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ESTUDIO DE LOS GENES DE RESISTENCIA EN PLANTAS
CONTRA OOMICETOS PATÓGENOS
Jaraleño Teniente Jocelyn - Instituto Tecnológico de Roque;
Vega Arreguín Julio César - Departamento de Ciencias Agrogenómicas,
ENES-UNAM Unidad León.
RESUMEN
Ante la presencia de un
patógeno las plantas
activan
mecanismos de defensa capaces de
reconocerlo y de evitar la colonización
de sus tejidos mediante procesos
moleculares de resistencia complejos
y efectivos. Por su parte, para
iniciar una infección, el patógeno
debe ser capaz de manipular estos
mecanismos de defensa de la planta
para favorecer su crecimiento y
reproducción. Entender los modelos de
interacción planta-patógeno resulta
indispensable para generar eficientes
sistemas de manejo en cultivos
atacados por estas plagas.
En este contexto, el estudio que a
continuación
se
presenta
está
orientado en el análisis de las regiones
genómicas que confieren resistencia
hacia
el
oomiceto
patógeno
Phytophthora capsici. Se caracterizaron
19 líneas de Nicotiana tabacum
transformadas con una construcción de
RNAi (NtI2hp) para silenciar los genes
I2/R3a. Este estudio incluyó el uso de
herramientas de biología molecular,
genómica y fitopatología.
INTRODUCCIÓN
Las plantas están expuestas
constantemente a una gran variedad
de microorganismos, los cuales pueden
ser benéficos o adversos. Éstos
pueden causar enfermedades en las
plantas y problemas severos en
diversos cultivos agrícolas. Por ello,
entender los modelos de interacción
planta-patógeno resulta indispensable
para generar eficientes sistemas de
manejo en cultivos que normalmente
son atacados por plagas. (Díaz, 2009)
Los procesos de patogénesis se
llevan a cabo normalmente con la
secreción de una cantidad cuantiosa
y diversa de factores de virulencia por
parte del patógeno, los cuales actúan
sobre otras moléculas de la planta
tanto fuera como dentro de la célula
para contrarrestar sus defensas.
(Kamoun, 2006)
El oomiceto Phytophthora capsici, es
causante
de
grandes
pérdidas
económicas anuales
alrededor del
mundo, debido al daño que produce en
la pudrición de raíces, tallos y frutos,
afectando
principalmente
diversos
cultivos de solanáceas y cucurbitáceas
(Sevillano, 2015). P. capsici, además
de ser un patógeno de considerable
importancia económica es relevante
también en el área científica, ya que
afecta una amplia variedad de cultivos
vegetales,
además
de
poseer
características útiles para conocer la
biología del género Phytophthora, por
ejemplo:
 Tiene un crecimiento rápido
 Esporulación abundante.
 Es capaz de reproducirse
sexual y asexualmente.
 Produce una gran diversidad de
progenie. (Lamour, 2012).
Fig. 1 Micrografía a 40x de micelio y esporangios
de P. capsici
N. tabacum es resistente a P. capsici
mientras otras especies de Nicotiana
muestran
diferentes
niveles
de
susceptibilidad y/o resistencia, por lo
que permiten estudiar en el laboratorio
los procesos moleculares que ocurren
en cada interacción con el patógeno
(Vega-Arreguín, 2014). El género
Nicotiana es similar a ciertas plantas de
cultivos que pertenecen a la misma
8to. Verano Estatal de Investigación
CONSEJO DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA DEL ESTADO DE GUANAJUATO
ESTUDIO DE LOS GENES DE RESISTENCIA EN PLANTAS
CONTRA OOMICETOS PATÓGENOS
Jaraleño Teniente Jocelyn - Instituto Tecnológico de Roque;
Vega Arreguín Julio César - Departamento de Ciencias Agrogenómicas,
ENES-UNAM Unidad León.
familia de las solanáceas, su ciclo de
vida es relativamente corto, además
de
ser
fácil
de
transformar
genéticamente.
OBJETIVO
Caracterización de una familia
de genes de resistencia contra P.
capsici en N. tabacum.
Objetivos Específicos
 Evaluación de varias líneas de
N. tabacum transformadas con
una construcción de RNAi.
