estadístico. El recuento de bacterias psicrótrofas en la leche después del almacenamiento refrigerado se realizó por triplicado
y se analizó mediante estadística descriptiva.
Debido a la complejidad de los análisis electroforéticos, éstos no tuvieron réplicas, por lo cual
se describe la intensidad de las bandas de la
fracción de caseína, sin hacer referencia a ningún tipo de análisis estadístico.
RESULTADOS
El recuento promedio de bacterias psicrótrofas obtenido en la leche almacenada a 4 y 7
°C durante 3 y 6 días, con diferentes niveles de
contaminación inicial, se presenta en la tabla l.
Se considera un alto nivel de contaminación cuando el recuento de bacterias psicrótrofas alcanzad nivel crítico de 106 ufc/ml (2, 5).
En la tabla 1 se observa que el recuento de bacterias psicrótrofas se acerca a dicho valor, con
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Tabla 1. Recuento de bacterias psicrótrofas en leche después del almacenamiento
Recuento inicialde bacterias
psicrótrofas
(1011
Temperatura
de almacenamiento
3,00 (nivel bajo)
4,00 (nivel medio)
5,00 (nivel alto)
• Promedio y desviación
estándar
Tiempo dealmacenamiento
(DC)
ufc/mll
tres días(loQ ufc/ml)*
4
2,61
±
seis días(log ufcfml)*
0,27
4,64
±
0,08
±
0.73
7
3,31 :l>-0,58
7,46
4
4,41
+
0,58
5,99
+
0,48
7
5,24
±
0,97
7.74
±
0,21
4
5,90
+
0,61
7,20
+
0,44
de tres repeticiones.
un almacenamiento de 3 días a 4 y 7 °C cuando
el recuento inicial es 105 ufc/ml, mientras que
no se presenta gran crecimiento bacteriano en
tres días cuando se inicia con un recuento de
103 ufc/ml, ni a 4°C cuando el recuento inicial
es del orden de 104 ufc/ml. Con 6 días de almacenamiento ~aunque es un tiempo considerado muy prolongado para conservar leche cruda-, si el recuento inicial no supera el valor de
103 ufc/ml y la temperatura de almacenamiento no sobrepasa los 4 °C se obtiene un recuento
por debajo de este valor crítico de 106 ufc/ml;
los demás tratamientos superan este límite, indicando que sufrieron fuerte crecimiento bacteriano.
lecular (31 y 28 kDa), con aumento de intensidad de las de menor peso molecular (18 y 11
kDa). En las figura 2 y 3 se muestran los densitogramas de la banda con peso molecular 31
kDa, correspondiente al electroforegrama de
la figura 1; se ha colocado un valor arbitrario
de 100 a la intensidad de la banda del tratamiento B4.
En las figuras l a 3 se aprecia que los tratamientos M7 y A7 presentan la mayor disminución en intensidad de la banda más pesada (31
kDa), y aumento en la intensidad de la banda
18 kDa, indicando que no se presenta actividad proteolítica en las leches con los tratamientos que obtuvieron recuentos de hasta 104
Efecto del nivel de contaminación inicial,
temperatura y tiempo de almacenamiento de
la leche en la actividad proteolítica:
Tres días de almacenamiento. La figura 1
presenta el electroforegrama correspondiente
a la fracción de caseínas de la leche almacenada durante 3 días a 4 y 7°C. La disminución en
intensidad o desaparición de bandas de alto
peso molecular, el aumento de intensidad de
las de bajo peso molecular indican actividad
proteolítica.
Se aprecia que los perfiles electroforéticos
de los tratamientos B4, M4, A4 YB7 son bastante similares, mientras que con los tratamientos M7 y A7, se presenta disminución de
la intensidad de las bandas de mayor peso mo-
Gel en poliacrilamida
Identificación
con 15% T
de los carriles:
P
Patrones
BSA
Albúmina sérica bovina
de peso molecular
B4, M4, A4, B7, M7, A7
Tratamientos
¡nivel de conteminacién-tempe-
ratura de almacenamiento).
