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INTRODUCCIÓN
En el primer módulo de la asignatura “Técnicas Experimentales en Bioquímica”
llevaremos a cabo el estudio de una proteína determinada, para ello se realizará el
protocolo de laboratorio habitual para tal fin y que consiste en:
1. Cromatografía en DEAE-celulosa, para purificar la proteína.
2. Medida de la actividad enzimática.
3. Determinación de las proteínas en fracciones, para poder expresar la
actividad.
4. Electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones
desnaturalizantes, para poder calcular el paso molecular del enzima.
5. Estudio fisiológico de la actividad enzimática en su ambiente natural,
es decir, dentro de la célula.
6. Estudio de los parámetros cinéticos ( km y Vmáx), para poder saber
el grado de afinidad con el sustrato y la velocidad a la que actúa el
enzima para transformar el sustrato en producto.
Concretamente el enzima que estudiaremos es la glutamina sintetasa (GS) de la
cianobacteria Synechocystis PCC 6803, que junto con la glutamato sintasa constituyen
el ciclo de la GS-GOGAT, que cataliza la asimilación del amonio en estos
microorganismos.
Para obtener la enzima se parte de cultivos de E.coli que previamente han sido
transformados con un plásmido que contiene el gen que codifica para dicha enzima
(gen A), de esta forma se produce gran cantidad de enzima y su purificación será más
fácil.
A continuación se rompen las células por sonicación para liberar todo su
contenido, se separa después la fracción soluble de la insoluble por centrifugación y se
recoge el sobrenadante, que se guardará a -20ºC para su mejor conservación. Este será e
material de partida de la práctica al que llamaremos extracto crudo (EC).
1
DIA 1:
1. CROMATOGRAFÍA EN DEAE-CELULOSA para purificar la glutamina
sintetasa.
Una vez tomado el sobrenadante resultado de la centrifugación, para purificar la
enzima presente en el extracto crudo de partida se hará una cromatografía en DEAEcelulosa. Obtendremos distintas fracciones de purificación que usaremos en
sucesivos días de prácticas.
Para llevar a cabo el proceso hay que tener en cuenta que nuestra enzima a pH 7
tiene una carga neta negativa debido a su carácter ácido. Por ello utilizaremos una
columna de dietilaminoetilcelulosa, gel cargado positivamente, de modo que al
pasar el extracto crudo por él nuestra enzima quedará retenida y sólo eluyen las que
tengan carga positiva o neutra. Éste proceso se conoce como intercambio aniónico.
Para recuperar las enzimas que quedaron retenidas en la columna se usa un tampón
de KCl, cuyo ión cloruro cargado negativamente compite con la enzima por la unión
a las cargas positivas del gel, liberándose así dichas enzimas.
El procedimiento a seguir será:
1. Descongelar lentamente en hielo puesto que el calor inactiva la enzima.
2. Usar sólo 800 µl para la purificación y guardar el resto.
3. Preparar todos los reactivos según indica el protocolo con cuidado de rotular
bien todos los tubos.
Los reactivos o soluciones que usaremos son los siguientes:
-
100 ml de HEPES 50 mM pH 7
-
10 ml de una solución 50 mM KCl preparada en HEPES 50 mM pH 7
-
10 ml de una solución 100 mM KCl preparada en HEPES 50 mM
-
10 ml de una solución 200 mM KCl preparada en HEPES 50 mM
-
20 ml de una solución 400 mM KCl preparada en HEPES 50 mM
La importancia de que las distintas soluciones que vamos a añadir a la matriz
tengan concentraciones distintas y en orden creciente de KCl es que irá creciendo
también la carga iónica, de modo que cada vez se separará del gel un tipo de proteína en
función de la carga de la solución usada.
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Para la preparación de los reactivos partimos de una solución de KCl 1 M y de
un tampón HEPES 1 M. Usando la fórmula C · V = C´ · V´ llegamos a los siguientes
volúmenes:
Concentración de KCl
Volumen de KCl 1 M
KCl 50 mM
0.5 ml
KCl 100 mM
1 ml
KCl 200 mM
2 ml
KCl 400 mM
8 ml
Éstos se completan hasta obtener el volumen final deseado, 10 ml en las 3
primeras y 20 ml en la última, con el tampón HEPES 50 mM que hemos preparado
previamente con 5 ml de HEPES 1 M y 95 ml de agua destilada.
Preparamos las soluciones en HEPES porque éste mantiene constante la carga
del enzima.
Una vez preparadas las soluciones se procede al montaje de la columna para la
cromatografía, para ello se vierte el DEAE-celulosa desde el tubo a la columna, previa
agitación debido a su gran densidad, se añade 1 ml de HEPES 50 mM al tubo y e vuelve
a volcar en la columna (ésto es para aprovecharlo todo). Éste proceso debe hacerse con
cuidado para que quede bien recta y el frente de avance de las proteínas sea en bandas
homogéneas. Con una pipeta se deja resbalar por la pared tampón para arrastrar el
DEAE y que no quede pegado. Se deja reposar hasta ver la capa superior transparente y
se abre la pinza para que vaya decantando. Cerrar de nuevo cuando quede 1 cm de
tampón por encima del lecho, la matriz nunca debe secarse. El proceso descrito se
conoce como empaquetado de la columna. Tras la decantación se abre de nuevo la
pinza hasta que salga todo el tampón dejando sólo una fina película por encima de la
matriz para que ésta no interfiera en el camino de las proteínas y todas lleguen al mismo
tiempo, teniendo así la misma posibilidad de interaccionar con ella. Cuando se tiene la
columna apunto se carga la columna con 800 µl de extracto crudo previamente
descongelado a temperatura ambiente para que sea homogénea. Esta carga debe hacerse
con la pipeta apoyada en la pared y soltando el contenido muy despacio para no
perturbar la fina capa de tampón. Para que la proteína atraviese toda la columna
hacemos un lavado de la columna con 20 ml de HEPES 50 mM pH 7 y manteniendo la
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pinza abierta, se establecerán así las interacciones entra las proteínas y el DEAE. Estos
20 ml se desechan. Por último, para separar las proteínas que han quedado retenidas en
la matriz y recogerlas aplicamos las soluciones en orden creciente de concentración de
KCl preparadas anteriormente.
