Download distribución del virus de la tristeza en tres plantaciones

DISTRIBUCIÓN DEL VIRUS DE LA TRISTEZA EN TRES PLANTACIONES
COMERCIALES DE CÍTRICOS DEL ESTADO DE NUEVO LEÓN, MÉXICO
DISTRIBUTION OF CITRUS TRISTEZA VIRUS IN THREE COMMERCIAL
GROVES IN NUEVO LEÓN, MÉXICO
Sergio Silva-Vara1, María de los Angeles Peña del Río1, Rebeca Peña-Martínez2, Nancy Villegas-Jiménez2,
Keir F. Byerly-Murphy3 y Mario A. Rocha-Peña4
1
INIFAP. Campo Experimental General Terán. Apartado Postal 3. General Terán, Nuevo León. 67400
México. 2Departamento de Zoología. ENCB/IPN. Prolongación Carpio y Plan de Ayala. Colonia
Santo Tomás. 11340 México D. F. 3INIFAP-CIRPAC. Dirección Agrícola. Apartado Postal 6-163.
Guadalajara, Jalisco. 44660 México. 4INIFAP. Unidad de Investigación en Biología Celular y
Molecular. Apartado Postal 128-F. Ciudad Universitaria. San Nicolás de los Garza, Nuevo León.
66450 México. ([email protected])
RESUMEN
ABSTRACT
Se llevó a cabo un estudio para determinar la ocurrencia del virus
de la tristeza (CTV) en plantaciones comerciales de cítricos en el
Estado de Nuevo León, México. La detección del CTV se realizó
mediante la prueba de ELISA utilizando anticuerpos policlonales
anti-CTV, y mediante el anticuerpo monoclonal MCA13 de reacción específica. El estudio se llevó a cabo en tres huertas en los municipios de Montemorelos, Hualahuises y Linares, con ocurrencias
iniciales en porcentajes de 4.34 (34 de 783), 0.02 (1 de 4543) y 0.70
(12 de 1704), respectivamente. Se obtuvo una reacción positiva al
anticuerpo monoclonal MCA13 de reacción específica en 35 de los
47 aislamientos del CTV detectados. En un muestreo permanente
realizado dos veces al año, de 1996 a 1998, se encontró un incremento en la ocurrencia del CTV de 0.27 y 0.18%, en las plantaciones de Montemorelos y Linares, respectivamente. No se detectaron
árboles adicionales infectados por el CTV en la huerta del municipio de Hualahuises. Se identificaron los áfidos vectores Aphis gossypii
Glover, A. spiraecola Patch y Toxoptera aurantii B. de F. en todas las
plantaciones muestreadas. No se encontraron evidencias de la presencia del vector más eficiente del CTV, el áfido pardo Toxoptera
citricida (Kirkaldy). No se obervó ninguno de los síndromes asociados al CTV en los árboles encontrados CTV positivos en el estado
de Nuevo León, no obstante del uso generalizado del portainjerto
naranjo agrio en toda la industria citrícola del Estado.
A survey to determine the occurrence of citrus tristeza virus (CTV)
was carried out in commercial citrus groves in the northeastern
state of Nuevo León, México. CTV detection was performed by
ELISA using anti-CTV specific polyclonal antibodies and the
strain specific MCA13 monoclonal antibody. The study was
conducted in three citrus groves in the municipalities of
Montemorelos, Hualahuises and Linares, with initial CTV
incidences of 4.34% (34 out of 783), 0.02% (1 out of 4543) and
0.70% (12 out of 1704), respectively. There was a positive reaction
with the severe strain specific MCA13 monoclonal antibody in
35 out of the 47 CTV positive samples. A permanent survey twice
a year during 1996-1998 showed an increase in CTV occurrence
of 0.27 and 0.18%, in the groves of Montemorelos and Linares,
respectively. No CTV spread was detected in the grove of
Hualahuises. CTV vectors Aphis gossypii Glover, A. spiraecola
Patch and Toxoptera aurantii B. de F. were common in all the
groves monitored for aphids. The most efficient insect vector of
CTV, the brown citrus aphid, Toxoptera citricida (Kirkaldy). It
was not found in any of the surveyed groves. None of the disease
syndromes associated with CTV was noticed in any of CTV
infected trees, even though sour orange is predominant in the
whole citrus industry of the state.
Key words: Citrus aurantium, ELISA, epidemiology, insect vectors,
sour orange.
Palabras clave: Citrus aurantium, ELISA, epidemiología, insectos
vectores, naranjo agrio.
INTRODUCTION
INTRODUCCIÓN
C
itrus tristeza virus (CTV) is distributed
worldwide and causes one of the most
destructive diseases in citrus (Rocha-Peña et
al., 1995). CTV in México has not caused noticeable
effects on the citrus industry yet; however, the use of
sour orange (Citrus aurantium L.) as the predominant
rootstock in most of the citrus groves, along with the
large areas of Mexican lime {Citrus aurantifolia
(Christm.) Swingle} planted in the Pacific coast region,
E
l virus de la tristeza (CTV) tiene distribución mundial y ocasiona una de las enfermedades más
destructivas en el cultivo de los cítricos (RochaPeña et al., 1995). En México el CTV todavía no ha ocasionado daños a la citricultura; sin embargo, la
Recibido: Marzo, 2000. Aprobado: Mayo, 2001.
Publicado como ENSAYO en Agrociencia 35: 441-450. 2001.
