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OFICINA ESPAÑOLA DE
PATENTES Y MARCAS
11 Número de publicación: 2 198 404
51 Int. Cl. : C12N 5/00
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C12N 5/06
A61K 35/30
ESPAÑA
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TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA
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86 Número de solicitud europea: 92914286.7
86 Fecha de presentación: 07.07.1992
87 Número de presentación de la solicitud: 0594669
87 Fecha de publicación de la solicitud: 04.05.1994
54 Título: Células progenitoras neurales que responden a factor de crecimiento y que se pueden hacer proliferar
in vitro.
30 Prioridad: 08.07.1991 US 726812
73 Titular/es: NEUROSPHERES HOLDINGS, LTD.
83 Heritage Medical Research Center, 3330
Hospital Drive N.W
Calgary Alberta T2N 4N1, CA
45 Fecha de publicación de la mención BOPI:
01.02.2004
72 Inventor/es: Weiss, Samuel y
Reynolds, Brent, A.
45 Fecha de la publicación del folleto de la patente:
74 Agente: Elzaburu Márquez, Alberto
ES 2 198 404 T3
01.02.2004
Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de
la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea
de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se
considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del
Convenio sobre concesión de Patentes Europeas).
Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid
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DESCRIPCIÓN
Células progenitoras neurales que responden a
factor de crecimiento y que se pueden hacer proliferar
in vitro.
Esta invención se refiere a un método para el cultivo in vitro de células progenitoras neurales, y al uso
de estas células como injertos de tejidos. En un aspecto, esta invención se refiere a un método para el
aislamiento y la perpetuación in vitro de grandes números de células progenitoras neurales no tumorales,
que se pueden inducir a diferenciarse y que se pueden
utilizar para neurotransplantes en un animal para aliviar los síntomas de enfermedades neurológicas, neurodegeneración y traumas del sistema nervioso central (CNS, por sus siglas en inglés). En otro aspecto,
esta invención se refiere a un método de generar células nerviosas con el objeto de buscar entre diversos
medicamentos agentes terapéuticos supuestos dirigidos al sistema nervioso. En otro aspecto, esta invención se refiere también a un método de generar células para transplantes autólogos. En otro aspecto, la
invención se refiere a un método para la proliferación
y diferenciación in situ de las células progenitoras en
el receptor.
El desarrollo del sistema nervioso comienza en un
estado temprano del desarrollo fetal. La neurogénesis, la generación de nuevas neuronas, se completa de
manera temprana en el periodo post-natal. Sin embargo, se alteran continuamente las conexiones sinápticas implicadas en los circuitos neurales durante la vida del individuo, debido a la plasticidad sináptica y a
la muerte celular.
La primera etapa en el desarrollo neural es el nacimiento de la célula, que es la secuencia precisa temporal y espacial, en la cual las células precursoras
o progenitoras proliferan y se diferencian. Las células proliferantes darán origen a los neuroblastos, glioblastos y células madre.
La segunda etapa es un periodo de diferenciación
del tipo celular y migración cuando las células progenitoras se hacen neuronas y células gliales y migran a
sus posiciones finales. Las células que se derivan del
tubo neural dan origen a neuronas y glia del sistema
nervioso central (CNS), mientras que las células derivadas de la cresta neural dan origen a las células del
sistema nervioso periférico (PNS, por sus siglas en
inglés). Ciertos factores presentes durante el desarrollo, tales como el factor del crecimiento de los nervios
(NGF, por sus siglas en inglés), promueven el crecimiento de las células neurales. Se segrega NGF por
células de la cresta neural y estimula la ramificación
y crecimiento de los axones neurales.
La tercera etapa en el desarrollo sucede cuando
las células adquieren cualidades fenotípicas específicas, tales como la expresión de neurotransmisores
particulares. En este momento, las neuronas extienden también ramificaciones que se unen por sinapsis
a sus dianas. Las neuronas no se dividen después de
la diferenciación.
Finalmente, ocurre la muerte celular selectiva, en
la que la degeneración y muerte de células específicas,
fibras y conexiones sinápticas “ajustan finamente” los
circuitos complejos del sistema nervioso. Este “ajuste
fino” continúa durante toda la vida del receptor. Más
tarde en la vida, la degeneración selectiva debida al
envejecimiento, infecciones y otras etiologías desconocidas pueden llevar a enfermedades neurodegene2
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rativas.