El volumen de elución se recogerá en fracciones de 2 ml en tubos de ensayo
numerados que guardaremos en hielo para su mejor conservación. En total se recogen
25 tubos que contienen las fracciones purificadas de las proteínas y con los que
trabajaremos en sucesivos días.
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DÍA 2:
2. MEDIDA DE LA GLUTAMINA SINTETASA (GS).
Una vez tengamos las distintas fracciones purificadas debemos averiguar en cual
de ellas se encuentra nuestra proteína. Puesto que la proteína elegida para nuestras
prácticas es una enzima bastará con medir la actividad enzimática en cada fracción. Para
ello se mide la actividad transferasa que da lugar a γ-glutamil hidroxamato, que en
presencia de cloruro férrico en medio ácido da lugar a un compuesto coloreado. Por
último se mide la absorbancia a 500 nm, longitud de onda a la cual presenta el máximo
de absorción el γ-glutamil hidroxamato. De esta forma se sabrá que fracción purificada
presenta la mayor actividad y por tanto donde se encuentra la GS.
Analizaremos las fracciones 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25 y el extracto crudo,
que servirá como referencia ante una posible pérdida de actividad durante la
purificación.
Necesitaremos preparar un blanco que contenga agua sustituyendo a la muestra,
éste nos servirá para poner a 0 el espectrofotómetro, además de todos los reactivos que
harán posible la reacción.
Preparamos y rotulamos 12 tubos de ensayo en los que pondremos:
825 µl de mezcla de ensayo
la muestra procedente de cada fracción purificada
-
15 µl de muestra + 10 µl de agua para cada fracción recogida
-
3 µl de muestra + 22 µl de agua en el caso del extracto crudo
-
25 µl de agua para el blanco
100 µl de una mezcla de hidroxilamina 1,2 M y NaOH 1,2 M (1:1)
Añadiremos 50 µl de arseniato 0,4 M, para que se inicie la reacción, e
incubaremos 5 minutos a 30ºC. Transcurrido este tiempo pararemos la reacción
añadiendo a cada tubo 2 ml de la mezcla reveladora.
NOTA: En total tenemos un volumen de 3 ml en cada tubo.
Los tubos que contienen actividad de la γ-glutamil hidroxamato se vuelven
coloreados a simple a vista, sin embargo medimos la absorbancia a 500 nm. Aquel que
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dé una absorbancia mayor se corresponderá con la fracción donde ha eluido la GS.
Repetiremos el protocolo con las 2 fracciones anteriores y las 2 posteriores.
Los resultados obtenidos son los siguientes:
Fracción
1
4
7
10
13
16
19
22
A500 nm
0,009
0,003
0
0
0
0
1,118
0,043
25
EC
0,023 1,554
La fracción con mayor actividad es la 19 de modo que analizamos también las
fracciones 17, 18, 20 y 21.
Fracción
17
18
20
21
A500 nm
0
0,002
0,242
0,115
La máxima actividad sigue correspondiendo a la fracción número 19.
Una vez obtenidas las distintas absorbancias de las fracciones podemos calcular
la actividad en cada una de ellas. Para ello hay que tener en cuenta que la actividad
enzimática se define como la cantidad de enzima necesaria para producir un µmol de
producto por minuto y se calcula mediante la Ley de Lambert-Beer:
Absorbancia = ε x [C] x l
Donde:
ε = Coeficiente de extinción molar. Relaciona la absorbancia con la
[proteína]. En el caso de la GS es 0,89 mM-1 x cm-1
[C] = Concentración del producto
l = 1 cm
De aquí nos interesa despejar la concentración del producto que necesitaremos
para calcular la actividad. Debemos tener en cuenta además el tiempo de incubación de
los tubos a 30ºC, el volumen final en cada tubo y el factor de dilución. Todo esto se
condensa en la siguiente ecuación:
U (µmoles/min) = A500 nm / 0,89 mM-1· cm-1· 1 cm x 3ml x 1/5min x 2000µl/15µl (FD)
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Los resultados obtenidos tras los cálculos se muestran en la siguiente tabla:
Fracción
1
4
7 10 13 16
U(µlmol/min) 0,8 0,24 0
0
0
0
18
19
20
21
22
25
EC
0,16 100,48 21,75 10,34 3,87 2,07 279,4
La actividad del extracto crudo se calcularía de igual forma pero teniendo en
cuenta que el factor de dilución (FD) en este caso sería de 800/3 (cargamos la columna
con 0,8 ml de EC y luego tomamos 3 µl de muestra).
Con los datos obtenidos representamos el perfil de elución:
PERFIL DE ELUCIÓN
Actividad (umoles/min)
120
100
80
60
40
20
25
23
21
19
17
15
13
11
9
7
5
3
1
0
Fracciones
La gráfica muestra un pico claro en la fracción 19, por lo que la máxima
actividad GS se encuentra en dicha fracción.
NOTA: De los 25 tubos recogidos los 5 primeros corresponden a la solución de 50 mM
de KCl, los 5 siguientes a la de 100 mM, del 11 al 15 inclusive a la de 200 mM y los 10
últimos a la de 400 mM.
