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Respiración Celular
Metabolismo energético
1789: Lavoisier escribió que la respiración no es nada
más que una combusitón lenta del carbono y el hidrógeno.
El había demostrado que los seres vivos cosumen oxígeno
y generan CO2.
A finales del siglo XIX se sabía que
Glucosa + O2
CO2 + H2O
A principios del siglo XX se vió que esto era por
transferencia de electrones y protones de la glucosa al
oxígeno para formar agua según las ecuaciones
Glucosa + 6H2O
6O2 + 24 H+ + 24 e-
6CO2 + 24H+ + 24e- Se oxida
12H2O.
Se reduce
Siglo XIX término oxidasa
Breve Historia
1910-12 oxidación de compuestos por O2 en presencia de tejidos y la
sensibilidad a algunos inhibidores: concepto de proceso
enzimático. ’20s término deshidrogenasa y citocromos.
Si gl o X X
’30s compuesto con Fe o las deshidrogenasas. Solución: conexión por
hemoproteínas (citocromos)
1939 deshidrogenasa, citocromo b, c a y a2, O2 y H2O 1946 respiración en
mitocondrias 1948 fosforilación oxidativa desde el NADH hasta el O 2
1950 ubiquinona o coenzima Q. 1952 membranas por microscopía
electrónica. 1953, teoría química.
1960 Fe, S, Cu y Mg como cofactores metálicos y proteínas Fe-S 1961
teoría quimioosmótica: transporte de electrones con el pasaje
de H+ contragradiente como fuerza para síntesis de ATP por la
ATPasa
1966 Complejos I, II, III (citocromo bc), IV (citocromos a) y V (ATPase),
tamaños en precipitaciones con sulfato de amonio y columnas de exclusión
molecular que contenían actividad:
’70s controversias En 1975 el ciclo Q.1978 Nobel Prize para Mitchell.1981
Mitocondrias
La respiración celular tiene lugar en la membrana interna de
las mitocondrias
Cuatro compartimientos
Contienen su propio ADN con diferente cantidad de genes
(desde 37 en humanos a 57-70 en plantas u hongos)
Teoría del endosimbionte: α o γ proteobacteria (Rickettsia sp.)
Localización submitocondrial
TOM y SAM
Enzimas del ciclo
TCA, ADNmt,
ribosomas
Factores de
apoptosis o PCD
Cadena respiratoria y
TIM
Teoría del endosimbionte
La oxidación del NADH es una reacción exergónica
El NADH es el intermediario más importante de la célula por su
capacidad de óxido-reducción. El NADH es oxidado por el O2
NAD + H+ + 2e-
NADH
E0'= -0,315
½ O2 + 2H+ + 2e-
H2O
E0'= 0,815
La afinidad por electrones aumenta con el potencial de reducción
½ O2 + NADH + H+
H2O + NAD+
∆Eo'= 0,815- (-0,315) = 1,130 V o como ∆Go'= -nF∆Eo'
1,130 V= -218 kJ. mol-1
Cadena de Transporte de Electrones:
consideraciones termodinámicas
La afinidad por
electrones
aumenta con el
potencial de
reducción
∆G:-218,2kJ.mol-1
dividido en tres
reacciones
Los electrones provenientes de la oxidación del NADH y FADH 2 pasan por cuatro
complejos, desde los potenciales de reducción más bajos a los más altos
Concentración de oxígeno
Inhibidores
100
Sin
adiciones
Concentración de oxígeno
% consumo de oxígeno/min
tiempo
Rotenona
-
rot
Células alimentadas con glucosa
KCN
Concentración de oxígeno
tiempo
KCN
tiempo
Cómo daría alimentado con hidroxibutirato que produce NADH?
