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2009
PRÁCTICO DE BIOLOGÍA CELULAR
Reconocimiento de estructuras subcelulares mediante transfección de proteínas fluorescentes e
inmunocitoquímica
OBJETIVO
En el presente práctico los alumnos recibirán cubreobjetos sobre los cuales se sembraron células de ratón,
transfectadas el día anterior con una proteína híbrida fluorescente. Empleando estas células los alumnos
realizarán una inmunofluorescencia para detectar un segundo componente subcelular citoplasmático, y
una tinción con marcadores fluorescentes para visualizar los núcleos. Luego examinarán las células en un
microscopio de fluorescencia de modo de reconocer las distintas estructuras subcelulares. Cada alumno
aprenderá las bases teóricas y detalles técnicos de la transfección e inmunofluorescencia, aplicando
procedimientos similares a los empleados de rutina en un laboratorio de investigación. Además adquirirá
el conocimiento básico para la operación del microscopio de fluorescencia y para la adquisición de
imágenes con una cámara digital.
INTRODUCCIÓN
Una idea general ampliamente aceptada es que el funcionamiento de las células depende de la interacción
dinámica de sus genomas con el medio ambiente. De esta interacción emergen patrones de expresión de
genes áltamente regulados en el tiempo y el espacio. Un objetivo central de las investigaciones en
Biología Celular y Molecular es identificar las reglas que gobiernan la interacción genoma-ambiente y
definir los detalles moleculares subyacentes. Esfuerzos multidisciplinarios recientes han permitido
secuenciar todo el DNA (genoma) de varios organismos procariotas y eucariotas. Estos estudios han
impulsado otros, tendientes a conocer el conjunto de genes que se transcriben (transcriptoma) y se traduce
en proteínas (proteoma) en una condición experimental determinada. Mas aún, mediante ensayos de doble
híbrido y análisis por espectrometría de masa se estan estudiando las interacciones entre proteínas y la
formación de complejos multiproteicos a una escala global (interactoma). También se estan diseñando
estrategias para analizar la localización subcelular de las proteínas a nivel global (localizoma). Muchas de
estas estrategias de análisis global se derivan de técnicas y metodologías de análisis clásicas, que todavía
se emplean para examinar la función de proteínas individuales en la mayoría de los laboratorios de
investigación.
Inmunocitoquímica
La Inmunocitoquímica es un conjunto de técnicas en donde se emplean anticuerpos para detectar y
localizar, antígenos específicos en células y tejidos. La parte del antígeno reconocida por el anticuerpo se
denomina epitope. Los epitopes pueden estar expuestos al medio extracelular, por ejemplo si pertenecen a
la porción extracelular de una proteína de transmembrana como las integrinas, el receptor de la insulina,
etc. o pueden ser intracelulares (ej. actina). Para acceder a los epitopes intracelulares, los anticuerpos
deben ser capaces de cruzar barreras como la membrana plasmática. Esta es la razón de permeabilizar las
células, es decir generar poros que permitan el pasaje de los anticuerpos. Antes de permeabilizar, las
células usualmente se fijan. La función principal de la fijación es preservar la localización y estructura de
los antígenos lo más fielmente posible a la situación que existe in vivo. Por ello los protocolos de fijación
difieren dependiendo de la naturaleza de las células, de los tejidos a procesar, y también del antígeno a
detectar.
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Fijadores:
-glutaraldehído. Es un di-aldheído de 5 carbonos, que provee la mayor preservación de la estructura fina
y por lo tanto es el fijador de elección para microscopía electrónica y algunos estudios de
inmunofluorescencia (como localización de microtúbulos). El glutaraldehído forma puentes entre los
grupos aminos de las proteínas. Se usa en un rango entre 0.2 y 1% (v/v). Las mayores desventajas del uso
del glutaraldehído como fijador es que: 1) frecuentemente altera de tal modo los epitopes que impide su
reconocimiento por el anticuerpo y 2) provoca autofluorescencia o "ruido" a determinadas longitudes de
onda de excitación.