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AGROCIENCIA VOLUMEN 35, NÚMERO 4, JULIO-AGOSTO 2001
predominancia del portainjerto naranjo agrio (Citrus
aurantium L.) en la mayoría de las plantaciones, así como
las extensas áreas plantadas con lima mexicana {Citrus
aurantifolia (Christm.) Swingle} en la Costa del Pacífico, lo hacen totalmente vulnerable al CTV. El estado de
Nuevo León, ubicado en el noreste de México, tiene actualmente alrededor de 30 000 hectáreas de cítricos, plantadas principalmente con naranja tardía {Citrus sinensis
(L.) Osb.}, y en menor proporción con naranjas tempranas y otras especies como toronja (Citrus paradisi
(Metcaf.) y mandarina (Citrus reticulata Blanco); en ellas,
el portainjerto predominante es el naranjo agrio. Las heladas ocurridas en los años 1983 y 1989 dañaron las plantaciones, por lo que una gran cantidad de citricultores las
rehabilitaron con material de propagación traído del estado de Veracruz, donde en 1992 y 1993 se encontraron
focos de infección del CTV en viveros comerciales. Debido a lo anterior, durante 1995 se efectuó un muestreo
para la detección del CTV en el estado de Nuevo León,
encontrando 47 plantas positivas al CTV de un total de
18 950 árboles evaluados (0.25% de ocurrencia). Las 47
plantas CTV positivas se encontraron en tres huertas ubicadas en los municipios de Montemorelos (34 de 783=
4.34%), Hualahuises (1 de 4543=0.02%) y Linares (12
de 1704=0.70%) (Rocha-Peña et al., 1996)5. En este trabajo se presentan resultados de ocurrencia del CTV en
tiempo y espacio en tres huertas con antecedentes de infección por el CTV, así como de la fluctuación poblacional
de áfidos vectores. Se partió de las siguientes hipótesis:
1) Existen en el estado de Nuevo León aislamientos del
CTV del tipo declinamiento en la combinación dulce/
agrio, pero sin manifestar aún su efecto detrimental en el
cultivo. 2) Los aislamientos del CTV presentes en el estado de Nuevo León son transmisibles en forma eficiente
por poblaciones locales de áfidos. 3) Existen en el estado
de Nuevo León aislamientos del CTV de naturaleza débil en la combinación dulce/agrio, que pueden ser útiles
en programas futuros de protección cruzada.
MATERIALES Y MÉTODOS
Área de estudio
Este estudio se llevó a cabo en tres huertas de cítricos con antecedentes de tener árboles CTV positivos. Durante los años 1996, 1997 y
1998 se analizaron en forma individual cada uno de los árboles presentes en las tres huertas bajo estudio. La huerta Ojo de Agua está ubicada
aproximadamente a 8 km al noreste de la cabecera municipal de
Montemorelos, compuesta por un total de 783 árboles de naranja dulce
de la variedad Valencia con árboles aislados de variedades tempranas y
Washington Navel. La huerta El Roble está ubicada aproximadamente
5
makes the whole industry highly vulnerable to CTV. In
the northeastern state of Nuevo León, there are
approximately 30,000 hectares of citrus, planted mostly
with Valencia sweet orange {Citrus sinensis (L.) Osb.},
but with small plantings of some early-bearing sweet
oranges and some other species such as grapefruit
(Citrus paradisi (Metcaf.) and tangerine (Citrus
reticulata Blanco). In most of them, the predominant
rootstock is sour orange. The frosts in 1983 and 1989,
severely damaged the citrus groves so that many of the
citrus growers rehabilitated their groves with
propagative budwood brought from the state of
Veracruz, where, in 1992 and 1993, some CTV infected
material was detected in commercial citrus nurseries.
For that reason, a survey was conducted during 1995
in the state of Nuevo León, where 47 CTV infected
plants were found out of 18,950 surveyed trees (0.25%
occurrence). The 47 CTV positive plants were located
in three selected groves in the municipalities of
Montemorelos (34 out of 783=4.34%), Hualahuises (1
out of 4543=0.02%) and
Linares (12 out of
1704=0.70%) (Rocha-Peña et al., 1996)5. The current
paper presents results of the spatial and temporal
distribution of CTV in three commercial groves, as well
as the dynamics of aphid populations. The work is based
on the following hypotheses: 1) In the state of Nuevo
León there are decline inducing CTV isolates on the
sweet/sour combination, but in symptomless condition.
2) Field CTV isolates are efficiently transmitted by the
local aphid populations. 3) In the state of Nuevo León
there are mild CTV isolates on the sweet/sour
combination that might have potential use in future
cross-protection programs.
MATERIAL AND METHODS
Area of survey
The current work was carried out in three commercial groves
with records of CTV infected trees. During 1996, 1997, and 1998,
every individual tree in each grove was analyzed for the presence of
the virus. The Ojo de Agua grove is located approximately 8 km
northeast from the Montemorelos municipality, and it has 783
Valencia sweet orange trees with some scattered Washington Navel
and other early bearing sweet orange cultivars. The El Roble grove
is located approximately at a distance of 5 km on the side road toward
Las Lajas creek in the municipality of Hualahuises. It has 4543 trees
of sweet oranges with a predominance of the Valencia cultivar. The
Toro Pinto grove is located approximately 8 km from the Linares
municipality on the side road leading to La Escondida, and has 1704
trees of mostly Valencia sweet orange. The three of them are adult
Rocha-Peña, M. A., S. Silva-Vara, y J. P. Martínez-Soriano. 1996. Presencia del virus de la tristeza en plantaciones comerciales de cítricos del
estado de Nuevo León, México. Memorias XXIII Congreso Nacional de Fitopatología. Guadalajara, Jalisco. México.
SILVA-VARA et al.: VIRUS DE LA TRISTEZA EN CÍTRICOS EN NUEVO LEÓN
en el km 5 del camino vecinal al arroyo Las Lajas que sale al noreste de
la carretera nacional en el municipio de Hualahuises. Está compuesta
por un total de 4543 árboles de naranja dulce, con predominio de la
variedad Valencia. La huerta Toro Pinto está ubicada aproximadamente a 8 km del municipio de Linares sobre el camino vecinal a la Escondida, y está compuesta por 1704 árboles en su mayoría de naranja Valencia. Las tres huertas bajo estudio son huertas adultas, de entre 30 y
35 años de edad, y tienen una distancia de plantación de 8x8 m, y de
aquí en adelante se referirá a ellas por el nombre del municipio donde
se localizan.
