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UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDESTE
Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2000
Actividad proteolítica de restos
del fruto de Carica papaya
Glibota, Gustavo S. - Garro, Oscar A. - Judis, María A.
Facultad de Agroindustrias - UNNE.
Cte. Fernández 755 - (3700) Pcia. R. S. Peña - Chaco - Argentina.
Tel./Fax: +54 (03732) 420137 - E-mail: [email protected]
ANTECEDENTES
Las plantas son una fuente tradicional de un gran número de enzimas para distintos usos a nivel mundial. Del
látex producido por la papaya, higuera, piña y en menor medida de otras especies vegetales y granos, se han
aislado, principalmente, cistein-proteinasas (proteasas), amilasas, lipasas, etc. (Chwimmer,S 1954, Moreno J,
1997).
La Carica papaya es un vegetal totalmente adaptado a nuestra zona, su rápido crecimiento y la cantidad de
aplicaciones posibles que tienen los productos obtenidos del mismo promueven un estudio detallado de los
compuestos exudados presentes en el mismo.
La adaptación de este vegetal a nuestra zona, y su aprovechamiento completo tanto de los frutos frescos, en la
elaboración de dulces regionales y la extracción del látex exudado podrían dar una mayor actividad a la
región, siendo que actualmente no se esta explotando este cultivo, el cual no requiere de grandes cuidados y
puede ser rentable por el valor que se puede conseguir a los productos derivados del aprovechamiento
integral del mismo.
El uso de las proteasas es bien conocido siendo algunos de ellos en proteínas modificadas, tiernizador de
carnes, industria de la cerveza y en farmacia, entre otros. (Barahona, 1983; Hebert.J.P, 1978. Ruggeiro, 1988).
La principal enzima usada en estos casos es la papaína y su mercado es tanto interno como externo y además
no se ha logrado producir otro producto de similares características que puedan competir en el mercado (TJP
Market Development, 1996).
El mercado mundial de la papaína se encuentra en miles de toneladas, siendo el movimiento de divisas en
varios cientos de millones de dólares. Actualmente el mercado se encuentra en expansión.
Con vistas al desarrollo de productos regionales (producción de dulces), en la cual se utiliza el fruto fresco y
antes de su madurez total, donde se tiene el máximo tamaño, y la mayor producción de enzimas proteolíticas
cuando todavía su coloración es verdes. Se planteó el aprovechamiento integral de los restos del fruto
(cascara y semillas), a través de la extracción de las enzimas presentes en los mismos.
Existen referencias al aprovechamiento industrial de bromelina a través de restos de ananás (Ramos,I; 1996),
lo cual se realiza bajo dos procesos industriales alternativos: Compresión de los restos, hasta obtener un jugo
conteniendo actividad proteolítica (Balls et al. 1941) o por extracción con buffer fosfato de potasio a un Ph
entre 5.5 y 7..5 (Apte et al. Tisseau 1976). La estrategia de estos procesos continua con las siguientes
operaciones: filtración, precipitación con solvente orgánico o sulfato de amonio y purificación por
cromatografía en sephadex (Apte et al. Tisseau 1977).
• Objetivos:
Establecer parámetros indicativos para el aprovechamiento integral en la industrialización del frutos de
Carica papaya con respecto al uso de los restos no utilizados
MATERIALES Y METODOS
Materiales: Se utilizaron restos de frutos de plantas de Carica papaya, que son cultivadas en jardines y quintas
de Pcia. R. Sáenz Peña. El tamaño de frutos que se usaron para extraer la enzima fue el de máximo
crecimiento antes de su maduración (teniendo todavía su coloración verde). El diámetro medio de los frutos
trabajados osciló entre 6 y 10 cm.
Extracción: Para la extracción de la enzima desde la cascara se realizó un descortezado, obteniendo un pellet
de 1 a 2 mm. de espesor. Se trituró para favorecer la extracción con buffer.
De forma similar a la anterior se realizó con la semilla el mismo proceso de extracción.
La extracción se realizó con buffer fosfato ( Na2HPO4-Ac cítrico) 0.05 N a Ph.7.0.
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Medición de proteínas: La muestra se filtró y el sobrenadante se centrifugó a 3000 g. Todo este proceso se
realizó a 25 grados.
Se utilizó etanol 96° para la precipitación de proteínas en una concentración de 2/3 v/v.
La cantidad de sustancia seca obtenida se determinó por peso seco constante en estufa a 100 °C.
La cantidad de proteína obtenida se midió por espectrofotometría ultra violeta a 280 nm. utilizando un
espectrofotómetro BECHMAN.