-paraformaldehído. Es un polímero del formaldehído (monoaldehído de 1 carbono, CH2O) que forma
puentes entre los aminos de las proteínas. El paraformaldehído es un sólido que usualmente se disuelve en
PBS al 3,7-4%. Es uno de los fijadores mas usados en inmunocitoquímica puesto que preserva la mayoría
de los epitopes, probablemente debido a su menor capacidad de "crosslinking" comparado al
glutaraldehído. También genera menor autofluorescencia y penetra fácilmente a la célula.
-metanol/acetona. Proveen una fijación más rápida que los aldehídos y han sido usados para una gran
variedad de estudios, por ej. componentes del citoesqueleto. La fijación se realiza por precipitación de
proteínas y carbohidratos lo cual en algunos casos altera el patrón de localización de los antígenos.
Usualmente se fija las células 10-15 min con metanol o acetona pro-análisis, enfriadas a -20°C. Dado que
estos compuestos fijan y permeabilizan al mismo tiempo, algunos antígenos solubles del
citoplasma/núcleo pueden perderse y también puede verificarse una contracción de la muestra.
Permeabilización:
Si se desea visualizar un antígeno intracelular, luego de la fijación se debe permeabilizar la membrana con
un detergente o un solvente orgánico, para posibilitar que el anticuerpo entre a la célula. Este paso no es
necesario si lo que se intenta detectar es un un antígeno expuesto en la cara exoplásmica de la membrana
plasmática, o es un antígeno asociado la matriz extracelular. Los agentes de permeabilización más
comunes son detergentes no iónicos (tritón X100, NP40), los cuales solubilizan los lípidos de la
membrana.
Que es un detergente?
Son moléculas anfipáticas, es decir la misma molécula contiene grupos polares (cabeza) y una larga
cadena de carbonos hidrofóbica (cola). Estas moléculas exhiben propiedades únicas en el agua; sus grupos
polares forman puentes hidrógenos con moléculas de agua, mientras que las cadenas hidrocarbonadas se
agregan debido a interacciones hidrofóbicas. Los detergentes forman estructuras esféricas en soluciones
acuosas denominadas micelas, cada una de las cuales contiene numerosas moléculas de detergente.
Debido a su naturaleza anfipática, los detergentes son capaces de solubilizar compuestos hidrofóbicos en
agua.
Las membranas biológicas están compuestas por fosfolípidos y proteínas; los primeros pueden ser vistos
como detergentes biológicos. La mayoría de los lípidos que forman la membrana contienen dos grupos
hidrofóbicos conectados por una cabeza polar. Esta arquitectura molecular permite a los lípidos formar
una bicapa, en la cual las cadenas hidrofóbicas están enfrentadas mientras que las cabezas polares se
encuentran hacia el ambiente acuoso (hacia el medio polar ya sea el citosol o el medio extracelular).
Proteínas y lípidos (como el colesterol) se encuentran embebidos en esta bicapa. Las proteínas pueden
anclarse a la bicapa mediante interacciones hidrofóbicas con las cadenas hidrocarbonadas de los
fosfolípidos. Estas proteínas, conocidas como proteínas integrales, son solubilizadas por los detergentes
junto a los lípidos.
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Como actúan los detergentes? Los detergentes solubilizan las proteínas de membrana imitando el
ambiente de la bicapa lipídica. Las micelas formadas por los detergentes son análogas topológicamente a
las bicapas de las membranas biológicas. Las proteínas se incorporan dentro de estas micelas vía
interacciones hidrofóbicas. Las regiones hidrofóbicas de las proteínas de membrana, normalmente
embebidas en la bicapa lipídica, son rodeadas por las cabezas apolares de las moléculas de detergente; las
porciones hidrofílicas quedan expuestas al medio acuoso solubilizando las proteínas. A bajas
concentraciones, las moléculas de detergente se intercalan entre los fosfolípidos; a altas concentraciones
que saturan la bicapa, la membrana se desintegra para formar micelas mixtas (con moléculas de
detergente.
Es importante enfatizar que el esquema de fijación/permeabilización para cada sistema de estudio debe
ser determinado empíricamente.
