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Aplicación de los Marcadores
moleculares en el área pecuaria:
avances, retos y perspectivas
Dra. Ana M. Sifuentes Rincón
Lab. de Biotecnología Animal
Centro de Biotecnología Genómica-IPN
¿Qué es la Biotecnología?
Combinar los organismos vivos
o partes de éstos con tecnología
para producir o mejorar
productos.
El desarrollo de bienestar y
servicios a partir del
conocimiento de los
genomas
Aplicaciones de la Biotecnología Animal
- Mejoramiento Genetico Asistido por marcadores
- Desarrollo de Animales transgenicos para:
*Mejorar la productividad de los animales
*Aplicaciones medicas para, producir proteinas
valiosas en la leche, sangre u orina de los animales.
*Desarrollar modelos animales de enfermedades
del humano
¿Porqué DNA?
•
•
•
Prácticas: Hacerlas mejor
Productos: Usar herramientas y
tecnologías nuevas e innovadoras
Genética: Incrementar los rasgos deseados
en plantas y animales
Food Economics and Consumer Choice (Jeff Simmons, 2008)
La Genómica en los animales de importancia pecuaria
 La industria pecuaria representa del 30–40% de las actividades agropecuarias
 Los animales de granja representan una de las principales fuentes de proteina en
la dieta de los humanos
 Desde el 2005 se iniciaron diferentes proyectos de secuenciación de los genomas de
los principales animales de granja que incluyen a los cerdos, bovinos, ovejas y pollos
Estrategias para el Mejoramiento
Genético
Objetivos
de Selección
Apareamientos
Tecnologías
moleculares
Selección
Bioinformática
Registros
(Gen. y Prod).
Mejoramiento
Animal
Estructura
de
Población
Estimación
de Parám.
EPD’s
Técnicas
Reproductivas
Kinghorn, B.P., Van der Werf, J. and Ryan, M. 2000
¿Qué es un genoma?
• El término “genoma” se usa para denotar la
totalidad de genes y cromosomas que se
encuentran en el núcleo de una célula .
Análisis de genomas de especies
Uno de los principales objetivos del análisis de
los genomas de especies de interés pecuario es
encontrar aquellas variaciones en la secuencia
de ADN que explique los cambios fenotípicos.
El genoma del bovino
Tipos de variación en la secuencia de
DNA
- Diferencias en el número de copias de secuencias repetitivas
Secuencias de DNA repetido en tandem:
DNA minisatélite (VNTRs)
Microsatélites (repeticiónes cortas de di-,tri-, tetranucleotidos)
- Inserciónes/Deleciones
- Polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs)
MARCADORES DE ADN
Es una región especifica del DNA donde se han
encontrado
variaciones que se asocian con efectos
positivos o negativos en una característica de interés.
4751
316
Variantes alélicas o
génicas
A G A A T C T G A A T.T G A A C A C T C
A G A A T G T G A A T.T G A A C A T T C
316 G C
| |
T C
4751
316 G C
| |
T C
4751
Dura
suave
dura
suave
Pruebas de ADN
Es un análisis en el que por medio
de marcadores de ADN se determina
en un animal , de cual o cuales
variantes génicas es portador
Diagnóstico molecular en ganado bovino
Las pruebas de ADN en animales, tienen una amplia gama de
aplicaciones y específicamente en bovinos se utilizan
rutinariamente para:
 Identificación de individuos
 Diagnóstico de enfermedades genéticas
 reconstrucción de linajes
 estimaciones de consanguinidad
 Casos forenses
 Estudios de trazabilidad
IDENTIFICACIÓN DE INDIVIDUOS
Pruebas de paternidad
Las pruebas de paternidad es un análisis que han tenido
mucho impacto en la industria pecuaria.
Específicamente en bovinos se utilizan rutinariamente para:
Determinación de paternidad cuando un animal cambia o
intercambia su progenie con otra madre
En la determinación de paternidad cuando una hembra
se aparea por empadre múltiple
verificación de registros de hato
Pruebas de paternidad
Durante las últimas dos décadas los marcadores microsatélites han sido los
marcadores de elección para los análisis de paternidad/identidad y
trazabilidad en animales y humanos, sin embargo, los resultados obtenidos
con estos marcadores entre los diferentes laboratorios no son siempre
comparables debido a las dificultades técnicas para su análisis,
principalmente los errores en la determinación de los tamaños alélicos.
Polimorfismos de un solo nucleótido (SNP)
Los SNPs son el tipo más común de variación genética y son los
marcadores mas populares para los diferentes estudios de
genómica en bovinos
Los SNPs son mutaciones de un solo par de bases en un locus
específico, por lo general constan de dos alelos donde la
frecuencia del alelo mas raro es ≥ 1% (MAF).