Colecta y preparación de tejido
La colecta de tejido de cítricos se llevó a cabo siguiendo la metodología de Padrón-Chávez y Rocha-Peña, 19936, durante las
brotaciones de otoño-invierno (septiembre-febrero) y primavera (marzo-abril) de los años 1996 a 1998. De cada árbol se cortaron de 8 a 10
brotes tiernos que tuvieran las hojas recién expandidas, se colocaron
en bolsas de polietileno, se etiquetaron y se trasladaron al laboratorio
en recipientes con hielo y protegidos del sol. De cada muestra se separó la corteza y los pecíolos y nervadura central de las hojas y se cortó
en porciones de aproximadamente 1-2 mm2. El tejido se dejó secar a
temperatura de laboratorio durante 48 a 72 hr, se empaquetó en porciones de 4 a 5 gramos en papel secante y se almacenó en refrigeración por un máximo de 2 semanas antes de su análisis.
Pruebas serológicas
El análisis de las muestras se llevó a cabo en el Laboratorio Acreditado para Diagnóstico del VTC, ubicado en las instalaciones del
Campo Experimental General Terán del INIFAP. Se utilizó la técnica
serológica de inmunoadsorción ligada a enzima (ELISA) en su modalidad de anticuerpo de doble sandwich indirecto (Bar-Joseph y
Malkinson, 1980; Rocha-Peña et al., 1991) con anticuerpos RbB227
desarrollados en dicho laboratorio. Como anticuerpos intermedios se
emplearon la mezcla de anticuerpos monoclonales 3DF1 y 3CA5 de
reacción poliespecífica adquiridos de Ingenasa (España). Para el análisis de severidad se utilizó el anticuerpo monoclonal MCA13 proporcionado por el Dr. T. A. Permar, del Departamento de Agricultura de
los Estados Unidos, con sede en Orlando Florida.
El tejido, antes de su análisis, se molió en un homogeneizador
Tekmar Mark II en presencia de solución de extracción PBS-Tween+2%
polyvinyl pyrrolidone (Sigma PVP-40) {PBS=8 mM Na2HPO4, 14 mM
KH2PO4, 15 mM NaCl, pH 7.4, (+0.1% Tween 20)} a una concentración de 1:10 (peso/volumen).
En todo el trabajo se utilizaron placas de microtilulación de
poliestireno Immulon II (Dynatech Laboratories). Inicialmente se
utilizaron 200 ml por pocillo para el tapizado de las placas; mientras
que en todos los pasos subsecuentes se utilizaron 190 ml por pocillo. Asimismo, todas las incubaciones se llevaron a cabo a 4-5 ºC
durante 18 hr y entre cada paso de incubación se llevaron a cabo tres
6
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groves with 30 to 35-year-old trees at a spacing of 8x8 m, which
from now on will be named according to the municipality where
each one is located.
Tissue collection and sample preparation
Citrus tissue was collected following the methodology of PadrónChávez and Rocha-Peña 19936, in the fall-winter (September-February)
and spring (March-April) budding periods of 1996 to 1998. Eight to
ten tender shoots with fully expanded leaves were collected from every
tree, placed in plastic bags, labeled and taken to the laboratory in ice
boxes. In each sample bark tissue was peeled, midribs and petioles of
leaves were excised and finely chopped in portions of about 1-2 mm2.
The tissue was dried at room temperature for 48-72 hr, wrapped in
paper towels (portions of 4-5 g) and kept at 5 oC for two weeks previous
to the analysis.
Serological tests
The samples were analyzed at the certified laboratory for CTV
detection located at the General Terán Experiment Station of INIFAP.
The serological technique of enzyme-linked immuno-adsorption
(ELISA) was used in its modality of indirect double sandwich antibody
(Bar-Joseph and Malkinson, 1980; Rocha-Peña et al., 1991) with
polyclonal RbB227 antibodies, produced in our laboratory. A mixture
of the 3DF1 and 3CA5 monoclonal antibodies of poly-specific reaction
purchased from Ingenasa (Spain) was used as intermediate antibodies.
The MCA13 antibody, provided by Dr. T.A. Permar, United States
Department of Agriculture, Orlando Florida, was used for strain
discrimination.
Before the analysis, the citrus tissue was homogenized with a
Tekmar Mark II Tissumizer in extraction buffer PBS-Tween+2%
polyvinyl pyrrolidone (Sigma PVP-40) {PBS=8 mM Na2HPO4, 14 mM
KH2PO4, 15 mM NaCl, pH 7.4, (+0.1 % Tween 20)} at a 1:10 (weight/
volume) concentration.
Polyestyrene Immulon II microtiter plates (Dynatech Laboratories)
were used throughout the work. Two hundred µl per well were used to
coat the microtiter plates; all subsequent steps were conducted by using
190 µl per well. Likewise, all incubation steps were carried out at
4-5 ºC during 18 hr, and between incubation steps, three washings
with PBS-Tween were applied to the plates. The RbB227 coating
antibody was used at 3.0 µg ml-1 in carbonate buffer (0.015 M NaHCO3,
0.03 M NaCO3, pH 9.6). The mixture of 3DF1 and 3CA5 monoclonal
antibodies was used at 0.2 µg-1 ml in extracting buffer+0.02% bovine
serum albumin (BSA) (Sigma A9647). Goat anti mouse with alkaline
phosphatase (Sigma A4937) was used at a dilution of 1:30,000. At the
end of the test, 1 mg ml-1 of p-nitrophenyl phosphate (Sigma N2765)
in 10% triethanolamine, pH 9.8 was added. Negative controls included
PBS-Tween, extraction buffer, extraction buffer+0.02% BSA and
healthy extract tissue of Mexican lime grown in the greenhouse. Tissue
extract of Mexican lime, infected with the CTV isolates from Güémez,
Padrón-Chávez, J. E. y M. A. Rocha-Peña. 1993. Cómo colectar y preparar muestras de cítricos para el análisis del virus de la tristeza mediante
la técnica “ELISA”. Desplegable No. 12. Campo Experimental General Terán. INIFAP/SARH. México.