El tratamiento de enfermedades degenerativas ha
llegado a ser un asunto principal en los últimos años,
debido a la creciente población mayor, que se encuentra en el mayor riesgo de estas enfermedades. Estas enfermedades, que comprenden la enfermedad de
Alzheimer, corea de Huntington y la enfermedad de
Parkinson, se han relacionado con la degeneración de
neuronas en lugares específicos del cerebro, que lleva a la incapacidad de la región cerebral para sintetizar y liberar neurotransmisores, que son vitales para
las señales neuronales. La esquizofrenia es otra enfermedad que se piensa que ocurre debido a la falta de
neurotransmisores.
La neurodegeneración también comprende esos
estados y enfermedades que dan como resultado
pérdida neuronal. Estos estados pueden comprender
aquellos que se originan como resultado de traumas
del CNS, incluyendo apoplejía y epilepsia. Otras enfermedades, tales como esclerosis lateral amiotrófica
y parálisis cerebral pueden dar también como resultado pérdida neuronal. A causa de la falta de entendimiento de las interacciones entre áreas específicas
del cerebro, y de cómo estas interacciones generan
las manifestaciones externas de sus funciones, es difícil el tratamiento de la degeneración del CNS. Se han
hecho más difíciles los estudios de las interacciones
celulares internas y su efecto en la conducta y funciones cognoscitivas, debido al gran número de células y
a los circuitos neurales complejos que ellas forman.
El objetivo de la mayoría de las terapias del CNS
es recuperar la función química particular o la actividad enzimática que se pierde debido a la degeneración
celular.
La degeneración en una región cerebral conocida
como los ganglios basales puede llevar a enfermedades con diferentes síntomas cognoscitivos y motores,
dependiendo de la exacta localización. Los ganglios
basales consisten en muchas regiones separadas, comprendiendo el cuerpo estriado (que consiste en el caudado y el putamen), el globus pallidus, la sustancia
negra, sustancia innominada, pallidum ventral, núcleo
basal de Meynert, área tegmental ventral y el núcleo
subtalámico.
En el caso de la enfermedad de Alzheimer, existe
una degeneración celular profunda del prosencéfalo y
de la corteza cerebral. Además, después de una inspección más detallada, una degeneración localizada
en un área de los ganglios basales, el núcleo basal de
Meynert, parece que está degenerado de manera selectiva. Normalmente, este núcleo envía proyecciones
colinérgicas a la corteza cerebral, que se piensa que
participan en funciones cognoscitivas incluyendo la
memoria.
Muchas deficiencias motoras son un resultado de
la degeneración en los ganglios basales. El corea de
Huntington está asociado con la degeneración de las
neuronas en el cuerpo estriado, lo que lleva a movimientos involuntarios espasmódicos en el paciente.
La degeneración de una pequeña región llamada el
núcleo subtalámico se asocia con movimientos violentos en saltos de las extremidades en un estado llamado balismo, mientras que la degeneración en el putamen y en el globus pallidus se asocian con un estado
de movimientos lentos de retorcimiento o atetosis. En
el caso de la enfermedad de Parkinson, se ve la degeneración en otra área de los ganglios basales, la par
compacta de la sustancia negra. Normalmente, esta
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área envía conexiones dopaminérgicas al cuerpo estriado dorsal, que son importantes para regular el movimiento. La terapia de la enfermedad de Parkinson se
ha centrado en restablecer la actividad dopaminérgica
en este circuito.
Pueden ocurrir otras formas de lesión neurológica
como un resultado de la degeneración neural, tal como esclerosis lateral amiotrófica y parálisis cerebral,
o como un resultado de traumas del CNS, tal como
apoplejía y epilepsia.
Actualmente, el tratamiento de la disfunción del
CNS se ha hecho principalmente mediante la administración de composiciones farmacéuticas. Desgraciadamente, este tipo de tratamiento lleva consigo muchas complicaciones incluyendo la capacidad limitada de transportar medicamentos a través de la barrera sangre-cerebro, y la tolerancia a los medicamentos
que se adquiere por pacientes a los cuales se les ha
administrado estos medicamentos durante largo tiempo. Por ejemplo, el restablecimiento parcial de la actividad dopaminérgica en los pacientes con Parkinson
se ha conseguido con levodopa, que es un precursor
de dopamina capaz de cruzar la barrera sangre-cerebro. Sin embargo, los pacientes se hacen tolerantes a
los efectos de levodopa, y por tanto, se necesitan dosis constantemente crecientes para mantener sus efectos. Actualmente no existen tratamientos farmacéuticos eficaces contra la enfermedad de Alzheimer.