Ventajas de los SNPs como marcadores para pruebas
de paternidad
Aunque en términos de informatividad los SNPs podrían ser
considerados no tan óptimos (son bialélicos) comparados con los
microsatelites, presenta las siguientes características:
 Amplia abundancia
 Estabilidad en mamíferos, baja tasa de mutación (108) en
comparación con los microsatelites (103)
 nomenclatura mas simple,
 posibilidades de automatización del proceso de tipificación y de
interpretación de los datos.
 Los SNPs son también ampliamente usados para el descubrimiento
de QTLs y en los estudios de asociación de genes con rasgos
productivos específicos
¿Porqué verificar el pedigrí de los
hatos?
Un paso esencial en las estrategias de
mejoramiento genético es la selección de los
animales con mayor mérito genético.
 Los productores consideran el pedigrí del animal como
un indicador muy importante de su valor genético,
tomando en cuenta a sus progenitores como ejemplo del
potencial racial que adquieren e invirtiendo grandes
sumas de dinero por aquellos que lo ameritan
 Actualmente los valores genéticos son expresados en
forma de Diferencia Esperada en la Progenie y es la forma
más exacta de analizar la productividad de un animal
y/o un hato y por lo tanto es utilizada como una
herramienta muy útil en las desiciones de selección
Importancia de las Pruebas de paternidad
Los errores de paternidad desvían los valores estimados de
heredabilidad, valores genéticos, parámetros genéticos, predicciones
de ganancia genética y por ende deprimen la tasa de progreso
genético dada la selección errónea de los animales superiores.
Ventajas:
* Certificación genética.
Evaluación de germoplasma y animales de
pie de cría, producto de inseminación artificial.
* Control genético.
Caracterización genética precisa del pedigrí de los animales
de registro en las Asociaciones Ganaderas
* Mejoramiento genético.
Determinación precisa del valor genético de los animales
dentro de un hato.
ASIGNACIÓN Y VERIFICACIÓN DE PATERNIDAD
EN UN HATO DE GANADO CHAROLAIS
 32 familias
 3 Padres candidatos
 Inseminación Artificial
Genotipificación con
10 microsatelites
Linajes encontrados en un hato de ganado Charolais
231
17-02
27
3-02
38-H
145
231
294
210
17-02
72-02
43-9
32-02
27-02
80
39-02
42-02
140
73-02
21-02
285
18
36-02
66-02
148
141
253
233
60-01
129
37-02
207
94-02
45-02
132
210
16-01
74-01
149
75-01
250-I
154
301
209
29-02
291
24-02
22-02
23-02
60-02
65-02
PATERNIDAD
%
38-H
43-99
250-I
65%
22 %
13 %
I. A.
3 EXCLUSIONES X
38-H
OBSERVACIONES:
Dominancia del semental 38-H
Verificación de paternidad por inseminación
artificial
231
17-02
38-H
145
27-02
80
39-02
140
66-02
148
37-02
132
16-01
149
75-01
291
24-02
Verificación de maternidad y paternidad
En un reciente análisis asignando paternidad con un
panel de SNP’s, se encontró un 33% de error en la
asignación de paternidad en toda la población estudiada.
Para los hatos de Nuevo León los porcentajes de error en
la verificación de paternidad fueron del 0 al 19%, en
Sonora del 11% y en Tamaulipas del 37%.
Para poner en contexto este resultado se ha reportado
que en bovinos de leche (donde la inseminación artificial
es el principal método reproductivo) los porcentajes de
error en la asignación de la paternidad de los individuos
pueden alcanzar el 11.7% siendo las principales causas,
errores en la identificación de las pajillas de semen así
como errores humanos en el registro del semen utilizado
durante la inseminación.
Perspectivas de la prueba en México
En México han existido diferentes iniciativas para la implementación de
programas de verificación de paternidad, sin embargo es hasta este inicio
del 2014 que se ha modificado el estatus de estas verificaciones y ahora son
un requisito de registro de los animales.
Esta nueva normativa es un gran paso para la ganadería en México, ya que el
uso de las herramientas moleculares deberá ser de ahora en adelante no
solo un requisito para la obtención de apoyos, sino también debería ser, si se
dirige de manera ordenada y basada en los estándares internacionales
(como por ejemplo iniciar con sistemas de identificación basados en SNPs
mas que en microsatélites), una oportunidad para aterrizar y hacer uso de
las ventajas de incluir estas tecnologías como apoyo de las estrategias de
mejoramiento genético de los hatos de esta raza.
Diagnóstico Molecular de
enfermedades genéticas
En animales domésticos, actualmente, se conocen las
bases moleculares de un número creciente de
enfermedades hereditarias monogénicas, lo que hace
posible la detección molecular directa de los individuos
portadores.