Manipulación de células en cultivo
Para promover la supervivencia, proliferación y diferenciación de las células en un ambiente in vitro, hay
dos factores críticos que deber ser cuidadosamente escogidos: el medio de cultivo y el substrato de
crecimiento. El medio de cultivo debe poseer una composición de nutrientes, pH y osmolaridad
apropiadas para el tipo de células en estudio. La mayoría de las células de organismos pluricelulares
además requieren del contacto con un substrato adhesivo para crecer. Una vez determinados estos
parámetros el experimentador además debe determinar el volumen de medio y la frecuencia con que se
reemplaza por medio fresco. Las células animales usualmente se cultivan en incubadoras que mantienen
una temperatura y concentración de CO2 constantes.
Factores fisicoquímicos: Varios factores del ambiente de cultivo deben ser monitoreados para evitar
fluctuaciones. Como regla general, condiciones óptimas de cultivo para la mayoría de células de
mamíferos son las siguientes:
pH: 7.2-7.5
OSMOLARIDAD: 280-320 mOsmol
CO2: 2-5% en aire
TEMPERATURA: 35-37°C
Medio de cultivo: El cultivo de células animales es bastante más complejo que el de bacterias y hongos.
Los cultivos primarios (aquellos cuyas células resultan del plaqueo directo de los tejidos de origen) y las
líneas celulares (células que han sido repicadas) difieren en sus requerimientos nutricionales. Por ello, la
formulación del medio de cultivo depende en gran medida de las células a cultivar. Componentes comunes
son:
- Aminoácidos: La concentración de aminoácidos en el medio de cultivo limita el crecimiento y la
supervivencia de las células. Todos los medios de cultivo incluyen los 9 aminoácidos esenciales, los
cuales no pueden ser sintetizados por los animales, y los aminoácidos que son sintetizados por células
especializadas en los animales intactos.
- Vitaminas, deben estar presentes en el medio, ya que la célula no puede sintetizarlas a todas o en las
cantidades que son necesarias.
- Sales, contribuyen a la osmolaridad del medio. El bicarbonato de sodio contribuye a amortiguar los
cambios de pH en células que se cultivan en una atmósfera de CO2.
- Glucosa, se incluye en la mayoría de los medios de cultivo como una fuente de energía.
- Suero: el suero contiene hormonas, factores de adhesión, factores necesarios para la proliferación celular,
etc. El suero mas usado es el fetal de bovino.
Ciertos tipos celulares requieren factores de crecimientos específicos no presentes en el suero.
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Las células animales se cultivan en cajas de Petri, usualmente de un plástico modificado, adherente para
las células.
Esterilidad y control de la contaminación:
Esterilidad significa ausencia de cualquier organismo contaminante (hongos, bacterias, micoplasma, etc)
aparte de las células de interés. El éxito del cultivo de células es absolutamente dependiente de una
rigurosa asepsia. Para lograr esto la manipulación de los cultivos (ej. cambio de medio, repique, etc) se
realiza en mesas de flujo de aire laminar, en donde el aire es esterilizado por filtración, evitando así la
entrada de partículas en las placas o botellas donde se cultivan las células.
* Todo el material usado en cultivo debe estar autoclavado y debe ser abierto únicamente dentro del flujo
laminar.
* Los medios se esterilizan por filtración, antes del agregado del suero y antibióticos.
* Todo el material (cajas de tips, pipetas, frascos de medio, tubos, etc) que se ingresa al flujo laminar
debe ser esprayado por fuera con etanol 70%.
* Se debe trabajar con guantes limpios.
* Antes de comenzar a trabajar, el gabinete de flujo laminar debe ser esterilizado con etanol al 70% y ser
expuesto a luz ultravioleta por 10-15 minutos.
Preparación de cubreobjetos
Es sumamente importante que los coverslips usados para cultivo de células e inmunocitoquímica estén
bien limpios. Por ello, usualmente se incuba con ácido un par de horas y luego se los lava extensivamente
con agua. Los cubreobjetos limpios se guardan en etanol 70% y se flamean en el flujo antes de ser usados.
Las células no se adhieren efectivamente al vidrio, por ello los cubreobjetos deben ser tratados con
sustratos de adhesión apropiados.