CONCLUSIÓN: Por la fracción en la que encontramos la máxima actividad de la GS
podemos decir que esta proteína eluye cuando tenemos una concentración de KCl de
400 mM. Las cargas negativas del Cl¯ compiten con las de la proteína por unirse a la
matriz, con carga positiva, de tal forma que la proteína, libre, no se retiene y eluye.
7
3. DETERMINACIÓN DE PROTEÍNA EN LAS FRACCIONES.
Para expresar la actividad de la enzima es necesario referirla a la cantidad total
de proteínas que hay en la fracción; y para determinar la cantidad de proteínas que
existe en cada fracción se representa gráficamente la concentración frente a la
absorbancia de una proteína conocida, que en nuestro caso será la ovoalbúmina, es
decir, realizaremos una curva patrón de proteínas.
Mediremos la proteína con el método de Bradford, basado en el cambio de color
que experimenta el azul de Coomassie (contenido en el reactivo de Bradford) cuando
interacciona con la proteína.
Partimos de ovoalbúmina a una concentración de 1 mg/ml, necesitaremos
además agua, reactivo de Bradford y el espectrofotómetro.
Preparamos:
a) 7 tubos con ovoalbúmina en concentraciones de 0, 5, 10, 20, 50, 100 y 150
µg/ml, siendo el volumen total en cada una de ellos de 800µl. Para ello usamos
la fórmula: C · V = C´ · V´. Según los cálculos pondremos en cada tubo:
Ovoalbúmina en
Volumen de
Volumen de agua
concentración…
ovoalbúmina
destilada
(µg/ml)
1mg/ml (µl)
(µl)
1
0
0
800
2
5
4
796
3
10
8
792
4
20
16
784
5
50
40
760
6
100
80
720
7
150
120
680
TUBO
b) 7 tubos con las fracciones 17, 18, 19, 20 y 21 recogidas de la columna y EC
diluido 10 veces. Tras hacer los cálculos:
8
TUBO
Volumen de cada fracción
Volumen de agua (µl)
A
30 µl de F. 17
770
B
30 µl de F. 18
770
C
30 µl de F. 19
770
D
30 µl de F. 20
770
E
30 µl de F. 21
770
EC 1
20 µl de EC 1/10
780
EC 2
40 µl de EC 1/10
760
Una vez tengamos todos los tubos añadimos, tanto a las muestras como a los
patrones (ovoalbúmina), 200 µl de reactivo de Bradford, homogeneizamos rápidamente
e incubamos 15 minutos a temperatura ambiente. Por último medimos la absorbancia a
595 nm. Obtenemos los siguientes datos:
Albúmina
Proteína de estudio
Concentración
A595 nm
Fracción
A595 nm
0
0
17
0,070
5
0,140
18
0,063
10
0,264
19
0,693
20
0,503
20
0,382
50
0,730
21
0,117
100
1,312
EC 1
0,458
150
1,317
EC 2
0,723
Ahora puedo dibujar la curva patrón de la proteína:
Curva patrón de proteína
Absorbancia a 595 nm
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0
20
40
60
80
100
120
140
160
[Ovoalbúm ina] (ug/m l)
9
NOTA: La curva se asemeja a la esperada, pero parece que las absorbancias que
corresponden a las concentraciones de 50 y 150 µg/ml se han quedado un poco cortas.
Según veo en mi cuaderno de prácticas no hemos tenido en cuenta los 200 µl de
reactivo de Bradford, éste cambia el volumen a 1 ml y por tanto varía la concentración.
Sin embargo sólo nos pasa en 2 puntos y debería afectar a todos. De modo que tal vez se
deba a un error experimental a la hora de medir en el espectrofotómetro.
A medida que aumenta la concentración la absorbancia se satura, es decir, sólo
es lineal en un cierto rango. Como la ley de Lambert-Beer sólo se cumple en la zona
lineal, se aplica la línea de regresión en dicha zona y a partir de su ecuación se puede
calcular la concentración de la proteína de cada fracción midiendo la absorbancia .
Utilizo la expresión A595 = m · [proteínas], donde “m” es la pendiente de la recta. Es
muy importante tener en cuenta los factores de dilución a la hora de hacer los cálculos.
En el caso de las fracciones purificadas el factor de dilución (FD) es 33,33 ya
que tomamos 30 µl para llevarlos a 1 ml de volumen final.
Para el EC1 el FD es de 500, pues tomamos 20 µl de EC diluido 1/10 y lo
llevamos a 1 ml.
El FD del EC2 es de 250, fueron 40 µl de EC diluido 10 veces el que llevamos a
1 ml.
Después de hacer los cálculos oportunos tenemos que la concentración de
proteínas en cada fracción purificada es de:
Fracción
17
18
19
20
21
EC1
EC2
[prot]µg/ml
93,32
83,99
923,91
509,28
155,98
9160
7230
NOTA: Como la zona lineal de la curva termina aproximadamente en 0,5 de
absorbancia se usará la concentración de proteínas 9,16 mg/ml que se encuentra en el
EC1, no consideramos el valor de concentración de proteínas del EC2.
Una vez hayamos obtenido las concentraciones las representaremos en la misma
gráfica donde se representó la actividad GS:
10
1000
900
800
700
600
Actividad GS (U)
100
80
60
500
400
300
200
100
0
40
20
25
23
21
19
17
15
13
11
9
7
5
3
1
0
Concentración de proteínas
(ug/ml)
120
Fracciones purificadas
CONCLUSIÓN: Se observa que la mayor concentración de proteínas se encuentra en
la fracción 19 al igual que la máxima actividad GS. Sin embargo no podemos observar
si existen otros picos en otras fracciones que correspondan a otras proteínas que han
eluido con distinta fuerza iónica y que estén presentes en el extracto crudo, pues en
nuestro protocolo experimental incluimos sólo los tubos que estaban en torno al
máximo de actividad y al EC y lo conveniente hubiera sido hacerlo para todos.