 Análisis de los niveles de
expresión de los genes de
resistencia
silenciados
por
RNAi.
 Amplificación por PCR de un
gen de resistencia candidato.
MATERIALES Y MÉTODOS
Se utilizó N. tabacum como
sistema de estudio para ayudar a
descifrar
los
mecanismos
de
resistencia entre esta planta y P.
capsici, por ser considerada una planta
modelo de laboratorio para el estudio
de las interacciones planta-patógeno.
Germinación de semillas de Nicotiana
tabacum (NtI2hp)
La germinación de las plantas de N.
tabacum se realizó en charolas de
germinación de 24 pocillos. Se agregó
agua y sustrato en cada pocillo en una
proporción de 3:1 de sunshine:
vermiculita. Se plantaron entre 10-15
semillas de N. tabacum (NtI2hp) por
pocillo. Se cubrieron con un domo y se
incubaron
en
una
cámara
de
crecimiento de plantas, con fotoperiodo
de 16 horas de luz y 8 horas de
oscuridad a 28°C.
Crecimiento y producción de zoosporas
de P. capsici
Bajo condiciones estériles en campana
de flujo laminar, se inoculó P.capsici
(proveniente de INIFAP-Celaya) en
placas Petri con agar V8, y se
incubaron en un cuarto oscuro a 26°C.
Se indujeron zoosporas de P. capsici
agregando 8 mL de agua destilada
estéril y exponiendo durante 3 días
continuos a luz fluorescente a 26°C.
Después las placas se colocaron a 4°C
durante
30-60
minutos
y
se
cuantificaron las zoosporas con un
hemacitómetro y microscopio óptico
(Fig. 1); finalmente, las zoosporas
fueron utilizadas para confirmación de
la especie del patógeno y para inocular
las líneas de N. tabacum.
Extracción de DNA genómico (DNAg)
de N. tabacum
Se utilizaron 21 muestras las cuales
representan 19 líneas de N. tabacum
(NtI2hp) y 2 silvestres (WT) como
control. El DNA se extrajo de hojas
colectadas previamente y mantenidas
en tubos eppendorf a -80°C. Se
trituraron las hojas en mortero con la
ayuda de un pistilo y N2 líquido hasta
quedar en polvo y se adicionaron
inmediatamente 200 μL de buffer de
extracción (Tris-HCl 200 mM, EDTA 25
mM, SDS 0.5%). Se continuó triturando
y se terminó por agregar 300 μL de
buffer, se invirtió la mezcla al menos 5
veces y se dejó reposar durante 5
minutos. Posteriormente, la mezcla fue
centrifugada a 13000 rpm durante 20
minutos a 4°C, y se transfirió el
sobrenadante a un nuevo tubo
eppendorf de 1.5 mL: A continuación,
se añadió 500 μL de isopropanol, se
mezcló la reacción y nuevamente se
centrifugó a 10000 rpm por 10 minutos.
Se eliminó el isopropanol y se dejó
secar la pastilla de DNAg obtenida,
dejando el tubo abierto sobre la
campana de flujo laminar. Una vez que
la pastilla quedó completamente seca,
se adicionaron 50 μL de Buffer TE (Tris
10 mM, pH 7.5, EDTA 1 mM) y 1 μL de
RNAse. Finalmente se guardó el DNAg
obtenido a -20°C.
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Electroforesis para confirmar la
presencia de DNAg
Se preparó el gel de agarosa al 1%; se
dejó enfriar hasta que alcanzó una
temperatura aproximada de 50°C, y se
agregó 4 μL de colorante SYBR R Safe
DNA Gelstain. Se introdujo en la
cámara de electroforesis la cual se
inundó con TAE 1X. Se cargaron 4 μL
de marcador de peso molecular de 100
pb en el primer carril y en los siguientes
pocillos se cargaron las muestras de
DNAg extraído, para ello se mezclaron
4 μL de muestra de DNAg y 1 μL de
buffer de carga 5X. Se conectó a la
fuente de poder a 90 volts, 400 mA
durante 30 minutos. Pasados los 30
minutos se analizó la muestra en el
fotodocumentador
mediante
el
programa Carestream MI SE.