Para calcular la cantidad de proteínas se utilizó la siguiente formula mg proteína/ml = A280 nm • 0.4 (Balls,
1939).
Medición de la actividad enzimática:
Se usaron dos técnicas para la medición de la actividad.
Se utilizó como método patrón para evaluar la papaina (sigma) cuya actividad se tomo de referencia la
hidrólisis de un sustrato sintético BAEE (Nα-Benzoil-L-arginina Etil éster Hidroclorídrico Método
titulométrico (Shwert and Tanaka 1955)
Procedimiento: La reacción es monitoreada manteniendo el Ph en 6.2 a 25°C en un recipiente conteniendo
5ml de solución con el sustrato, 5ml de sol. 3M NaCl , 5ml de buffer activador, agregando a esto 0.1ml de
enzima en solución.
Se registra los µl agregados del titulante (NaOH 0.01-0.02 N) por minuto para mantener el PH constante.
Se calcula de la siguiente manera: unidad/mg = ml de base adicionada/min • normalidad • 1000
mg de enzima agregado
Una unidad hidroliza un micromol de baee por minuto a 25°C y Ph 6.2.
Enzima de referencia: Se utilizó papaína cruda SIGMA secada al sol con actividad 1,7 u. BAEE por mg. De
acuerdo alas especificaciones de SIGMA.
Como método de seguimiento de actividad de los restos de frutos se utilizó BAPA (N-Benzoil-L-arginina pnitroanilina) Método colorimétrico (Erlanger et al. 1961, Kakade 1969).
Método: La reacción es monitoreada manteniendo 40°C en un tubo conteniendo 3ml de solución del sustrato,
3ml de solución de enzima preparada con buffer fosfato- ácido. cítrico Ph 7.
La hidrólisis del sustrato genera un producto cromóforo.
Se registra el cambio de absorvancia por minuto. (unidades de absorvancia/min).
Preservación de la actividad proteolítica: Se probó la conservación de las enzimas de tres maneras diferentes
Sobre la misma cascara como soporte, secada esta misma en estufa a 40°C. Siguiendo la actividad durante su
deshidratación.
En solución buffer con y sin purificar con alcohol, almacenada a 4°C.
En solución buffer con y sin purificar con alcohol, almacenada a freezer a -18°C.
En estos dos últimos el seguimiento fue diario hasta una perdida del 15 %.
DISCUSION DE RESULTADOS
Materiales: De acuerdo al análisis de los frutos con distintos diámetros (6 - 10 cm) se comprobó que los
restos (frutos sin el mesocarpio) de Carica papaya constituyen entre el 18 a 28% del total, siendo el porcentaje
mayor para los de menor diámetro. La proporción entre cáscara y semillas fue de 1: 1 y no se observó
variación apreciable de esta última en el rango de tamaños elegidos.
Extracción: Durante la extracción de la enzima desde los restos con buffer fosfato ( Na2HPO4-Ac cítrico) 0.05
N, no se observó variación en la cantidad extraída entre el Ph. 5. 5 y 7. 5, por lo que todos los muestreos se
realizaron a Ph.7.0.
Medición de proteínas:
Se realizó una curva de calibración para determinar la relación de proteínas en función de la concentración de
látex seco (sigma). Gráfico 1.
La cantidad de sustancia seca extraída con buffer de los restos de frutos (cascara y semillas) fue cercana al 2%
de la cantidad de restos para la extracción ( 10 mg de sustancia seca / gr. de restos frescos).
La cantidad de proteína medida a 280nm. fue de 5mg de proteína/ gr. de restos.
Medición de la actividad enzimática:
Como primera medida se verificó la actividad de la papaina de referencia con el método del BAEE
construyéndose la gráfica 2. La actividad real calculada fue de 1.73 u. baee.
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Con la enzima de referencia se trazó una curva que representa las actividades medidas con el método
colorimétrico a distintas concentraciones de látex seco. Se comprobó la linealidad de la respuesta en ese rango
de concentraciones. Gráfica 3
Se determinó la relación entre las unidades de los dos métodos de evaluación de actividad. Se calculó la
equivalencia de unidades de actividad en: 0.01 unidad absorvancia/min = 34000 unidades BAEE.
Se comprobó que la actividad enzimática relativa por peso unitario fresco fue similar tanto en las semilla
como en la cáscara.