Es de esperar que apareciesen otros picos de concentración de proteínas en otras
fracciones, lo cual significaría que el proceso de purificación no es muy selectivo. Esto
es bastante lógico puesto que el método utilizado es el de purificación general para
proteínas con carga negativa.
En todas las purificaciones se deben calcular unos parámetros que nos permitan
seguir la eficiencia de los pasos empleados. Uno de estos parámetros es el rendimiento
en la purificación que hace referencia a la cantidad de enzima a purificar que hemos
recuperado después de un determinado paso de purificación. En nuestro saso
determinaremos la cantidad total de unidades de actividad enzimática que teníamos en
el extracto original de partida y la cantidad total de unidades presentes en las fracciones
que forman el pico de elución de la GS. El cociente entre la actividad de las fracciones y
la presente en el extracto original nos dará el rendimiento de purificación en la
cromatografía de intercambio iónico empleada.
11
Purificación de la Glutamina sintetasa
Actividad
Paso de
Volumen
Actividad
Proteína
específica
Purificación
Rendimiento
purificación
(ml)
total (U)
total (mg)
(U/mg
(nº veces)
AT2/AT1
prot.)
AE2/AE1
EC (1)
0,8
279,4
7,33
38,12
2
100,48
0,74
135,97
Fracción de
máxima
3,57
36 %
actividad
(2)
CÁLCULOS:
I. Extracto crudo:
- Proteína total:
9160 µg/ml · 0,8 ml = 7,33 mg
- Actividad específica:
279,4 U/ 7,33 mg = 38,12 U/mg prot
II. Fracción de máxima actividad:
- Proteína total:
923,91 µg/ml · 0,8 ml = 0,74 mg
- Actividad específica:
100,48 U/ 0,74 mg =135,97 U/mg prot
Purificación (AE2/AE1): 135,97/38,12 = 3,57 veces
Rendimiento (AT2/AT1): 100,48/279,4 = 0,36 => 36 %
CONCLUSIÓN: Lo normal es que siempre se pierda parte de la actividad total en un
laboratorio. Es importante que de una gran cantidad de proteínas vayamos reduciéndola
a la proteína que nos interesa, purificándola, y tendremos entonces más actividad
específica. Rendimiento es la recuperación de un paso de purificación, de modo que alta
recuperación significa que estamos reteniendo actividad total. En cambio, alto grado de
purificación indica que acabamos antes el proceso de purificación. En nuestro caso
parece que se ha conservado poca actividad de la proteína, sólo el 36 % y que la
purificación ha sido bastante rápida.
NOTA: Purificación y rendimiento a veces chocan y hay que decidir cual de ellos
favorecer en función de la proteína y del método usado.
12
DÍA 3:
4.
ELECTROFORESIS EN GELES DE POLIACRILAMIDA EN
CONDICIONES DESNATURALIZANTES.
Esta técnica se emplea para separar proteínas atendiendo a su carga o a su peso
molecular, en este caso se separaran exclusivamente por su peso molecular y no por su
carga, por ello se hace en condiciones desnaturalizantes, para que todas las proteínas
tengan la misma carga.
Esta práctica trata de analizar el perfil electroforético de las proteínas presentes
en el extracto crudo y en la fracción purificada que contiene la GS para compararlas y
estimar la calidad de la purificación ya que si el procedimiento de purificación es el
adecuado, la proteína que se desea purificar irá incrementando progresivamente,
visualizándose una banda más intensa en las tinciones de los sucesivos geles.
Con ayuda de proteínas de peso molecular conocido podremos estimar el peso
molecular de la GS.
NOTA: Hay que tener en cuenta que la GS está formada por 12 subunidades, estas se
separan durante la electroforesis dando lugar a una única banda ya que todas las
subunidades son iguales. Se obtendrá en el proceso el peso de una sola subunidad.
Para desnaturalizar las proteínas se utilizan el SDS (se une un SDS por cada 2
aminoácidos), que rompe las uniones no covalentes, y el mercaptoetanol, que rompe los
puentes disulfuro. El SDS bloquea la carga propia de la proteína; el complejo SDSproteína tendrá una carga neta negativa proporcional a su masa y viajará al polo
positivo, el ánodo, Es decir, separamos las proteínas en función exclusivamente de su
masa, pues todas tienen la misma carga por el tampón Tris-HCl a pH 6,8 y 8,8 que
asegura que esto sea así.
El medio en el que vamos a realizar la electroforesis es un gel de poliacrilamida,
éste es una red tridimensional que se consigue por la polimerización de la acrilamida y
la bisacrilamida, que se entrecruzan formando unos poros por los cuales circulan las
proteínas. El tamaño de estos poros depende de la concentración y de la proporción de
ambos. Con bajas concentraciones de acrilamida tendremos poros grandes y podremos
separar proteínas de alto peso molecular y en cuanto al porcentaje de bisacrilamida,
13
cuanto mayor sea éste mayor será el número de entrecruzamientos y por tanto la trama
del gel más pequeña.
Usaremos 2 geles:
Gel concentrador o stacking (4 % acrilamida), en el que las proteínas
viajan rápidamente.
Gel separador o running (12 % acrilamida), que opone una mayor
resistencia al paso de las proteínas, es el que las separa.