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AGROCIENCIA VOLUMEN 35, NÚMERO 4, JULIO-AGOSTO 2001
lavados de placas con PBS-Tween. El anticuerpo RbB227 de tapizado se utilizó a una concentración de 3.0 mg ml-1 disuelto en solución amortiguadora de carbonatos (0.015 M NaHCO3, 0.03 M NaCO3,
pH 9.6). La mezcla de anticuerpos monoclonales 3DF1 y 3CA5 se
utilizó a una concentración de 0.2 mg ml-1 en solución amortiguadora
de extracción+0.02% de albúmina de suero bovino (BSA) (Sigma
A9647). Como conjugado enzimático se utilizó anticuerpo de cabra
anti-ratón (Sigma A4937) en dilución 1:30,000. Al final de la prueba se añadió 1 mg ml-1 de p-nitrofenil fosfato (Sigma N2765) disuelto en 10% trietanolamina, pH 9.8. Como controles negativos se utilizaron PBS-Tween, solución de extracción, solución de extracción+0.02% de BSA y extractos de tejido sano de limón mexicano
crecido en invernadero. Como testigo positivo se utilizaron extractos de tejido de limón mexicano infectado con el aislamiento del
CTV de Güémez, Tamaulipas (Vela-Mancilla, 1984)7 mantenido en
invernadero. Las lecturas de densidad óptica a 405 nm (OD405) se
efectuaron en un espectrofotómetro BioTek Modelo EL311 después
de 30 a 60 minutos de reacción. Se consideraron como reacciones
positivas al CTV las que mostraron valores de OD405 mayores a 0.100
ó 3 veces el valor de la media mostrada por el tejido sano (testigo
negativo), el que fuera mayor.
En forma rutinaria, en todos lo casos en que se obtuvieron resultados positivos para la presencia del CTV en las muestras analizadas,
se llevó a cabo una segunda prueba de ELISA con las mismas muestras y se verificó una tercera vez con muestras colectadas de nuevo en
el campo. Para las pruebas serológicas con el anticuerpo monoclonal
MCA13 (Permar et al., 1990), se utilizó éste en dilución 1:5000 de
líquido de ascites en solución de extracción+0.02% BSA. El resto de
la prueba fue similar a lo descrito anteriormente.
Tamaulipas (Vela-Mancilla, 1984)7 was used as positive control.
Optical density readings at 405 nm (OD405) were conducted in a BioTek
Model EL311 plate reader after 30-60 min of reaction. Reactions were
considered positive to CTV when OD405 values were higher than 0.100
or three times the mean of healthy samples (negative controls),
whichever was greater.
Routinely, when a sample had a positive value for the presence of
CTV, a second ELISA test was made with the same sample, and the
result was verified a third time with fresh tissue collected from the
same tree in the field. Serological tests with MCA13 monoclonal
antibodies (Permar et al., 1990), were conducted with ascites fluid
diluted 1:5,000 in extraction buffer+0.02% BSA. The rest of the test
was as previously described.
Aphid sampling and identification
Aphid species and their seasonal fluctuations were determined
by using yellow water pan traps and collected directly from the
foliage. Initially four yellow traps were placed at 1.60 m height, at
four cardinal points at the General Terán Experimental Station of
INIFAP from March 1996 throughout May 1997. Afterwards, during
1997 and 1998 four yellow traps were placed in each grove under
study. Aphid specimens were preserved in alcohol and shipped to
the Entomology Laboratory of ENCB, where they were identified
using several taxonomic aphid keys (Peña-Martínez, 1992; Stoetzel,
1994) and verified by R. Peña-Martínez.
RESULTS
Spatial and temporal occurrence of CTV
Colecta e identificación de áfidos
Las especies de áfidos y su fluctuación poblacional se determinaron mediante trampas amarillas con agua y directamente sobre el follaje. Inicialmente se colocaron cuatro trampas amarillas a 1.60 m de
altura, que permanecieron ubicadas en cuatro puntos del Campo Experimental de General Terán, Nuevo León (INIFAP) de marzo de 1996
a mayo de1997. Posteriormente, durante 1997 y 1998 se colocaron
cuatro trampas amarillas en cada una de las huertas bajo estudio. Los
especímenes fueron conservados en alcohol y enviados al Laboratorio
de Entomología de la ENCB, donde fueron separados individualmente e identificados con diversas claves taxonómicas de áfidos (PeñaMartínez, 1992; Stoetzel, 1994) y confirmados por R. Peña-Martínez.
RESULTADOS
Ocurrencia del CTV en tiempo y espacio
Se partió de una ocurrencia inicial de plantas infectadas con CTV de 4.34% (34 de 783) para la huerta de
The spatial and temporal analyses started from an
initial CTV occurrence of 4.34% (34 out of 783) for the
Montemorelos grove, 0.02% (1 out of 4543) in
Hualahuises and of 0.70% (12 out of 1704) for Linares,
respectively (Rocha-Peña et al., 1996) (Table 1). In fall
1997, an additional infected tree was found in the
Montemorelos grove for an increase of 0.27% (Figure 1,
Table 1). In fall 1996, three additional infected trees and
one more in spring 1998 were found in the Linares grove,
giving an increase of 0.18 and 0.01% in three years
(Figure 2, Table 1). No additional infected tree was found
in the Hualauises grove. It is worth mentioning that in
the Linares grove, two of the three infected trees detected
in fall 1996, were actually reset nursery trees of
undetermided origin. The other two, the one detected in
fall 1996, as well as the one in spring 1998, were adult
trees. None of the disease syndromes associated to CTV
(Rocha-Peña et al., 1995) was noticed in any infected
tree, throughout the survey.