Infección de N. tabacum con el
patógeno
Después de inducción y cuantificación
de zoosporas, estas se transfirieron a
un vaso de precipitados y se agregó
1mL a 5 líneas de N. tabacum (NtI2hp)
representativas, a una WT además de
una muestra de N. benthamiana
(susceptible). Se cubrieron con un
domo para propiciar la humedad
necesaria para el ataque del patógeno
y se incubaron en cámara de
crecimiento.
Fig. 3 Resultados extracción de DNAg de líneas de N.
tabacum y Wild Type
Por otra parte se presentan de la
misma forma el resultado del análisis
de la extracción del ARN de 5 líneas de
N. tabacum (NtI2hp) y WT (Fig. 4).
Fig. 4 Análisis de extracción de RNA de N. tabacum.
Así mismo, en la figura 5 se muestra un
experimento preliminar de la infección
de las líneas de N. tabacum con P.
capsici.
RESULTADOS
Extracción y detección de DNAg
Se muestran los resultados de análisis
de electroforesis después de la
extracción de DNA genómico de N.
tabacum (Fig. 2 y 3).
Fig. 2 Resultados de la extracción de DNAg
obtenidos de 13 líneas consecutivas de N. tabacum
Finalmente, el análisis de las líneas
transformadas NtI2hp mediante PCR
muestra que casi todas las líneas
contienen la construcción integrada en
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su DNA genómico, de acuerdo a los
resultados de PCR de estas líneas (Fig.
7).
Fig. 7. Resultados del PCR para amplificar regiones
especificas de la construcción RNAi en la líneas de
N. tabacum.
CONCLUSIONES Y DISCUSIÓN
Al término de la estancia de
verano se obtuvieron resultados sobre
la presencia de la construcción de
RNAi utilizada para transformar las
plantas de N. tabacum y que produciría
el silenciamiento de los genes de
resistencia I2/R3a en estas plantas.
Estos análisis se hicieron mediante
experimentos de PCR para amplificar
regiones especificas de la construcción
de RNAi. Como se muestra en los
resultados, la mayoría de las líneas
transformadas
amplificaron
un
fragmento que corresponde al tamaño
esperado de DNA. Estos resultados se
correlacionarán con los datos que
existen en el laboratorio sobre
resistencia de estas líneas hacia el
patógeno P. capsici.
Es importante mencionar que
en el transcurso de la estancia también
se llevo a cabo la introducción y
utilización de nuevas cepas del
patógeno P. capsici, por lo que se
llevaron
a
cabo
análisis
para
caracterizarlas
y
comprobar
su
potencial de producción de zoosporas
para futuros experimentos de infección.
Se utilizaron aquí de forma preliminar
para infectar las líneas transformadas y
observar su capacidad de resistencia,
sin embargo, estos resultados no
fueron conclusivos. En 5 de las líneas
silenciadas la infección se llevó a cabo,
pero la presencia de daños en las
plantas fue diferente en cada pocillo,
esto puede deberse a la cantidad de
plantas que había por pocillo, al nivel
de expresión de genes o a la edad
fenológica a la que fueron inoculadas.
Considero que es necesario continuar
con los análisis de patogenicidad de las
cepas de P capsici recién introducidas
al laboratorio. Otros experimentos
futuros incluyen la determinación del
nivel de expresión de los genes I2/R3a
en las líneas silenciadas y, la clonación
del gen responsable de la resistencia
en tabaco hacia P. capsici.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Díaz, L. N. (2009). Interacciones
moleculares
entre
plantas
y
microorganismos: saponinas como
defensas químicas de las plantas y su
tolerancia al los microorganismos.
Revista de estudios transdisciplinarios ,
32-55.
Kamoun, S. (2006). A catalogue of the
effector secretome of plant pathogenic
oomycetes. Ann. Rev. Phytopathology ,
41-60.
Lamour, K. (2012). The oomycete
broad-host-range
pathogen
Phytophthora capsici. Molecular plant
pathology , 329-337.
Sevillano, J. (2015). Estudio de los
mecanismos
moleculares
de
resistencia en plantas modelo hacia
patógenos del género Phytophthora.
Guanajuato, México.
Vega Arreguín, J. C. (2014).
Recognition of Avr3a Homologue Plays
a major role in mediataing nonhost
resistance to Phytopthora capsici in
Nicotiana species. 770-780.
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