Con este sistema se consigue que todas las muestras añadidas se concentren
sobre la superficie de separación de los 2 geles y empiecen a migrar a la vez.
Las cantidades para la preparación de los geles (pensadas para separar
volúmenes grandes de muestra sin perder resolución) se indican en la siguiente tabla:
STACKING GEL AL 4%
RUNNING GEL AL 12%
Acril/Bisacril (30:0,8 %)
1,3 ml
6 ml
Agua destilada
7,24 ml
6 ml
Tris-HCl 1 M
1,25 ml (pH 6,8)
7,5 ml (pH 8,8)
SDS 10%
100 µl
200 µl
APS 10%
100 µl
200 µl
TEMED
10 µl
20 µl
NOTA: El gel polimerizaba demasiado rápido, probablemente los reactivos estuviesen
menos diluido de lo que debieran, Tuvimos que cambiar las concentraciones de
Acril/Bisacril para corregirlo.
Hay que tener precaución a la hora de preparar los geles puesto que la acrilamida
es muy tóxica, deben usarse guantes para evitar el contacto con la piel.
El APS actúa como catalizador y el TEMED como iniciador de la reacción de
polimerización del gel de poliacrilamida, de modo que se añaden en el último momento.
Antes de preparar los geles deben montarse los equipos de electroforesis.
Consisten en 2 cristales entre los que se insertan unos separadores de 0,8 mm, espesor
que tendrá nuestro gel. Es importante que las caras que vayan a estar en contacto con el
14
gel estén limpias para no alterar la electroforesis. Los cristales se montan en sus
correspondientes soportes.
Una vez montados los equipos, prepararemos la solución del gel separador con
cuidado de no formar burbujas y lo vertemos entre los cristales con ayuda de una pipeta
hasta alcanzar aproximadamente 1 cm por debajo del nivel que será ocupado por el
peine formador de pocillos. Seguidamente pondremos un poco de agua por encima y
dejaremos polimerizar a temperatura ambiente durante 15 minutos. Tras la
polimerización retiramos el agua y vertemos la solución del gel concentrador, que
hemos preparado mientras esperábamos, colocamos el peine en su sitio y dejamos
polimerizar otros 10 minutos. Transcurrido este tiempo podremos retirar el peine y lavar
los pocillos con tampón de electroforesis (SDS 0,1%, Tris 0,025 M/ glicina 0,192 M pH
8,3, como aparece en el protocolo), retiramos así los posible restos de poliacrilamida
que hayan quedado en los pocillos.
Podemos ya proceder a la preparación de las muestras que cargaremos en los
pocillos:
1. EC: 4µl de EC + 8 µl de agua + 4 µl de tampón de carga.
2. Fracción purificada: 12 µl de la fracción + 4 µl de tampón de carga.
El tampón de carga, además del SDS y el mercaptoetanol que desnaturalizan las
proteínas, contiene:
EDTA: agente quelante que elimina los cationes que puedan interferir
con la muestra.
Glicerol: proporciona más densidad a la molécula para bajen hasta el
fondo del pocillo.
Azul de Bromofenol: Tinte que se usa como control, indica cuando se
debe parar la electroforesis.
Las muestras se hierven durante 3 minutos a 100ºC para que desnaturalicen las
proteínas, pinchando previamente el eppendorf con una aguja para que no explote con
la presión, y se pasan rápidamente al hielo para que no renaturalicen. Cargamos 14 µl de
cada uno en un pocillo; en cada gel cargarán 4 grupos dejando una calle para cargar 2 µl
de un patrón de muestra preteñido de pesos moleculares conocidos que permita calcular
el PM de la GS. Este patrón contiene las siguientes proteínas:
15
Proteína
Peso molecular (KDa)
Fosforilasa b
103
BSA
77
Ovoalbúmina
50
Anhidrasa carbónica
34,3
Inhibidor de tripsina
28,8
Lisozima
20,7
Una vez cargadas todas las muestras, se insertan los geles con sus soportes en las
cubetas, se añade el tampón de electroforesis y se desarrolla ésta a un voltaje constante
de 200 V. Paramos la electroforesis antes de que el azul de bromofenol llegue al final,
para que no se escapes las muestras, sacamos los geles de los cristales, eliminamos el
“stacking” y teñimos el “running” durante 24h con una solución de tinción que contiene
azul de Coomassie, metanol y ácido acético. Pasado este tiempo se destiñe el gel
lavando varias veces con la solución desteñidota, formada sólo por el metanol y el
acético, hasta que se vean las bandas claramente. Secamos y fotografiamos.
Para calcular el PM de la GS representaremos en una gráfica el log PM frente a
su coeficiente de reparto (Rf), que es la medida relativa de lo que ha migrado cada
proteína:
Rf = x / d,
donde:
x = distancia reorrida por la proteína en cuestión
d = longitud del gel, en mi caso 8,4 cm
El fin es obtener una recta de regresión y a partir de la ecuación de esa recta
obtener el PM de una subunidad de GS.
Proteína del
PM (KDa)
Log PM
x (cm)
Rf = x / 8,4
1
103
2,01
0,5
0,060
2
77
1,87
1,2
0,143
3
50
1,70
1,7
0,202
4
34,3
1,54
4,4
0,500
5
28,8
1,46
5,7
0,679
6
20,7
1,32
7,4
0,881
patrón
16
2,5
y = -0,7631x + 1,9635
2
log PM
1,5
1
0,5
0
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
Rf
La representación me da la ecuación: y = - 0,7631 x + 1,9635. Además sé que
Log PM (GS) = m · Rf (GS) + n. Tomando los datos en el gel obtengo que la GS tiene
un Rf de 2,4/8,4 = 0,286, por lo que despejando de la fórmula se obtiene:
Log PM (GS) = - 0,7631 · 0,286 + 1,9635 = 1,745 => El PM de una subunidad
de GS es de 55,62 KDa.