7
Vela-Mancilla, M. C. 1984. Detección del virus de la tristeza de los cítricos en los bancos de germoplasma de cítricos de México mediante la
técnica de inmunoadsorción ligada a enzima. Tesis Profesional. Químico Bacteriólogo Parasitólogo. Universidad Autónoma de Nuevo León.
Monterrey, México.
SILVA-VARA et al.: VIRUS DE LA TRISTEZA EN CÍTRICOS EN NUEVO LEÓN
Montemorelos, 0.02% (1 de 4543) para la de Hualahuises
y de 0.70% (12 de 1704) para la de Linares, respectivamente (Rocha-Peña et al., 1996)5 (Cuadro 1). En la huerta de Montemorelos en otoño de 1997 se encontró un
árbol infectado adicional a los anteriores, con un incremento de 0.27% (Figura 1, Cuadro 1). En la huerta de
Linares en otoño de 1996 se encontraron tres árboles infectados adicionales y uno más en la primavera de 1998
para un incremento del 0.18 y 0.01% en los tres años
(Figura 2, Cuadro 1). No se encontró ningún árbol adicional infectado en la huerta de Hualahuises. En el caso
particular de la huerta de Linares, dos de los tres árboles
que se encontraron infectados con CTV en el otoño de
1996, fueron replantes con árboles de vivero de los que
no fue determinado su origen. Los otros dos árboles, tanto el detectado en otoño de 1996, como en la primavera
de 1998, fueros árboles adultos. En ninguno de los árboles detectados CTV positivos durante el tiempo que duró
el presente estudio se detectó alguno de los síntomas asociados al CTV (Rocha-Peña et al., 1995).
Serología con el anticuerpo discriminatorio MCA13
La reacción al anticuerpo monoclonal MCA, tanto en
los árboles originalmente infectados como en los encontrados posteriormente, ocurrió en 34 de 35 para la huerta
de Montemorelos, cero de uno para la de Hualahuises, y
uno de 16 para la de Linares (Cuadro 2).
Identificación de áfidos
Se encontró un total de 39 especies de áfidos; sin embargo, en una primera etapa sólo se identificaron y cuantificaron a nivel de especie los ejemplares reportados
como vectores de virus y en particular para el CTV (Cuadro 3).
Entre las especies que se han reportado como vectores
del CTV a nivel mundial (Racaah et al., 1989; Roistacher
y Bar-Joseph, 1987) se encontraron con mayor
predominancia Aphis spiraecola Patch, A. gossypii Glover
Cuadro 1. Incremento en la ocurrencia del virus de la tristeza en
tres plantaciones comerciales de cítricos en el estado de
Nuevo León.
Table 1. Increase of the occurrence of citrus tristeza virus in three
commercial plantations in the state of Nuevo León.
Municipio
Montemorelos
Hualahuises
Linares
†
Inicial 1995†
1996
1997
1998
Total
34/783¶
1/4543
12/1704
0.0
0.0
0.18
0.27
0.0
0.0
0.0
0.0
0.01
0.27
0.0
0.19
Fuente: Rocha-Peña et al., 1996.
Los árboles infectados con CTV fueron eliminados de las plantaciones en el transcurso de 1996 c CTV infected trees were removed from
the groves during 1996.
¶
445
Serology with the discriminating antibody MCA13
The reactivity to the MCA monoclonal antibody in
originally infected CTV trees, as well as in the ones found
later, ocurred in 34 out of 35 for the Montemorelos grove,
0 out of one for Hualahuises, and one out of 16 for Linares
(Figure 2).
Aphid identification
Thirty-nine aphid species were found; however, in a
first stage, only those reported as virus vectors
(particularly of CTV) were quantified and identified at
species level (Table 3).
Aphid species reported as CTV vectors (Racaah et
al., 1989; Roistacher and Bar-Joseph, 1987) found in this
work, either in yellow traps or on the foliage, were
predominantly Aphis spiraecola Patch, A. gossypii Glover
y Toxoptera aurantii Boyer de Fonscolombe (Table 4).
04
03
02
01
1
2
3
4
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8
9
10
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L-A
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* * * * * * * * T * * * * * * * * 26
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27
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L-B
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29
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*******T*********
******T**********
*****************
*****************
***********T*****
*****************
*****T***********
***************T*
*******T*********
***************
*T*T***********
*************T*
***************
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
Figura 1. Distribución de árboles de cítricos infectados con el virus de la tristeza en una huerta de Montemorelos, Nuevo León. México. 1995-1998. Simbología: V T Otoño
1995; ? Primavera 1997; T? MCA-13 positivo. Las
hileras de árboles se identifican con números. L-A y L-B
indican las dos secciones en que está dividida la huerta.
Figure 1. Distribution of trees infected by citrus trizteza virus in a
grove in Montemorelos, Nuevo León. México. 1995-1998.
Symbols: V T Fall 1995; ? Spring 1997; T? MCA-13
positive. Tree rows are identified with numbers. L-A and
L-B are two divided sections of the grove.
446
AGROCIENCIA VOLUMEN 35, NÚMERO 4, JULIO-AGOSTO 2001
**********************************************
**********************************************
**********************************************
******T********************
***********
***************************
L-B
***********
***************************
***********
**********************************************
**********************************************
**********************************************
**********************************************
*********************************************
*********************************************
02
5
10
15
20
25
30
35
40
******************************************
V***V************************************
08 * * * * * V * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
07* * V * * * * * V * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
*************************************
06 * * * * * * * 8 * * ** * * * * * * * * * * * *
*****
* * * * * 8 ** * * * * * * * * * * * * * * * *
L-A
*****
************************
*****
05* V * * * * ** * * * * * * * * * * * { * * * * * * * * * * * * * *
*V******************************
04 * V * V * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
*******************************
*******************************
03 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
02 * * * * * * * 8 V * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
******************************
01 * * * * * * V * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
1
5
10
15
20
25
30
26
25
24
23
22
21
20
19
18
17
16
15
17
16
15
14
13
12
11
10
09
08
07
06
05
04
03
02
01
Figura 2. Distribución de árboles de cítricos infectados con el virus de la tristeza en una huerta de Linares, Nuevo León. México. 19951998. Simbología: VT Otoño 1995; 8 Otoño 1996; { Primavera 1998; T MCA-13 positivo. Las hileras de árboles se identifican
con números. L-A y L-B son las dos secciones en que está dividida la huerta.