Cadena de Transporte de Electrones
Cadena Respiratoria
Complex I : NADH dehydrogenase:Ubiquinone
oxido reductase
2006
En 2010 se logró
cristalizar de una
bacteria
Complex III: Cytochrome bc1 complex
ubiquinol:cytochrome c oxidoreductase
Cytochrome c
Complex IV: Cytochrome c Oxidase
La subunidad γ de la ATPase es capaz de girar
Complex V: ATP synthase
Electron Transport Chain
Enfoque proteómico para
identificar nuevas funciones en
mitocondrias
mitocondrias
Funciones generales de la mitocondria















decarboxylación de piruvato
ciclo de ácidos tricarboxílicos (TCA)
fosforilación oxidativa
degradación y biosíntesis de aminoácidos
ciclo de la urea *
β-oxidación de ácidos grasos *
biosíntesis de fosfolípidos (ej. cardiolipin)
biosíntesis de biotina y ácido lipoico
biosíntesis de hemo
biosíntesis de ácido fólico y ascórbico (vitamina C)
Ensamblaje de complejos Fe-S
síntesis de proteínas, transcripción y replicación de ADN
importe de proteínas, clivaje y degradación
apoptosis / muerte celular programada
rol en cancer, Parkinson, ataxia
* Ausente en mitocondrias de plantas
homeostasis de Ca ++ y Fe ++
Enfoque Proteómico de organelas:
•Aislamiento de las organelas a la mayor
pureza posible
•Aislamiento de todas las proteínas
•Separación de las proteínas por diferentes
métodos
•Aislamiento e identificación sistemática de
las proteínas
Muchas de las proteínas son conocidas,
forforilación oxidativa
el ciclo de TCA,
30-60% (dependiendo del organismos) no han sido todavía
identificadas.
˜
˜
25% se desconoce su función experimentalmente
Se supone que las mitocondrias cumplen muchas funciones pero
sólo algunas han sido estudiadas en gran detalle . En la mayoría
de los casos las proteínas implicadas en estos procesos no han
sido identificadas aún. Para poder comprender a fondo estos
procesos es necesario establecer un catálogo completo de estas
proteínas. Esto es la proteómica.
Purificación de mitocondrias por
ultracentrifugación en gradientes de Percoll
etiolated
seedlings
green
seedlings
flower
buds
Sistemas de electroforesis en gel en
dos dimensiones
2D IEF / SDS-PAGE
2D BN / SDS-PAGE
2D BN / BN-PAGE
Two-dimensional isoelectroenfoque IEF/
SDS PAGE
First gel dimension:
• proteins
• non-ionic detergent
• pH gradient
Second gel dimension:
• gel strip of the first
gel dimension
• SDS
Two-dimensional Blue-native / SDS PAGE
First gel dimension:
• proteins
• non-ionic detergent
• Coomassie-blue
Second gel dimension:
• gel strip of the first
gel dimension
• SDS
Jänsch et al. (1996), Plant J. 9, 357-368
Two-dimensional Blue-native / Blue-native PAGE
First gel dimension:
• proteins
• non-ionic detergent I
• Coomassie-blue
Second gel dimension:
• gel strip of the first
gel dimension
• non-ionic detergent II
Eubel et al. (2004), Plant Physiol. 134, 1450-59
2D Fluorescence Difference Gel Electrophoresis (2-D DIGE)
Mix labelled samples
2D gel electrophoresis
protein sample I
Cy3 label (∆)
protein sample II
Cy5 label (wt)
Image analysis
excitation wavelength I
excitation wavelength II
overlay image
Purificación de los complejos por ultracentrifugación
en gradientes de sacarosa
actividad
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
I+III2
I
H
V
III2
FDH
1D Blue native PAGE
MALDI-TOF MS/MS