Recientemente, se ha aplicado el concepto de injerto de tejido neurológico al tratamiento de enfermedades neurológicas, tal como la enfermedad de Parkinson. Los injertos neurales pueden evitar la necesidad no solamente de la administración constante de
medicamentos, sino también los sistemas complicados de suministro de medicamentos, que se realizan
debido a la barrera sangre-cerebro. Sin embargo, también hay limitaciones a esta técnica. Primero, las células utilizadas para el transplante, que llevan moléculas de la superficie celular de una célula diferenciada de otra persona, pueden inducir una reacción inmune en el paciente. Además, las células deben estar
en un estado de desarrollo que sean capaces de formar conexiones neurales normales con las células vecinas. Por estas razones, los estudios iniciales sobre
neurotransplantes se centraron en el uso de células fetales. Perlow, et al. Describen el transplante de neuronas dopaminérgicas fetales en ratas adultas con lesiones químicamente inducidas en la sustancia negra
y en el cuerpo estriado en “Brain grafts reduce motor
abnormalities produced by destruction of nigrostriatal
dopamine system”, Science 204: 643-647 (1979). Estos injertos mostraron buena supervivencia, desarrollo
axónico y reducían significativamente las anormalidades motoras en los animales hospedadores. Lindvall,
et al., en “Grafts of fetal dopamine neurons survive
and improve motor function in Parkinson’s Disease”,
Science 247: 574-577 (1990), mostraban que el transplante neural de neuronas de dopamina mesencefálicas fetales humanas puede restaurar la síntesis y el
almacenamiento de dopamina, y reducir la rigidez y
bradiquinesia en pacientes que sufren de la enfermedad de Parkinson. Freed, et al. en “Transplantation of
human fetal dopamine cells for Parkinson’s Disease”
Arch. Neurol. 47: 505-512 (1990) mostraban también
una mejora en un paciente que recibió un transplante
fetal.
Las referencias anteriores describen que el tejido
cerebral fetal de mamíferos tiene buenas caracterís-
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ticas de supervivencia después del transplante inmediato. Se piensa que la capacidad aumentada de supervivencia de las neuronas fetales es debida a la susceptibilidad reducida de las neuronas fetales a la anoxia con respecto a las neuronas adultas, y también a
la falta de marcadores de la superficie celular en las
células fetales, cuya presencia puede conducir al rechazo del tejido injertado procedente de adultos. Sin
embargo, aunque se considera que el cerebro un lugar inmunológicamente privilegiado, pueden suceder
algunos rechazos del tejido fetal. Por tanto, está limitada la capacidad de utilizar tejido fetal, no solamente
debido al rechazo por el tejido del tejido fetal aislado
de otro paciente, y a causa de la necesidad resultante de medicamentos inmunosupresores, sino también
debido a los problemas éticos de obtener tejido fetal.
Sin embargo, el tejido de cerebro de neonato posee
una capacidad limitada de supervivencia y las neuronas del CNS del mamífero adulto generalmente no
sobreviven al transplante en el cerebro.
Aunque las neuronas del CNS adulto no son buenas candidatas para el neurotransplante, se ha visto
que las neuronas del sistema periférico adulto (PNS)
sobreviven al transplante, y que ejercen efectos neurotróficos y gliotróficos en el desarrollo del tejido neural
del receptor. Un origen del tejido neural que no sea
de CNS para transplantes es la médula adrenal. Las
células cromafines adrenales se originan de la cresta neural como las neuronas del PNS, y reciben sinapsis y producen proteínas portadoras y enzimáticas
similares a las neuronas del PNS. Aunque estas células funcionan de una manera endocrina en la médula
adrenal intacta, en cultivo estas células pierden su fenotipo glandular y desarrollan características neurales
en cultivo en presencia de ciertos factores y hormonas
de crecimiento (Notter, et al., “Neuronal properties of
monkey adrenal medulla in vitro”, Cell Tissue Research 244: 69-76 [1986]). Cuando se injertan en el
CNS de mamíferos, estas células sobreviven y sintetizan cantidades significativas de dopamina que pueden interactuar con los receptores de dopamina de las
áreas próximas del CNS.