Figure 2. Distribution of trees infected by citrus trizteza virus in a grove in Linares, Nuevo León. México. 1995-1998. Symbols: VT Fall
1995; 8 Fall 1996; { Spring 1998; T MCA-13 positive. Tree rows are identified with numbers. L-A and L-B are two divided
sections of the grove.
y Toxoptera aurantii Boyer de Fonscolombe (Cuadro 4),
tanto en las trampas amarillas como en el follaje. En ninguno de los muestreos realizados se detectó al pulgón
café Toxoptera citricida (Kirkaldy), que ha sido reportado como el vector con mayor eficiencia en la transmisión
del CTV (Rocha-Peña et al. 1995; Yokomi et al., 1994).
Las épocas de vuelo de las especies vectoras registradas se presentan en la Figura 3 para el periodo junio de
Cuadro 2. Reactividad de aislamientos del virus de la tristeza en
huertos de cítricos del estado de Nuevo León, México
con anticuerpo monoclonal MCA13 discriminatorio
para aislamientos del tipo declinamiento.
Table 2. Reactivity of citrus tristeza virus isolates of Nuevo León,
México with MCA13 monoclonal antibody discriminatory
for decline inducing isolates.
Municipio
Montemorelos
Hualahuises
Linares
Árboles
evaluados
783
4543
1704
Árboles CTV Árboles
MCA13
positivos
positivos
35
1
16
34
0
1
Árboles
porcentaje
97.1
0.0
6.2
The most efficient insect vector of CTV, the brown citrus
aphid, Toxoptera citricida (Kirkaldy) (Rocha-Peña et al.
1995; Yokomi et al., 1994) was not found in any of the
surveyed groves.
Aphid flight activity from June 1996 to May 1997
for those aphid species reported as CTV vectors is shown
in Figure 3. The lowest amounts of alate aphid trapped
occurred in June, where the highest temperatures are
recorded in the fields. Maximum counts were recorded
in September, even when some moderate rains occurred
(Figure 4). In the following months we had relatively
low but steady counts which increased in April and May
1997, when the minimum and maximum temperatures
were lower compared to the same months of the previous
year.
DISCUSSION
The results of this work (Table 1, Figures 1 and 2)
show remarkably low values in the occurrence and
dissemination of CTV in commercial citrus groves in the
state of Nuevo León, México.
SILVA-VARA et al.: VIRUS DE LA TRISTEZA EN CÍTRICOS EN NUEVO LEÓN
447
Cuadro 3. Géneros y especies de áfidos capturados en trampas amarillas en huertas de cítricos en el estado de Nuevo León, México. 19961998.
Table 3. Genera and species of aphids trapped in yellow water pan traps in citrus groves in Nuevo León, México. 1996-1998.
Géneros
Especies
Amphorophora Buckton 1876 (1 sp.)
Chaitophorus Koch 1854 (1 sp.)
Illinoia Wilson 1910 (1 sp.)
Pemphigus Harting 1839 (1 sp.)
Tinocallis Matsumura 1919 (1 sp.)
Uroleucon Mordvilko 1914 (3 spp.)
Aphis coreopsidis (Thomas 1878).
A. fabae Scopoli 1763
†
A. gossypii Glover 1877
A. nerii Boyer de Fonscolombe 1841
A. sambuci Linnaeus 1758
†
A. spiraecola Patch 1914
A. middletoni Thomas 1879
Geopemphigus floccosus (Moreira, 1925)
Hyalopterus pruni (Geoffroy, 1762)
Rhopalosiphum maidis (Fitch, 1856)
R. padi (Linnaeus 1758)
R. rufiabdominale (Sasaki, 1899)
Schizaphis graminum (Rondani, 1847)
Aulacorthum solani (Kaltenbach 1843)
Brachycaudus rumexicolens (Patch 1917)
Brevicoryne brassicae (Linnaeus 1758)
Capitophorus elaeagni del Guercio 1894
Hayhurstia atriplicis (Linnaeus 1761)
Hyperomyzus lactucae (Linnaeus 1758)
Lipaphis erysimi (Kaltenbach 1843)
Macrosiphum euphorbiae (Thomas 1878)
Monelliopsis nigropunctata (Granovsky 1931)
Myzus ornatus Laing 1932
M. persicae (Sulzer 1776)
Sitobion avenae (Fabricius 1775)
Sipha flava (Forbes 1884)
Tetraneura nigriabdominalis (Sasaki 1899)
†
Toxoptera aurantii Boyer de Fonscolombe 1841
Especies vectoras de CTV c CTV vector species.
1996 a mayo de 1997. La época de mínimas capturas de
alados se registró en el mes de junio, periodo en el que
se registran las máximas temperaturas en campo. Las
máximas capturas se registraron en septiembre, aún con
presencia de lluvias (Figura 4); en los meses siguientes
se mantuvieron en niveles bajos pero sostenidos y aumentaron en abril y mayo de 1997, cuando las temperaturas máximas y mínimas fueron menores comparadas
con las correspondientes del año anterior.
500
A. spiraecola
A. gossypii
450
400
Número
†
350
300
250
200
Especies
Aphis spiraecola†
Toxoptera aurantii†
Aphis gossypii†
Otras especies
†
Abundancia
Trampas amarillas
++++
+++
++
++++++
150
100
50
++++
+++
++
------
Vectores del virus de la tristeza (Racaah et al., 1989; Roistacher y
Bar-Joseph, 1987) c Vectors of citrus tristeza virus.
May.
Abr.
Mar.
Feb.
Dic.
1996
Follaje
Ene.