Figura
1. Electroforegrama
7 'C durante
3 días.
de las caseínas
de la leche almacenada
a4 y
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120
105
100
100
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39
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1IIA4
OB7
DM7
IIIA7
Figura 2. Intensidad relativa de la banda 31 kOa, de la fracción de caseínas de leche almacenada a 4 y 7 'C durante 3 días.
ufc/ml en tres días (tabla 1), mientras que los
que lograron recuentos de 105 y de 106 ufc/ml,
mostraron actividad proteolítica, con excepción del tratamiento A4, que aunque en 3 días
alcanzó un recuento cercano a 106 ufc/mI no
presentó actividad proteolítica, debido a la
baja temperatura de almacenamiento, lo cual
indica que el no superar los 4 °C como temperatura de almacenamiento puede conferir cierto grado de protección contra la proteólisis de
las caseínas, al menos durante tres días. Estos
resultados también demostraron que niveles
de 105 ufc/ml, provocan actividad proteolítica
en la leche, muy cercanos a lo reportado por
muchos autores (2, 5) que aseguran que la actividad proteolítica se presenta con recuentos de
psicrótrofos del orden de 106 ufc/ml.
Al almacenar leche con recuentos iniciales
de psicrótrofos de 103, 104 Y 105 ufc/ml durante tres días a 4 y 7°C, no se presentó diferencia
en la actividad proteolítica por efecto de temperatura cuando el recuento inicial es del orden de 103 ufc/mI, mientras que cuando el recuento de psicrótrofos es superior a 104 ufc/ml
60
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(ti
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Figura 3. Intensidad relativa de la banda 18 kOa, de la fracción de caseínas de leche almacenada a 4 y 7 'C durante 3 días.
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se observó actividad proteolítica, sin presentarse diferencias marcadas entre los recuentos
iniciales de 104 Yde lOS ufc/ml, lo que indica
que cualquier contaminación con psicrótrofos, aunque sea leve, es muy relevante para la
actividad proteolítica.
Seis días de almacenamiento. En la figura
4 se observa el electroforegrama de la fracción
de caseína de leche con tres niveles de contaminación inicial y almacenada durante seis'
días a 4 y 7 DC. Se apreció disminución de la
intensidad relativa de las bandas de mayor
peso molecular con aumento de las más livianas en los tratamientos B7, M7 y A7.
En las figuras 5 y 6 se presentan los densitogramas para las bandas con pesos moleculares de 3 1kDa y 11kDa, asignando un valor arbitrario de 100 a la intensidad de la banda 31
kDa del tratamiento B4.
En las figuras 4 a 6 se aprecia una leve disminución en intensidad de la banda 31 kDa,
con los tratamientos M4, A4 YB7, con intensidades del 68, 62 y 58% con relación a la intensidad de la banda de referencia, mientras que
con los tratamientos M7 y A 7 la disminución
Gel en poliacrilamida con 15% T
Identificación de los carriles:
P
Patrones de peso molecular
BSA
Albúmina sérica bovina
B4, M4, A4, B7, M7, A7
Tratamientos (nivel de contaminacióntemperatura de almacenamiento)
Figura 4. Electroforegrama
de las caseinas de la leche almacenada a 4 y
7 'C durante 6 dias.
de la intensidad de dicha banda es más fuerte
mostrando intensidades de 18 y 22% respectivamente.
En la figura 5 se observa la aparición de una
nueva banda liviana de peso 11kDa, que no se
observa en el tratamiento B4, la cual presenta
baja intensidad con los tratamientos M4 y A4,
pero aumenta cuando la leche se almacena a 7
DC y sobre todo en la leche que recibió inocu-
120
100
ro
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Figura 5. Intensidad relativa de la banda 31 kDa de la fracción de caseinas de leche almacenada a 4 y 7 'C durante 6 dias.