Factores de adhesión o sustratos
Los factores de adhesión incluyen polímeros cargados negativamente (ej. polilisina), que facilitan la
adherencia inespecífica de las células mediante interacciones electrostáticas. Otros factores de adhesión
son derivados de la matriz extracelular (ej. fibronectina, laminina, colágenos, etc.), y requieren de la
expresión de receptores específicos en la superficie de las células. Solo las células que expresan tales
receptores se adhieren efectivamente.
Introducción y expresión de cDNAs en células cultivadas
Una estrategia experimental ampliamente usada para investigar la localización subcelular y la función de
las proteínas es introducir el cDNA que codifica para su expresión en células en cultivo. La expresión de
diversas mutantes de la proteína puede arrojar importante información acerca de los dominios funcionales.
Si se desea estudiar la localización, y no se posee de buenos anticuerpos, al cDNA de la proteína puede
adicionársele la secuencia de un epitope para el cual exista un anticuerpo obtenido comercialmente (ej. cmyc, hemaglutinina, etc). Si se quiere analizar una proteína en el contexto de la célula viva (o el tejido),
usualmente se fusiona al cDNA de la proteína el cDNA de una proteína fluorescente (ej. GFP, YFP,
DsRed, etc). Existen diversos métodos para introducir cDNAs en células eucariotas:
Métodos químicos
* Coprecipitacion por fosfato de calcio:
* DEAE-dextran y polibreno
* Fusión de protoplastos
* Lípidos catiónicos
Métodos mecánicos
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* Microinjección
* Biolistica (gene gun)
* Electroporación
Métodos biológicos
* transducción de DNA mediada por virus
VECTORES DE EXPRESION EUCARIOTAS
Secuencias necesarias:
• origen de replicación eucariota y procariota
• resistencia a antibiótico eucariota y procariota (marcador de selección)
• promotor (ej. CMV, SV40)
• RBS (sitio de unión al ribosoma)
• MCS (sitio de clonado múltiple)
Expresión heteróloga de proteínas fluorescentes
Una alternativa para examinar la localización subcelular de las proteínas es generar fusiones de sus cDNA
al de proteínas fluorescentes. Hay varias proteínas fluorescentes, la primera en ser descripta y la mas
popular en los estudios actuales es la GFP (GFP = "Green Fluorescent Protein"), clonada de la medusa
Aequorea victoria. Para producir una proteína híbrida primero necesitamos unir el cDNA de la proteína
fluorescente, por ejemplo la GFP, al cDNA que codifica para nuestra proteína de estudio (X). Es
imprescindible que ambos cDNAs esten en el mismo marco de lectura. Los cDNAs obtenidos, GFP-X,
luego se clonan en un plásmido de expresión y se introducen en las células por transfección. Existen
diversos métodos para transfectar células, el mas popular actualmente se basa en la formación de
complejos mixtos [DNA-liposomas catiónicos] que luego se agregan sobre las células. Las células
internalizan los complejos lípido-DNA, los cuales se importan al núcleo y sirven de molde para la síntesis
de la proteína híbrida fluorescente. Usualmente el plásmido que se utiliza como vector posee un promotor
viral "fuerte" (ej. CMV, SV40), es decir que es capaz de inducir altas tasas de transcripción del cDNA
clonado. Si se dispone de un microscopio invertido equipado para fluorescencia y acoplado a una cámara
digital se puede registrar la localización y dinámica de la proteína híbrida fluorescente en las células vivas.
Cámaras digitales
En la microscopía moderna la fotografía digital ha reemplazado a la tradicional basada en los conocidos
rollos de película. En la fotografía tradicional, las imágenes son captadas por una emulsión sensible a la
luz (de haluros de plata o "granos" en la jerga fotográfica) depositados en la película. La imagen latente
formada luego es revelada para obtener el negativo de las fotos. El positivo de las imágenes se obtiene a
partir de los negativos, empleando papel fotográfico (la emulsión en este caso esta depositada sobre
papel). En la cámara digital las imágenes se captan en el chip, es decir el chip es la parte sensible a la luz.