PM (GS) = 55,62 KDa x 12 subunidades = 667,47 KDa
CONCLUSIONES:
1. Se ha conseguido purificar la GS ya que en el extracto crudo aparece una serie
de bandas a lo largo de todo el gel , esto indica que hay muchos tipos de
proteínas, mientras que en nuestra fracción purificada hay una banda con el
grosor suficiente que se distingue fácilmente y que corresponde a la GS.
2. Durante la purificación se ha perdido cierta cantidad de GS, ya que la banda en
el EC es más densa que la banda en la fracción purificada.
3. El PM de una subunidad es de 55,62 KDa según mis cálculos, lo cual no se
aleja mucho de la realidad pues el protocolo nos dice que es cercano a 50 KDa.
El PM de la glutamina sintetasa es de 667,47 KDa.
17
5.
ESTIMACIÓN DE LA Km PARA LA HIDROXILAMINA DE LA
ACTIVIDAD GS.
Cuando e está estudiando una enzima hay que conocer sus parámetros cinéticos,
Vmáx y Km, que dan idea del grado de afinidad de la enzima por el sustrato.
La ecuación que relaciona la velocidad de una reacción con la concentración
inicial de sustrato es la ecuación de Michaelis-Menten. Pero se han desarrollado
métodos gráficos que resuelven de forma más precisa estos parámetros cinéticos. Una
de estas representaciones es la de Lineweaver-Burk o representación de dobles
inversos. Se basa en la representación de 1/V frente a 1/[S] resultando una recta de
pendiente Km/Vmáx que corta el eje Y en -1/Km. La principal ventaja que tiene es su
fácil visualización pero tiene como inconveniente que hay que calcular los inversos y
que cualquier error experimental puede llevar a un gran error en la determinación
gráfica.
Se va a estudiar la afinidad de la GS por la hidroxilamina para lo que será
necesario estudiar la velocidad de reacción de la GS en función de los cambios de
concentración de este sustrato. Estos estudios se realizarán in vitro a partir de GS que se
purificó en la columna de DEAE-celulosa y que guardamos a -20ºC.
Preparamos los tubos:
Tubo
Mezcla de
Fracción
Hidroxilamina
Agua destilada
ensayo (µl)
purificada (µl)
(µl)
(µl)
1
825
50
0
75
2
825
50
2
73
3
825
50
4
71
4
825
50
6
69
5
825
50
8
67
6
825
50
10
65
7
825
50
20
55
Blanco
825
50
20
55 + 50
18
Iniciamos la reacción añadiendo 50 µl de Arseniato 0,4 M en todos los tubos
excepto en el blanco en el que se sustituye por agua. Se incuban 5 minutos a 30ºC.
Posteriormente paramos la reacción con 2 ml de mezcla reveladora y por último
medimos la absorbancia a 500 nm.
Obtengo los siguientes valores:
Tubo
1
2
3
4
5
6
7
Blanco
A 500 nm
0,133
0,535
1
1,732
1,942
2,343
0,988
0
NOTA: En el tubo 1 sale una absorbancia positiva cuando debería salir 0, pues no hay
hidroxilamina. Esto podría deberse a la existencia en el blanco de reacciones colaterales
de la GS que se activan sin necesidad de arseniato, es decir que se están midiendo
además otros productos resultados de que la enzima use otros sustratos en ausencia de
hidroxilamina.
Para calcular la concentración de hidroxilamina que se añadió a cada uno de los
tubos (ésta será la concentración de sustrato que se utilizó en cada ensayo) utilizo la
expresión:
[S] = C inicial · V inicial / V final
Tubo 1: [S] = 0
Tubo 2: [S] = 0,6M x 0,002ml/ 1ml = 0,0012M = 1,2 mM
Tubo 3: [S] = 0,6M x 0,004ml/ 1ml = 0,0024M = 2,4 mM
Y así sucesivamente hasta calcular todas las concentraciones deseadas.
NOTA: Parto de una concentración inicial de hidroxilamina de 0,6M porque lo que se
nos proporciona es una mezcla de cloruro de hidroxilamina 1,2 M y NaOH 1,2M
preparada a partes iguales, 1:1.
Conociendo la absorbancia y aplicando la ley de Lambert-Beer se puede calcular
la concentración, y a partir de ésta la velocidad de reacción dividiendo la concentración
por 5 minutos, que fue el tiempo de incubación.
19
[C] = A500 nm / (0,89mM-1 · cm-1 x 1 cm) x 3ml / 0,050ml (FD)
Vreacción = [C]/ 5 minutos
Tras los cálculos obtengo los siguientes resultados:
TUBO
[S] mM
1/ [S]
V (mM/min)
1/ V
1
0
0
1,80
0,555
2
1,2
0,833
7,21
0,139
3
2,4
0,416
13,48
0,074
4
3,6
0,277
23,35
0,043
5
4,8
0,208
26,18
0,038
6
6
0,166
31,59
0,032
7
12
0,083
13,32
0,075
Blanco
12
0,083
0
0
Representación de la velocidad de reacción frente a la concentración de sustrato
en cada tubo.