Se verificó que la actividad proteolítica de los restos antes de la precipitación con etanol fue cercana a los 65
unidades BAEE/ gr. de restos frescos. Gráfica 4
Método titrimétrico (BAEE)- Medicion de
actividad en la papaina de referencia
50
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
tiempo (min)
absorvancia
Ajuste del método de medicion de
concentración de proteínas
y = 0,0314x
2
R = 0,9893
40
30
20
y = 0,1116x
2
R = 0,9977
10
0
0
20
40
0
concentracion (gr)
200
400
Gráfico 1.
Gráfico 2.
Abs
Valoración de la actividad de enzimas extraidas con
buffer de desechos del fruto ( concentración 10g/100ml)
Gráfico 3.
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
y = 0.0019x
R2 = 0.9909
0
30
90
150
Tiempo (min)
actividad (unid.
absorvancia/min)
Método colorimétrico (BAPA) -Curva calibración actividad vs.
concentración
Gráfico 4.
0,0015
0,001 y = 0,0005x
R2 = 0,9932
0,0005
0
0
0,5
600
NaOH agregado en microlitros
1
1,5
2
2,5
concentración (gr) de papaina de referencia
3
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Preservación de la actividad:
Se evidenció que los restos secados en estufa a 40°C perdían prácticamente toda su actividad al cabo de 1
hora.
Se probó que la actividad de la enzima disuelta en el buffer junto con los restos se conservó estable durante 3
días a 4°C, notándose una disminución menor de un 15%.
También se verificó que la actividad enzimática a una temperatura de -18°C de conservación, la perdida de
un 15% se producía a tiempos mayores de 7 días.
Se observó que la enzima precipitada con etanol previa separación de los restos por filtración en bajo las
mismas condiciones anteriores sufrió similar porcentaje de perdida de actividad.
CONCLUSIONES
La utilización de restos de frutos no aprovechados en la industrialización de dulces, podrían emplearse para la
obtención de enzimas proteolíticas.
La generación de hidrolizados proteicos se podría hacer utilizando in situ los restos (Bello,R. 1993) o bien
extrayendo la enzima a través de un proceso tecnológico como el siguiente.
La cantidad de látex seco por tonelada de fruto obtenida por este proceso estaría en los 2.5 kg.
La actividad especifica enzimática obtenida en este proceso antes de las operaciones de precipitación y secado
es relativamente alta, por lo cual sería interesante estudiar estas operaciones y las condiciones para mantener
esta actividad con el menor porcentaje de perdida posible.
Sería interesante hacer un estudio mas detallado del proceso tanto económico como tecnológico.
BIBLIOGRAFIA CONSULTADA
• ACE AIC Market Briefs: papain http/ market brief/papain
• Apte, P. V, G.S. Kaklij, and M.r. Heble. 1979 Proteolytic enzymes (bromelains) in tissue cultures of
ananas sativus. Plant S
• Balls, A.K, Thompson,R.R and Kies,M.W, Bromelin- properties and commercial production, Industrial
and engineering chemistry, july, 1941, 950-953.
• Barahona, julio Proyecto de Producción de fruta y látex de papaya (estudio de prefactibilidad). Honduras
1983.
• Bello R, Cardillo E, Martinez R. Effects of the adition of tropical fruits pineaples (Ananás comosus) and
papaya (Caricapapaya) on the production of biological silage from fish. Arch Latinoam nutr. 1993 sept,
43(3) 228-233.
• Chwimmer,S 1954, Industrial production and utilization of enzimes from flowering plant
• Cipollo K.L, Wagner T.J, Process for manufactring a Hidrolised vegetable protein isolate ans its use in
beverages and other foodstuffs, European Patent, 1987.
• Gianelli et al. (1997). Utilización de enzimas proteolíticas extraidas de kiwi, en la elaboración de queso
tipo fresco. X Seminario latinoamericano y del Caribe de ciencia y tecnología de alimentos. 1997. Bs. As
• Lassoudiere,A. La papaine (production, propietes utilisation.) Fruit vol 21 nro 11 12 1969.
• Ortiz,A.and Cooke The storage and drying characteristcs of papaya (Carica papaya L.) Latex.. J.Sci. Food
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• Ramos y M. Miranda. Producao Industrial de Bromelina a partir de Restos de Ananás.. Bromo.htm en
www.fe.up.pt. (review)
• Rugeiro C. 1988 Mamao. Editorial Univ. Pernanbuco.
• Tisseau,R, 1976 Protolytic activity of pineaple used for canning and its waste products, Fruits, 31(6) 373378.
• Tisseau,R, 1977 Protolytic activity of pineaple used for canning and its waste products. A simplified
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