Los chips se fabrican a partir de cristales de silicio, por una serie compleja de pasos, de modo de obtener
un arreglo bidimensional de fotodiodos. Los fotodiodos (= pixels) operan convirtiendo la energía de los
fotones en cargas eléctricas. Durante el tiempo de exposición (= integración) las cargas generadas por la
interacción de los fotones incidentes con los átomos de sílice son acumuladas en los fotodiodos. Asi, cada
fotodiodo va a acumular una cantidad de cargas ~ proporcional al número de fotones. El tamaño del pixel
puede ser modificado por un proceso denominado "binning" (ver figura). El binning permite que las
cargas de un grupo de pixels vecinos sea procesada como si fuera un "super pixel" o pixel mayor único.
Binning 2 x 2 significa que 4 pixels vecinos son tratados como si fueran uno solo. El binning aumenta la
sensibilidad, pero a costa de reducir la resolución (ver mas adelante).
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chip
pixels
amplifier
CCD:
En el tipo mas común de cámaras digitales, denominadas CCD ("Charge Coupled Device") las cargas
acumuladas en cada fotodiodo durante el período de integración son transferidas ordenadamente a un
amplificador y posteriormente son transformadas en una señal digital. Este proceso de digitización
convierte la señal análoga recibida del amplificador a una señal digital (electrones --> bits). La señal
digital luego se envia a la computadora que forma la imagen en un monitor. La resolución de una cámara
depende del tamaño y número de pixels del chip. Por ejemplo, para tamaños equivalentes, un chip de 2048
x 2048 pixels permite tomar fotografías de mayor resolución que uno de 512 x 512. El rango dinámico de
una cámara es un parámetro relacionado con la capacidad de captar diferencias cuantitativas entre la señal
mas débil y la mas intensa. En el caso de una cámara monocromática (blanco y negro) seria equivalente a
la gama de grises producida. El rango dinámico se define típicamente como la máxima cantidad de cargas
que puede acumularse en un fotodiodo dividido el ruido. Por ej. si la máxima cantidad de cargas que
puede acumularse en un fotodiodo es 20.000 electrones y el ruido es 10 electrones, el rango dinámico es
2.000. Este valor corresponde a ~ una imagen de 11 bits. Intuitivamente se puede deducir que mayor
cantidad de bits significa una imagen mas rica en grises. El ruido condiciona el valor mínimo del rango.
Existen varios componentes del ruido, uno de ellos ("dark noise") depende de la temperatura. Esto quiere
decir que la temperatura provee energía suficiente para provocar acumulación de cargas en el fotodiodo,
aun en ausencia de luz (de ahi la denominación "dark noise"). Este tipo de ruido se minimiza enfriando el
chip. Las cámaras de alta performance usadas en investigación usualmente son refrigeradas a temperaturas
por debajo de cero grado celcius.
Esquema de las actividades del práctico:
1
células transfectadas
que expresan proteínas
fusionadas a GFP
inmunotinción de
antígeno intracelular
adquisición de imágenes
mediante cámara digital
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2
mitocondrias
marcación
del DNA
microtúbulos
3
retículo
endoplásmico
4
observación en
el microscopio
de fluorescencia
núcleo
focos de
adhesión
filamentos
de actina
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PROCEDIMIENTOS
El práctico se realizará en varias etapas: Se comienza con la permeabilización de células en cultivo
transfectadas con una proteína quimera fusionada a la GFP que con anterioridad fue fijada con
paraformaldehido al 4% en PBS (tiempo de incubación: 20 minutos a temperatura ambiente).
Primera etapa
1) Preparar
a) 2 ml de una solución de Triton X-100 al 0.5% en PBS.
b) 1.5 ml de una solución de albúmina sérica bovina al 3%. Mantener en hielo!
2) Permeabilización. Descartar el PBS y agregar 2 ml de la solución de TX-100.
Incubar 10 min a temp. ambiente.
3) Lavar con PBS dos veces (2 ml por lavado, 5 min. c/u).
4) Bloqueo. Agregar la solución de albúmina. Incubar 1 h a temp. ambiente.
