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Sexto Examen
Tema IX. Ingeniería Genética.
Curso: Genética y Biología Molecular
Profesora: Dra. Herminia Loza Tavera
Ayudante: Gustavo Antonio
Ingeniería Genética
Así como actualmente se produce la insulina recombinante, es posible producir a escala masiva y
con métodos biotecnológicos distintas hormonas. Una de estas hormonas, muy importante para el
tratamiento de diversas patologías asociadas con el desarrollo, es la Hormona del Crecimiento
Humana, HGH (Human Growth Hormone). En el siguiente ejercicio tienes que clonar el gen de
dicha hormona en un plásmido y seleccionar las colonias de bacterias que la expresan.
Abajo se muestra el mapa de un plásmido comercial que permite seleccionar moléculas
recombinantes mediante el sistema de alfa complementación. En el mapa se señalan diferentes
zonas importantes, tales como el sitio de Origen de replicación (ori), el gen LacZ y su promotor
R
(promLacZ), el gen de resistencia a ampicilina (Ap ) y los sitios múltiples de clonación (MCS,
multiple cloning sites). Como se indica, el tamaño del plásmido es de 2,686 pb, las cuales se
empiezan a contar a partir del final del ori en contra de las agujas del reloj. Los números indican la
posición de los distintos sitios de restricción en el plásmido (por ejemplo, el sitio BamHI se
encuentra a 2500 pb y EcoRI a 460 pb).
A partir de una biblioteca de cDNA, aislaste el fragmento que contiene el gen de la HGH. Abajo se
encuentra el mapa de dicho fragmento, la sección en amarillo indica donde se encuentra el gen,
además se muestran entre paréntesis las posiciones de los distintos sitios de corte para diferentes
enzimas de restricción.
Con base en lo anterior:
a) Indica que enzima(s) de restricción elegirías para clonar el gen de la HGH en el plásmido
pUC19 en la orientación correcta y explica brevemente por qué.
b) Dibuja un esquema en donde muestres el proceso de corte y ligación del gen con el plásmido
de acuerdo a los sitios de corte de la(s) enzima(s) que elegiste, e indica las bases que reconoce(n)
dicha(s) enzima(s) para hacer la digestión.
El siguiente paso consiste en transformar una cepa adecuada de bacterias con el vector de
clonación y seleccionar aquellas en las que se haya clonado el inserto que codifica a la HGH.
Considerando que el gen está clonado dentro de un segmento de DNA del gen lacZ que codifica el
α péptido, explica:
c) ¿Qué cepa bacteriana elegirías para transformarla con el producto de la ligación?
d) ¿Cómo identificarías a las bacterias que contienen al plásmido? y ¿cómo a aquellas que
contienen al plásmido con el inserto del gen de la HGH?
Conforme a lo anterior, seleccionaste una bacteria que contiene al plásmido con el gen de la HGH.
Una manera de verificar que realmente esa bacteria contiene el vector con el inserto clonado es
mediante digestión con enzimas de restricción. Los productos de la digestión se corren en un gel
de agarosa y se observa si el patrón de bandas (el número y tamaño de las bandas que aparecen
en el gel) corresponde a lo esperado. Tomando en cuenta esto:
e) Propón dos enzimas de restricción para hacer dos digestiones que permitan determinar que el
gen de la HGH está clonado en pUC19.
f) Representa un gel en donde dibujes dos carriles con las bandas esperadas, de acuerdo a los
sitios de restricción y el tamaño de los productos de cada digestión, comparándolos con los
patrones obtenidos en las digestiones de plásmidos que no contengan el inserto.
g) Si quisieras probar esto mismo con una reacción de PCR ¿qué primers tendrías que diseñar?
Has un esquema de una electroforesis en donde analizas los productos que obtendrías en una
reacción en la que empleas como molde el pUC19 vacío en comparación con una reacción en la
que empleas como molde el pUC19 conteniendo el gen HGH?