35
V reacción (mM/min)
30
25
20
15
10
5
0
0
2
4
6
8
10
12
14
Concentración de sustrato (m M)
NOTA: Lo esperado en esta gráfica hubiera sido que partiese de 0 y hubiese ido
aumentando a medida que lo hiciese la concentración de sustrato hasta llegar un
momento en el que la enzima se saturase y la velocidad de la reacción se mantuviese
constante. Si no hubiese llegado ese punto, sino que la velocidad siguiese aumentando,
20
indicaría que las concentraciones añadidas según el protocolo son insuficientes para que
se estabilice la velocidad. Sería conveniente entonces volver a repetir el protocolo con
concentraciones de hidroxilamina mayores. Sin embargo en la gráfica obtenida no se
puede determinar cuál es la Vmáx ni la Km (que correspondería al punto del eje x donde
cortase el valor ½ Vmáx). Parece ser que los 2 últimos puntos son erróneos, podría
deberse a cualquier tipo de error experimental en el laboratorio a la hora de pipetear,
medir absorbancias, etc.
Para resolverlo de forma más precisa se usa la representación de dobles inversos
o de Lineweaver-Burk:
0,2
y = 0,124x + 0,0258
1/V reacción (1/(mM/min))
0,15
0,1
0,05
0
-1,5
-1
-0,5
0
0,5
1
-0,05
-0,1
-0,15
1/[S] (1/m M)
NOTA: No tengo en cuenta el primer punto, se va fuera y altera mucho el resultado de
la recta de regresión.
Los parámetros cinéticos de la hidroxilamina según la representación anterior
serían:
1/Vmáx = punto de corte de la gráfica con el eje de ordenada, y según la
ecuación de la gráfica:
y = 0,124x + 0,0258 => 1/Vmáx = 0,0258 => Vmáx = 38,76mM/min
21
La Km se puede calcular a partir de la pendiente de la recta que es Km/Vmáx =>
=> Km = Pendiente x Vmáx => Km = 0,124 x 38,76 = 4,81 mM
CONCLUSIÓN: Puesto que la Km es la concentración de sustrato a la cual se alcanza
½ Vmáx cuanto menor sea la Km mayor será la afinidad de la enzima por el sustrato,
menos tiempo necesitará para llevar a cabo la reacción. Parece ser que el valor obtenido
de Vmáx es bastante alto y que el de la Km está dentro de lo normal si los comparo con
los de otros compañeros de las prácticas.
Hay que tener en cuenta que a la hora de realizar cualquier experimento en un
laboratorio, para sacar conclusiones acertadas lo conveniente es repetir varias veces el
procedimiento y no una sola vez como es el caso. Apuntar también que al realizar el
método de dobles inversos cualquier error experimental y/o en los cálculos puede llevar
a un gran error en la gráfica.
22
DÍA 4:
6. ESTUDIO FISIOLÓGICO DE LA ACTIVIDAD DE LA GLUTAMINA
SINTETASA DE Synechocystis.
En esta práctica, en lugar del EC usado hasta ahora, trabajaremos con células
vivas de Synechocystis con las que realizaremos un ensayo de la actividad de la GS para
conocer el efecto que tiene sobre la enzima la adición de NH4+ , descrito como inhibidor
de la GS.
Se parte de un cultivo de esta bacteria que ha sido cultivado en esterilidad y en
condiciones de luz, temperatura y aireación adecuadas. Se toman las alícuotas para el
experimento cuando el cultivo se encuentra en fase exponencial (hay una alta densidad
celular). Las alícuotas permitirán determinar la actividad GS en ese momento. A
continuación se le añadirá una determinada concentración de amonio y se seguirán
tomando alícuotas a distintos tiempos para ver su efecto sobre la GS.
En principio se inocula un frasco de cultivo que contiene 500 ml de medio BG 11
con un cultivo stock concentrado de la cianobacteria. Este paso se realiza en una
campana de flujo laminar y bajo la llama del mechero para asegurar la esterilidad. Se
clocarán en una cámara a 30ºC, Bajo una iluminación continua de 25 W·m-2 y
burbujeando con una mezcla de aire y CO2 al 2% para asegurar la fuente de C al cultivo.
Vigilar todos los días que las condiciones del cultivo no hayan cambiado. Cuando el
cultivo esté en fase exponencial se repartirá el cultivo en tubos para todos los grupos,
cada tubo contendrá un volumen de 50 ml. Este tubo ha de mantenerse en las
condiciones de partida.
A partir de aquí se medirán 2 parámetros:
Contenido en clorofila del cultivo al iniciarse el experimento. Este servirá como
criterio de crecimiento y permitirá referir a él la actividad GS.
La actividad GS a distintos tiempos para ver como le afecta el amonio.
A tiempo 0’ tomaremos 3 alícuotas (de 1 ml de cultivo cada una):
1. Para la clorofila: se centrifugará el ml de cultivo a 12000 xg 1
minuto, se eliminará el sobrenadante, se resuspenderá el
sedimento en 1 ml de metanol agitando vigorosamente durante 1
23
minuto y volviendo a centrifugar otros 2 minutos a 12000 xg. Por
último recoger el sobrenadante y medir su absorbancia a 665 nm.
2. Para la actividad GS: se centrifugará a 12000 xg 1 minuto, nos
quedamos con el pellet que congelaremos en N2 líquido durante
unos segundos para preservar la actividad y guardar a -20ºC hasta
que la necesitemos.
3. Para hacer un “blanco” sin NH4Cl.
Posteriormente cada grupo añadirá a su tubo de 50 ml un volumen de NH4Cl
50mM:
-
50 µl los grupos A, B, C y D.
-
100 µl los grupos E, F, G y H.
-
200 µl los grupos J, K, L y M, entre estos el mío.