Nov.
Oct.
Sep.
Ago.
Jul.
0
Jun.
Cuadro 4. Abundancia de áfidos caputados en trampas amarillas
y en el follaje en huertas de cítricos en el estado de Nuevo León, México. 1996-1998.
Table 4. Relative abundance of aphids trapped in yellow water
pan traps and on the foliage in citrus groves of Nuevo
León, México. 1996-1998.
1997
Meses
Figura 3. Épocas de vuelo de las especies de áfidos vectores del
virus trizteza de los cítricos asociados al cultivo de los
cítricos. General Terán, Nuevo León. México, Marzo
1996-Mayo 1997.
Figure 3. Seasonal flights of citrus tristeza virus aphid vector
species associated to citrus. General Terán, Nuevo León,
México. Marzo 1996-Mayo 1997.
448
AGROCIENCIA VOLUMEN 35, NÚMERO 4, JULIO-AGOSTO 2001
40
6
5
30
4
25
20
3
15
2
10
Precipitación en mm
Temperatura en o C
35
1
5
0
Ene.
Feb.
Mar.
Abr.
May.
Jun.
Jul.
Ago.
Sep.
Oct.
Nov.
Dic.
Ene.
Feb.
Mar.
Abr.
May.
0
1996
Precipitación
1997
Meses
Temp. máxima
Temp. mínima
Figura 4. Variación de la temperatura y precipitación en General
Terán, Nuevo León. México, Enero 1996-Mayo 1997.
Figure 4. Temperature and rainfall variation in General Terán,
Nuevo León, México. Enero 1996-Mayo 1997.
DISCUSIÓN
Los resultados obtenidos (Cuadro 1, Figuras 1 y 2)
muestran valores notoriamente bajos de ocurrencia y diseminación del CTV en plantaciones comerciales de cítricos del estado de Nuevo León, México.
La baja diseminación observada durante los tres años
que duró el presente estudio en las huertas de
Montemorelos y Linares, puede ser debido que en el transcurso de 1996 el Gobierno Federal llevó a cabo actividades de eliminación de las plantas CTV positivas en las
huertas de Montemorelos y Linares como consecuencia
de las detecciones efectuadas en 1995 (Rocha-Peña et
al., 1996)5. Lo anterior debe haber influido en gran medida en la baja diseminación observada (Cuadro 1, Figuras 1 y 2), en 1997 y 1998 posteriores a la acción de
erradicación. Lo anterior está fundamentado en los programas de erradicación que se han llevado a cabo en otros
países, donde se ha documentado que cuando la ocurrencia del virus es inferior a 5%, las campañas de eliminación de árboles infectados reducen considerablemente las
tasas de diseminación del virus en el campo (Polek, 2000).
Otra posible explicación de la baja ocurrencia y diseminación podría ser una baja transmisibilidad por áfidos
de los aislamientos del CTV encontrados. Existen reportes en varios lugares del mundo donde infecciones localizadas del CTV a nivel de campo se han mantenido sin
transmisión natural por áfidos durante largos periodos
(Cartia et al., 1980) y hasta por 18 años (Ebrahimi et al.,
1988). No obstante lo anterior, la presencia de los áfidos
Aphis gossypii, A. spiraecola, y Toxoptera aurantii encontrados en las plantaciones de cítricos en el estado de
Nuevo León no debe subestimarse. En otras áreas
The low dissemination observed during three years
in the Montemorelos and Linares groves, may be mainly
due to the tree removal measures applied by the Federal
Government in 1996, on CTV-positive samples detected
in a 1995 survey (Rocha-Peña et al., 1996)5. Those
measures probably influenced to some extent the low
dissemination observed (Table 1, Figures 1 and 2) in 1997
and 1998, after the eradication measures. Monitoring
and tree removal campaigns conducted in other countries
have been shown to dramatically reduce the dissemination
rates when CTV field occurrence is lower than 5% (Polek,
2000).
Another possibility of the low occurrence and
dissemination could be a low transmissibility by aphids
of the CTV isolates found in this study. There are several
reports of CTV infections, confined to certain areas where
there has not occurred natural transmission by aphids for
long periods (Cartia et al., 1980) and up to 18 yrs in the
field, (Ebrahimi et al., 1988). Nevertheless, the presence
of aphid species such as Aphis gossypii, A. spiraecola,
and Toxoptera aurantii found in the commercial groves
in the state of Nuevo León should not be underestimated.
In some citrus areas of the world (e.g. California, Florida,
Spain, and Israel), where periodic CTV outbreaks occur,
Aphis gossypii has been considered as the primary vector
of the virus (Bar-Joseph and Loebenstein, 1973;
Roistacher et al., 1984; Yokomi and Garnsey, 1987).
Likewise, A. spiraecola (Hermoso de Mendoza et al.,
1984; Yokomi and Oldfield, 1991; Smith and Farrald,
1988) has been regarded an important CTV vector for
some citrus areas of the world.
The random distribution of the CTV infected trees in
the Montemorelos and Linares groves, of the CTV-infected
trees initially detected in 1995, as well as that shown by
the additional infected trees found during 1996-1998
(Figures 1 and 2), supports a possible horizontal
dissemination by aphids. This type of distribution, with a
predominance of CTV-infected trees widely spaced among
them is similar to distribution patterns in groves where
Aphis gossypii is the primary vector of the virus (Gottwald
et al., 1996a, 1996b). This situation apparently is due to
the flight patterns of this species, which flies from a tree to
trees at relatively short distances (Gottwald et al., 1996b).
Nevertheless, the positive reactivity to MCA13
monoclonal antibody of 35 out of the total of the 52 CTV
infected trees, which indicates the presence of declining
type CTV isolates, none of the disease syndromes
associated to CTV was noticed in any of the CTV- positive
trees in the field. However, the presence of CTV should
not be underestimated, for even if all CTV- infected trees
were removed, there is a possibility that some other citrus
groves in the State, particularly those near the groves
under study, could have trees infected with MCA13
positive CTV isolates, similar to those found in this work.