Ibeagha-Awemu E et al.,2008
Diagnóstico molecular de portadores
La detección de portadores hace posible su exclusión o
manejo adecuado dentro del hato y/o razas de ganado, de
tal manera que se logra mantener la salud y productividad
del mismo.
Artrogriposis Múltiple en el ganado Angus o síndrome de becerro contraído,
es una rara enfermedad congénita que causa múltiples contracturas y se
caracteriza por debilidad muscular y la fibrosis. En 2008, la asociación
Angus hizo un llamado de alerta ya que se detectó que sementales elite
eran portadores del gen asociado a este síndrome.
El gen Miostatina como marcador de
ADN
DOBLE MÚSCULO
La “doble musculatura” o hipertrofia
muscular es una anomalía genética que ha
sido reconocida y seleccionada por los
criadores desde 1807.
El fenotipo “doble-musculatura” se debe a un crecimiento
anormal del tejido muscular, que es causado enteramente por
un aumento del tamaño de las células existentes.
El crecimiento anormal en la hipertrofia muscular bovina
produce un aumento de la masa muscular en
aproximadamente un 20%.
Fenotipo DM
selección positiva
selección negativa
Menor Fertilidad (dificultad
reproductiva)
Mayor masa muscular con menos
grasa
Mayor Incidencia de distocia
Reducción en el alimento ingerido
(dificultades en parto)
Aumento en conversión
alimenticia
Mayor Susceptibilidad a enf.
Respiratorias
Normal
Doble musculatura
Desventajas cardiovasculares
Arthur, 1995
Identificación del gen mh
McPherron et al., 1997, usando la técnica de "knock
out" inactivaron el gen de la miostatina y en ratones
de laboratorio (MSTN_GMO), obteniendo animales
con un fenotipo similar a la doble musculatura
bovina.
Esto permitió postular a la miostatina como el gen candidato
para mh en bovinos
Conservación del gen MSTN en vertebrados
Oveja Texel
Raza de perros whippet
He mas rápidos que Ho
Importancia de MSTN en la especie Bos
taurus
-Miostatina se ha analizado en más de 30 razas
bovinas.
-Mutación
o polimorfismo:
muscular, doble musculatura
hipertrofia,
hiperplasia
- Productividad: Calidad y cantidad de musculatura
Diversidad alelica de MSTN
Mutaciones con efecto fenotipo: Doble musculatura
Descripción
Tipo de mutación
Raza
Belgian blue,
inserción/deleción en la posición Corrimiento en el marco
Asturianas, Rubia
418
de lectura
Gallega, Aubrac
transición C  T en la posición Sin sentido - terminación
Charoláis
610
prematura de la proteína
transversión G  T en la
Sin sentido - terminación
Maine-Anjou,
posición 676
prematura de la proteína
Parthenais
Belgian blue,
Corrimiento en el marco
Deleción de 11 pb desde la
Limousine, South
de lectura - terminación
posición 821 hasta la 831
Devon, Asturiana de los
prematura de la proteína
Valles
transición G  A en la posición Transversión consentido.
Piemontese, Gascon
938
Cys  Tyr en la proteina
Mutaciones sin efecto fenotipo: Normales
transversión C  A en la
Mutación consentido. Phe
Limousine, Aubrac,
posición 282
 Leu en la proteina
Devon, Pirenaica
transición C  T en la posición
Transición silente – sin
Ampliamente
414
cambio en la proteína
distribuida
Impacto de MSTN en el mercado de
carne
Gracias a un gen específico – una forma de
miostatina – natural en la raza Piedmontes, puedes
tener todos los beneficios nutricionales y el sabor
que es saludable, bajo en grasa, bajo en colesterol y
suave, siempre…
La Raza Charolais en México
Se rechaza la característica
de DM
Para manejar este problema,
se pueden utilizar estrategias
para identificar los portadores
del gen.
Detección de portadores de alelos asociados al
fenotipo mh
Homocigoto +/+
Homocigoto mh/mh
Heterocigoto mh/+
Evaluación de la prevalencia del alelo
Q204X en ganado Charolais de México
Se ha realizado la prueba para detectar las variantes
del alelo Q204X en 44 muestras de semen
comercializado por la Asociación HerdBook de
México.
Se ha encontrado que la frecuencia del alelo Q204X
en 44 sementales que es del 17%.
Frecuencia del Alelo Q204X en hatos de registro
En un estudio realizado en dos hatos del estado de Jalisco, se ha encontrado
una frecuencia de 22.9% de portadores mh/+ (CT) y de homocigotos mh/mh
del 4.16% (TT).
El origen del material genético con el que se
mejoran los hatos se relaciona con su frecuencia.