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Iil B4
.M4
Figura 6. Intensidad relativa de la banda 11 kDa de la fracción de caseinas de leche almacenada a 4 y 7 'C durante 6 días.
lación (M7 YA7), que tenía recuentos por encima de 107 ufc/ml después de seis días de almacenamiento.
DISCUSIÓN
Los resultados microbiológicos indican
que es posible almacenar leche hasta por seis
días sin que el recuento de bacterias psicrotróficas alcance el valor crítico de 106 ufc/ml, si
se combina el frío con la limpieza; la sola refrigeración sin adecuadas prácticas higiénicas
resulta insuficiente, tal como lo describen Viejo y Sorhaug (7, 10). Existe una gran diferencia en el crecimiento de este tipo de bacterias
cuando la leche se almacena a 7 °C con relación a cuando se almacena a 4°C, indicando
que el incremento de 3 °C en los tanques de almacenamiento de leche cruda es grave; esta
diferencia es más notoria cuando el recuento
inicial es alto. Cuando no se dispone de frío
suficiente para bajar la temperatura a 4°C, solamente se puede almacenar la leche durante
tres días, pero contando con un recuento inicial menor de 103 ufc/ml.
Los resultados obtenidos muestran que al
almacenar leche con tres niveles de contaminación durante seis días a 4 y 7°C, solamente
el tratamiento B4, con recuento inicial y final
de psicrótrofos de 103 Y 104 ufc/ml respectivamente, no presenta actividad proteolítica, los
demás tratamientos presentan gran actividad
proteolítica sobre la fracción de caseínas siendo mayor a 7 °C que a 4°C, y aumentando la
actividad proteolítica a medida que aumenta el
grado de contaminación.
Mientras que Guerrero (11) encontró moderada actividad proteolítica en leches refrigeradas con recuentos del orden de 107 ufc/ml almacenadas hasta por 3 días a 7°C, en este
estudio se pudo diferenciar la actividad proteolítica que se presenta entre 4 y 7°C, y entre
recuentos iniciales de psicrótrofos de 103 Y 105
ufc/ml, encontrándose que la combinación de
4 °C y recuento inicial máximo de 103 ufc/ml,
permite conservar la leche hasta por seis días
sin que se presente actividad proteolítica sobre
las caseínas de la leche, mientras que con recuentos superiores o temperaturas de 7°C, la
conservación de la leche no sobrepasa los tres
días. La conservación de la leche por más de
tres días sin que se presente deterioro de la calidad podría ser de gran utilidad principalmente en épocas de abundancia, cuando se acumula gran cantidad de leche en los tanques de las
fábricas de lácteos, también permitiría ahorro
en los costos de transporte, al disminuir la frecuencia de la recogida de la leche de los hatos.
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CONCLUSIONES
BIBLIOGRAFÍA
Cuando la leche inicia con recuentos muy
bajos de bacterias psicrotróficas (103 ufc/mI),
con tres días de almacenamiento, no se ven diferencias entre 4 y 7°C, en la actividad proteolítica sobre las caseínas; pero cuando la leche
presenta recuentos medios o altos de bacterias
psicrotróficas (104 o 105 ufc/ml respectivamente), se presenta aumento de la actividad
proteolítica sobre la caseína, siendo mayor a 7
°C que a 4 "C.
Al almacenar leche con tres niveles ascendentes de contaminación durante seis días a 4
y 7°C, se presenta gran actividad proteolítica
sobre la fracción de caseínas siendo mayor a 7
°C que a 4°C, aumentando la actividad proteolítica a medida que aumenta el grado de
contaminación, sugiriendo que existe interacción entre el grado de contaminación con bacterias psicrotróficas y la temperatura de almacenamiento.
Se aprecia mayor actividad proteolítica sobre la fracción de caseínas cuando la leche se
almacena durante seis días que cuando se almacena solamente tres días, principalmente
en los tratamientos con los niveles de contaminación 104 y 105 ufc/ml conservados a 7 -c.
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