SILVA-VARA et al.: VIRUS DE LA TRISTEZA EN CÍTRICOS EN NUEVO LEÓN
citrícolas del mundo (e.g. California, Florida, España e
Israel) con epifitias recurrentes por el CTV, se ha señalado a Aphis gossypii como el vector primario del virus
(Bar-Joseph y Loebenstein, 1973; Roistacher et al., 1984;
Yokomi y Garnsey, 1987). Asimismo, se ha consignado
A. spiraecola (Hermoso de Mendoza et al., 1984; Yokomi
y Oldfield, 1991; Smith y Farrald, 1988) como vector de
importancia del CTV para algunas áreas citrícolas del
mundo.
La distribución al azar de los árboles infectados con
CTV dentro de las huertas de Montemorelos y Linares,
tanto en los originalmente encontrados en 1995, como la
mostrada por los árboles adicionales encontrados de 1996
a 1998 (Figuras 1 y 2), apoya la posible diseminación
horizontal por áfidos. Este tipo de distribución, con predominio de árboles CTV positivos distantes entre sí, es
similar a los patrones de distribución en huertas en donde Aphis gossypii es el vector primario del virus (Gottwald
et al., 1996a, 1996b). Lo anterior se debe aparentemente
a los patrones de vuelo de esta especie, que consisten en
viajar distancias relativamente cortas entre árboles distantes entre sí (Gottwald et al., 1996b).
No obstante la reacción positiva al anticuerpo
monoclonal MCA13 en 35 del total de los 52 árboles
infectados con CTV, que indica la presencia de aislamientos del tipo declinamiento del virus, ninguno de los síntomas asociados al CTV se observaron a nivel de campo
en los árboles CTV positivos. Lo anterior también se debe
tomar con reserva, pues aunque los árboles mencionados
ya fueron eliminados, es probable que otras huertas en el
Estado, particularmente las adyacentes a las incluídas en
el presente estudio, puedan tener árboles infectados con
aislamientos MCA13 positivos similares a los aquí encontrados. Está bien documentada la posible ocurrencia
de aislamientos extremadamente severos del CTV, ya sea
del tipo declinamiento o picado de tallo o de ambos, aún
en plantas injertadas sobre naranjo agrio (Rocha-Peña et
al., 1995; Roistacher et al., 1991; Bar-Joseph, 1978). Después de mantenerse en forma latente durante periodos
prolongados, las infecciones empiezan a hacerse evidentes mediante la aparición de epifitias recurrentes ocasionadas por transmisión por insectos, particularmente A.
gossypii. (Bar-Joseph, 1978; Roistacher y Bar-Joseph,
1987; Roistacher et al., 1980).
El análisis global de los resultados obtenidos (baja
ocurrencia y diseminación del virus), indican que la estrategia adecuada para el manejo fitosanitario integrado
del CTV en Nuevo León es la prospección y subsecuente
eliminación de árboles infectados con CTV. Asimismo,
es probable que los aislamientos que dieron reacción negativa al anticuerpo monoclonal MCA13, encontrados en
su mayoría en la huerta de Linares, sean del tipo débil y
podrían ser evaluados en ensayos futuros de protección
cruzada.
449
The frequent occurrence of severe induced decline or stem
pitting CTV isolates in a latent condition is well
documented, even in plants grafted on sour orange
rootstock (Rocha-Peña et al., 1995; Roistacher et al.,
1991; Bar-Joseph, 1978). After a prolonged lag period,
latent CTV infections become evident by the occurrence
of recurrent outbreaks, caused by insect transmission,
particularly A. gossypii. (Bar-Joseph, 1978; Roistacher
and Bar-Joseph, 1987; Roistacher et al., 1980).
Overall, the results of low CTV occurrence and
dissemination, indicate that the appropriate strategy for
integrated phyto-sanitary management in Nuevo Leon is
the monitoring and subsequent removal of CTV-infected
trees. Likewise, it is likely that CTV isolates that were
MCA 13 negative, mostly found in the Linares grove, are
mild CTV isolates and could be evaluated in future cross
protection studies.
CONCLUSIONS
Based on the results obtained in this work, the
following conclusions can be established:
CTV increase average in three years in the
Montemorelos, Hualahuises and Linares groves was 0.27,
0.0 and 0.18 respectively.
Distribution of CTV-infected plants detected later,
indicates a possible partial dissemination by aerial vectors.
None of the disease syndromes associated to CTV
was noticed in any of CTV infected trees.
Serological characterization of the CTV isolates
indicates the presence of decline-inducing CTV isolates.
Aphid species identified were similar to those
prevailing in most citrus areas of the world where
Toxoptera citricida is not yet present.
—End of the English version—
CONCLUSIONES
Con base en los resultados obtenidos en el presente
estudio, se tienen las siguientes conclusiones:
El porcentaje de incremento del CTV en tres años en
las huertas de Montemorelos, Hualahuises y Linares fue
de 0.27, 0.00 y 0.18 respectivamente.
La distribución de plantas infectadas con CTV encontradas posteriormente indica una posible diseminación parcial por vectores aéreos
En ninguna de las plantas CTV positivas se encontraron síntomas asociados con la enfermedad.
La caracterización serológica de los aislamientos indica la presencia de aislamientos del CTV del tipo
declinamiento.
450
AGROCIENCIA VOLUMEN 35, NÚMERO 4, JULIO-AGOSTO 2001
Las especies de áfidos identificadas son similares a
las existentes en la mayoría de las áreas citrícolas del
mundo donde aún no está presente Toxoptera citricida.
AGRADECIMIENTOS
El presente proyecto de investigación recibió apoyo financiero de
la Fundación Produce Nuevo León, A.C., No. 1322. Los autores agradecen el apoyo técnico de Aurelio Navarro-Jáuregui y Antonio SánchezSobrevilla. Contribución INIFAP/CIRNE A-144.
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