IDENTIFICACIÓN DE LAS VIAS DE DISEMINACION
DEL ALELO Q204X
NECESSAIRE
+/+
*221/12
MELLARD
mh/+
+/+
*125/23
+/+
mh/+
*58/4
mh/+
mh/+
+/+
IMPERIAL
+/+
ICARE
mh/+
mh/+
*496/65
+/+
+/+
+/+
+/+
+/+
+/+
+/+
+/+
+/+
+/+
+/+
+/+
mh/+
ICARE
mh/+
mh/+
*496/65
+/+
+/+
mh/+
+/+
+/+
+/+
+/+
+/+
IJOUFFLU
mh/+
+/+
*513/37
+/+
+/+
*Crías probadas/hatos, Asociación Charolais HerdBook de México (2009)
mh/+
Identificación de variantes génicas
asociadas a características
productivas
Selección asistida por marcadores
(MAS)
Es una herramienta que utiliza las pruebas
de DNA para ajustar los valores genéticos
(DEPs) de los animales medidos y
genotipificados para un rasgo en particular
para posteriormente usarlos en la selección
.
(Van Eenennaam, 2007).
Selección asistida por marcadores
(SAM)
• Es aplicable para caracteres que:
• Tienen índice de herencia bajo (ej., resistencia a
enfermedades y reproducción)
• Son difíciles o costosos de medir
• El animal tiene que ser sacrificado para cuantificarlo
(canal, suavidad de la carne)
(Van Eenennaam, 2012).
Marcadores de ADN asociados a calidad de la carne
Suavidad: SNPs del sistema proteolítico de la calpaína (CAPN1) y
calpastatina (CAST) sobre la suavidad de la carne de ganado Bos
taurus1 , ganado Bos indicus y sus cruzas.
Marmoleo: SNP ubicado en la región 5’ no traducible del gen
tiroglobulina (a -521 pb) y se denomina marcador TG5.
(Page et al., 2002, 2004Casas et al., 2005; White et al., 2005).
Problemas en el uso de pocos marcadores
Para SAM
Los rasgos de calidad como la suavidad, marmoleo,
crecimiento, reproducción, etc. son muy complejos,
difícilmente son explicados por la variación en uno
o varios genes y por lo tanto el uso de pocos
marcadores no cubre el concepto de SAM.
Distribución de la varianza de los
factores que influyen en el FENOTIPO
Se han desarrollado “chips” de ADN que
permiten hacer pruebas de ADN no con uno
o varios marcadores sino con miles de ellos.
Con los “chips” se acelera el descubrimiento de
mutaciones causales que explican la variación
genética entre razas
Selección Genómica (SAMgenómica)
La selección Genómica Genomic selection (GS) es
un método para estimar los valores genéticos con
base a la tipificación del animal con un gran
número de marcadores moleculares.
Esto significa que a los métodos tradicionales que
incluyen la información del pedigrí y fenotipo de
un animal se le puede adicionar información que
permite estimar valores de cría basados y
ajustados con la información molecular.
¿Cuál es el valor de la integración de la
información genómica en las Evaluaciones
Genéticas?
La inclusión de información sobre los marcadores en los
cálculos EPDs tiene los siguientes beneficios :
1. Una mayor precisión en la selección de los
animales jóvenes
2. Acortamiento del Intervalo generacional
3. Estimacion de EPDs para los rasgos nuevos
(eficiencia, sanidad de del producto final,
susceptibilidad a enfermedades)
•
•
Evolución del diagnóstico molecular aplicado a la industria pecuaria
2008
2003
•
Un marcador/un
rasgo
Adopción limitada •
Pruebas con diferentes
marcadores reportadas en
diferentes formatos
ningún vínculo entre los
resultados de las pruebas de
ADN y las asociaciones
nacionales de evaluación
genética o raza
EPDs-Potenciados
por Genómica
“Genomic-enhanced EPDs”
Modified from
an Eenennaam GeneSeek 9/12/2012
2012
•
•
•
paneles con miles de
•
marcadores para muchos
rasgos
Resultados reportados en
unidades para el rasgo
Inclusión de la
información de DNA en
las evaluaciones
genéticas nacionales
2020
presentación perfecta de
los datos de genotipo a
las asociaciones
nacionales de evaluación
genética / raza
Información sobre el
ADN utilizado para la
trazabilidad, parentesco,
defectos genéticos,
selección, gestión
asistida por marcadores,
la diferenciación de
productos
Conclusión
Las pruebas de ADN son una herramienta invaluable
para la detección de alelos asociados a enfermedades
genéticas y a rasgos de calidad y productividad. En el
primer caso, esta herramienta es útil para disminuir o
eliminar la frecuencia del alelo mutante; mientras que
en el segundo permite incrementar o fijar la
frecuencia de los alelos favorables para rasgos
productivos específicos en los hatos ganaderos.
Se propone que cada Asociación ganadera en México,
considere el uso de las herramientas de diagnóstico
molecular como una estrategia de monitoreo continuo
de la salud, productividad y calidad genética de los
hatos.
Gracias.