A los 15, 30, 60 y 90 minutos tomamos una sola alícuota cada vez y procedemos
igual que a tiempo 0’ para la actividad GS. Estas muestras permitirán seguir el efecto
del amonio. A tiempo 120’ se vuelve a coger la muestra por triplicado: una se utilizará
como último punto del ensayo, otra para determinar el contenido en clorofila al final el
experimento y la otra para hacer un “blanco”, esta vez sin arseniato. Con las 3
repetiremos lo que hicimos con su homóloga a tiempo 0’.
Ahora ya podemos ensayar la actividad GS en todas las muestras recogidas y
congeladas en N2 para ello:
1. Descongelar las muestras.
2. Resuspender en 830 µl de mezcla de ensayo para la GS.
3. Añadir 100 µl de la mezcla de cloruro de hidroxilamina:NaOH (1:1).
4. Añadir 20 µl de una solución MTA al 1,25 % en agua y agitar durante
al menos 30 segundos vigorosamente. Con esto se permeabilizarán
las células.
5. Iniciar la reacción añadiendo 50 µl de arseniato 0,4 M
NOTA: Para el blanco (uno de los tubos tomados a los 120 min) haremos un
ensayo paralelo añadiendo agua en lugar de arseniato.
6. Incubar 5 minutos a 30ºC.
7. Parar la reacción añadiendo 2 ml de mezcla reveladora.
8. Medir absorbancia a 500 nm.
24
TUBO
Blanco (sin
0’ GS
15’ GS
30’ GS
60’ GS
90’ GS
120’GS
0,926
0,635
0,469
1,085
1,185
1,144
arseniato)
A500 nm
0,131
Con estos datos podemos calcular la actividad GS a cada tiempo ensayado:
Actividad (µmoles/min) = A500 nm/ 0,89 mM-1· cm-1 · 1cm x 1/5 min x 3 ml x
X 50 ml/1 ml (FD)
Tiempo
0’
15’
30’
60’
90’
120’
U (µmol/min)
31,21
21,41
15,80
36,57
39,94
38,56
En cuanto a la clorofila:
Tiempo
0’
120’
A665 nm
0,260
0,310
Para calcular la concentración de clorofila hay que tener en cuenta que el
coeficiente de extinción molar para la clorofila en metanol es de 74,46 mM-1· cm-1 .
[clorofila] = A665 nm/ 74,46 mM-1· cm-1
Tiempo 0’ => U = 0,260/74,46 x 50 = 0,18 mM
Tiempo 120’ => U = 0,310/74,46 x 50 = 0,21 mM
A partir de los datos obtenidos de la concentración de clorofila podemos hacer
una representación gráfica y determinar el contenido en cada uno de los tiempos
ensayados.
25
Concentración de clorofila (mM)
0,215
0,21
y = 0,0003x + 0,18
0,205
0,2
0,195
0,19
0,185
0,18
0,175
0
20
40
60
80
100
120
140
Tiem po (m in)
A partir de la ecuación de la recta que me da el programa puedo calcular la
concentración de clorofila en cada tiempo.
Ej. Tiempo 15’ => y = 0,0003 · 15 + 0,18 = 0,1845.
Haciendo todos los cálculos:
Tiempo
0’
15’
30’
60’
90’
120’
[clorofila]
0,18
0,1845
0,189
0,198
0,207
0,216
(mM)
Una vez determinado el contenido en clorofila en cada momento, podemos
representar la actividad en cada uno de los tiempos referida al contenido de clorofila.
Para ello es conveniente calcular en cada caso la actividad específica, que sería:
Actividad específica = AT/ µmol de clorofila
Alícuotas
AT (µmol/min)
AE (µmol·min-1/µmol de
clorofila)
0’
31,21
173,39
15’
21,41
116,04
30’
15,80
83,60
60’
36,57
184,70
90’
39,94
192,95
120’
38,56
178,52
26
A partir de estos datos representamos la actividad específica frente al tiempo de
Actividad específica (U/umoles de
clorofila)
ensayo:
250
200
150
100
50
0
0
20
40
60
80
100
120
140
Tiem po (m in)
CONCLUSIONES: Para la concentración de clorofila antes y después de exponer el
cultivo al amonio (200 µl) los valores obtenidos indican que el cambio es muy poco, de
0,18 mM a 0,216 mM.
En cuanto a la actividad GS referida al contenido de clorofila, se observa en un
principio una caída de la actividad que pasado un tiempo de ensayo vuelve a recuperarse
de forma general, a pesar de que en la última parte de la gráfica comienza de nuevo a
bajar. Este descenso y posterior ascenso concuerda con lo esperado. Al añadir mucho
amonio la célula lo metaboliza y produce mucha glutamina que resulta tóxica para la
célula (por encima de 0,5 mM). En estas condiciones el amonio modifica a la GS, la
inhibe, y el amonio es degradado por otra vía (y por la propia GS, pues la actividad no
se hace 0). Cuando los niveles de amonio vuelven a ser los adecuados se recupera la
actividad normal de la GS, de ahí la forma de la gráfica. Cuanto más amonio se añada,
más tiempo se mantiene inhibida la GS y por tanto más tardará el cultivo en recuperarse.
En la práctica sólo se pusieron en común los valores a tiempo 30’ en la mitad de
los grupos, éstos son pocos datos para poder obtener alguna conclusión fiable; no
hubiese estado de más haberlo hecho con todos los tiempos y todos los grupos. Así
podríamos hacer la media de las absorbancias obtenidas para 50, 100 y 200 µl y con los
cálculos necesarios representar las 3 actividades de forma conjunta lo cual resultaría
muy ilustrativo.
27
Los ensayos in vivo dan bastantes problemas debido a la diversidad de los
resultados, por lo que hay que repetir mucho las pruebas para poder confirmar algo,
además siempre se debe hacer un cultivo control de ensayo que se tomará como blanco
de la reacción.
28