Cadena Respiratoria de Plantas
CI
NDex
42 subunits
9 plantspecific
51 genes
1 subunit
4 genes
H+
Cyt c
1 subunit
2 genes
C
NDex
Q
CII
NDin
NADH
NDin
1 subunit
2 genes
NADH
succ
CII
8 subunits
4 plantspecific
12 genes
14 subunits
1 plantspecific
20 genes
H+
H+
NADH
CI
CV
CIII
CIV
CV
135 genes
25% plant
specific
AOX
O2
AOX
1 subunit
5 genes
O2
CIII
10 subunits
2 plantspecific
17 genes
ATP
H+
CIV
14 subunits
6 plantspecific
23 genes
Cadena ramificada en plantas
Møller, Rasmusson, Brown (2002) In: Plant Physiology, Taiz, Zeiger (Ed), Sinauer Associates
El Complejo I está implicado en la síntesis de
ácido ascórbico (vitamina C)
La enzima L-galactono-1,4-lactone dehydrogenase (GLDH)
cataliza la reacción final en la síntesis de ácido ascórbico
El Complejo I de plantas tiene un dominio extra
Arabidopsis
Neurospora
Guénebaut et al. (1997) J Mol Biol 265: 409-418
Dudkina et al., 2005
Las γCAs están en el brazo de membrana
C
A
S
I
complex I
Proteínas de membrana
600 kDa subcomple
400 kDa subcomple
Sunderhaus et al., 2006
Las γCAs están en la membrana hacia la matriz
_
+
_
+
_
+
46
30
21
ANT
SOD
CA
Sunderhaus et al., 2006
La falta de γCA2 causa reducción del Complejo I
Blue-native PAGE
IEF
70
At5g37510
55
55
SDS PAGE
30
At3g48680
14
30
At3g63510
At5g52840
20
At3g07480
A
B
I+III2
I
V III2
4.6
5.3
6.0
6.7
8.7
Perales et al., 2005
NADH oxidazing domain
Carbonic anhydrases
Membrane arm
Supercomplejos
Respiratorios
tallo
I2+III4
I+III2+IVa
I+III2+IVb
I+III2
I
III2+IVa
III2+IVb
V
III2
?
IVa
?
IVb
Eubel et al. 2004,
Plant Physiol.
134, 1450-1459.
tubérculo
I+III2+IVa4
I+III2+IVa2
I+III2+IVa
I+III2
III2+IVa2
I
III2+IVa
V
III2
?
IVa
?
Respirasoma
H+[IMS]
H2O
NADH
+ H+
III
IV
½O2 + 2 H+
I
III
+
NAD
IVIV
H2O
H+[M]
Eubel et al. 2004, Plant Physiol. 134, 1450-1459.
I+III2
Rol funcional de supercomplejos? Channeling?
Importación de proteínas
Enzimas de la glicólisis asociadas mitocondrias
In vitro
Proteínas poco abundantes
LC/MS
subproteomas
En varios organismos encontraron las enzimas de la glicólisis en
proteomas de la membrana externa mitocondrial.
In vivo
Mitotracker
Enolase-GFP Aldolase-GFP
GFP
Del 3 al 12% está asociado a la mitocondria
Están
asociadas a la
membrana
externa
Giegé et al, 2003
La ATPasa está involucrada en generar
Las crestas mitocondriales?
∆ subunidad γ ATPase de levaduras
altera la estructura mitocondrial
Paumard et al. 2002,
EMBO J. 21, 221-230
El cross-linking de los dominios F1 de la
ATPase altera también la morfología
Gavin et al. 2004,
J. Cell Science 117, 2333-2343
Estructura de la ATPase dimérica :
La asociación angular de los monómeros induce una
fuerte curvatura de la membrana interna
Dudkina N., et al.. (2005)
Las mitocondrias pueden diferir en forma y número de acuerdo al
organismo o incluso al tejido
Sin embargo los mecanismos moleculares que gobiernan estos parámetros no
son claramente entendidos aún.
Comparación de Proteomas de Mitocondrias
Genes codificados
en mitocondrias
Proteínas
estimadas
%identificadas
% Energía
%
mantenimiento
% signalling
% defensa y/o
apoptosis
% desconocidas
L 28
1000
70
14
53
5
3
25
M 13
2000
35
22
50
12
10
6
P
2000
25
23
49
8
6
22
57
Mitocondrias de diferentes tejidos suelen contener distintas proteínas
acordes con sus funciones