5) Reemplazar por 2 ml de PBS conteniendo 0.1% azida de sodio (NaN3). Guardar en heladera.
Fin de la primera etapa (~4hs)
-----------------------------------------------------------------------------------------------------------Segunda etapa
6) Hacer 1 lavado con PBS (sin azida de aqui en mas)
7) Hacer una cámara húmeda poniendo una servilleta de papel absorbente en una cápsula de 10 cm.
Agregar H2O destilada hasta saturar el papel (no agregar de mas!). Poner un cuadrado de Parafilm sobre
el papel húmedo.
8) Preparar la solución con el anticuerpo primario. Diluir con albúmina al 3% en PBS.
9) Incubación con el anticuerpo primario. Transferir el cubreobjetos de la solución de bloqueo a la cámara
húmeda preparada. Agregar inmediatamente (evitar que las células se sequen!) 50 μl de la solución del
anticuerpo. Incubar 1 h a temp. ambiente. (guardar la cámara después de usar)
10) Lavados. Tomar con cuidado el cubreobjetos, drenar la solución de anticuerpo tocando suavemente
sobre papel absorbente. Transferir inmediatamente (no dejar secar!) el cubreobjetos a una cápsula de 35
mm con 2 ml de PBS. Incubar 5 min. Repetir el lavado 2 veces mas.
11) Preparar la solución con el anticuerpo secundario en albúmina al 3%.
12) Incubación con el anticuerpo primario. Repetir el paso 10 pero usando el anticuerpo secundario (o
droga) fluorescente. Usar un trozo de Parafilm nuevo.
Incubar 45 min a temp. ambiente.
13) Lavados. como en el paso 10.
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14) Incubar 5 min con 1 ml de una solución de Hoechst (5 μg/ml) en PBS.
15) preparar una mezcla de glicerol-PBS (50:50) en un eppendorf. Líquido de montaje.
16) Montaje. Poner 20 μl del líquido de montaje en un portaobjetos limpio. Tomar el cubreobjetos con
cuidado, drenar el exceso de líquido y secar la cara donde no hay células. Inmediatamente montar el
cubreobjetos sobre la gota de líquido.
Fin de la segunda etapa (~4hs)
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------Tercera etapa
A: Observar en contraste de fases a 100x AN 1.4.
a- tomar 1 foto en blanco y negro a 8 (imagen 1) y a 12 bits (imagen 2)
- agrandar las imágenes tomadas al máximo. En cual observa mayor gama de grises?...................
b- tomar 1 foto en blanco y negro a 8 bits sin binning (imagen 3).
- tomar una segunda imagen del mismo campo con 4 x 4 binning.
- que observa? la misma imagen.................todo blanco.....................todo negro....................
- intercalar 1 o dos filtros y regular la intensidad de luz hasta obtener una segunda imagen
similar a la primera (imagen 4).
- agrandar las imágenes tomadas al máximo. En cual nota mas el pixelado?..............................
B: Observar con fluorescencia.
a- Empleando el objetivo de 100x AN 1.3, tomar una foto
(tiempo de exposición =.........segundos). (imagen 5)
-Repetir empelando el objetivo de 100x AN 1.4, a igual tiempo de exposicion que la imagen
anterior (imagen 6)
- comparar las imágenes 5 y 6,
-¿En cuál observa más intensidad de fluorescencia?..............
-¿En cuál observa mayor definición en los detalles?..............
b- Empleando el objetivo de 100x, tomar una foto en blanco y negro a 12 bits
(tiempo de exposición =.........segundos). (imagen 7)
- exponer el mismo campo y el mismo fluorescente 2 minutos.
- sin mover el preparado tomar una segunda foto exponiendo el mismo tiempo que la
primera foto (imagen 8).
- comparar las imágenes 7 y 8 con o sin zoom.
- tienen las dos la misma gama de grises? ..................................................
Fin de la tercera etapa
----------------------------------------------------------------------------------------------------------Cuarta etapa
Discusión de resultados.
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Literatura en la web:
Digital imaging
http://www.olympusmicro.com/primer/digitalimaging/index.html
http://www.microscopyu.com/articles/digitalimaging/digitalintro.html