En la patente de EE.UU. Nº 4.980.174, el transplante de células conteniendo monoamina aisladas de
la glándula pineal y médula adrenal de ratas adultas en
corteza frontal de rata llevaba a la mejora del desvalimiento aprendido, una forma de depresión en el receptor. En la patente de EE.UU. Nº 4.753.635, se implantaron células cromafines y tejido medular adrenal
derivado de bueyes en la base del cerebro o médula espinal de ratas y produjeron analgesia cuando se indujo
al tejido o célula implantada a que liberara sustancias
interactivas nociceptoras (p. ej. catecolaminas, tales
como dopamina). Se han implantado de forma autóloga células medulares adrenales en seres humanos, y
han sobrevivido, causando mejoras de suaves a moderadas en los síntomas (Watts, et al., “Adrenal-caudate transplantation in patients with Parkinson’s Disease (PD): 1-year follow-up”, Neurology 39 Suppl
1: 127 [1989], Hurtig, et al.. “Post-mortem analysis
of adrenal-medulla-to-caudate autograft in a patient
with Parkinson’s Disease”, Annals of Neurology 25:
607-614 [1989]). Sin embargo, las células adrenales
no obtienen un fenotipo neural normal, y son probablemente, por tanto, de uso limitado para transplantes
donde se deban formar conexiones sinápticas.
Otro origen de tejidos para neurotransplantes es
el procedente de líneas celulares. Las líneas celulares
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son células inmortalizadas que se derivan o por transformación de células normales con un oncogen (Cepko, “Inmortalization of neural cells via retrovirus-mediated oncogene transduction”, Ann. Rev. Neurosci.
12: 47-65 [1989]) o mediante el cultivo de células con
características alteradas de crecimiento in vitro (Ronnett, et al., “Human cortical neuronal cell lline: Establishment from a patient with unilateral megalencephaly”, Science 248: 603-605 [1990]). Se pueden hacer crecer tales células en cultivo en grandes cantidades para utilizarse para transplantes múltiples. Se ha
visto que algunas líneas celulares se diferencian después de tratamiento químico para expresar una variedad de propiedades neuronales, tales como formación
de la neurita, membranas excitables y síntesis de neurotransmisores y sus receptores. Aún más, después de
la diferenciación, estas células parece que son amitóticas, y, por tanto, no cancerosas. Sin embargo, el
potencial de estas células de inducir respuestas inmunes adversas, el uso de retrovirus para inmortalizar
células, el potencial para la reversión de estas células a un estado amitótico, y la falta de respuesta de
estas células a las señales normales de inhibición del
crecimiento, hacen a estas líneas celulares menos que
óptimas para su uso extendido.
Reynolds et al., Soc. Neurosci. Abstracts, vol 15,
oct./nov. 1990, Abstr. Nº 474.2 describe los efectos
de EGF o TGF-α en un cultivo primario de células
progenitoras de CNS embrionario.
Otra aproximación al neurotransplante implica el
uso de tipos de células genéticamente modificadas o
terapia génica. Utilizando este método, se puede introducir un gen extraño o transgénico en una célula
que es deficiente con respecto a una actividad enzimática en particular, restableciendo por tanto la actividad. Las células que contienen entonces el gen
transferido se pueden transplantar al lugar de la neurodegeneración, y proporcionar productos, tales como
neurotransmisores y factores de crecimiento (Rosenberg, et al., “Grafting genetically modified cells to the
damaged brain: Restorative effects on NGF Expresión”, Science 242: 1575-1578, [1988]), que pueden
funcionar para aliviar algunos de los síntomas de la
degeneración. Sin embargo, sigue existiendo el riesgo
de inducir una reacción inmune con estas células y la
transferencia mediada por retrovirus puede dar como
resultado otras anormalidades celulares. Se ha visto
también, que las líneas celulares producidas por transferencia génica mediada por retrovirus inactivan gradualmente sus genes transferidos después del transplante (Palmer, et al. “Genetically modified skin fibroblasts persist long after transplantation but gradually
inactivate introduced genes”, Proc. Natl. Acad. Sci.
88: páginas 1330-1334 [1991]). Además, estas células puede que no consigan las conexiones neuronales
normales con el tejido receptor.
La incapacidad en el estado anterior de la técnica
de los transplantes de integrarse totalmente en el tejido del receptor, y la falta de disponibilidad de células
en cantidades ilimitadas de un origen seguro para injertos son, quizás, la limitación mayor de los neurotransplantes.
Por tanto, en vista de las deficiencias antes mencionadas con respecto a los métodos del estado anterior de la técnica del cultivo y transplante de células
neurales, debería ser aparente de que todavía existe
una necesidad en la técnica de un origen seguro de
números ilimitados de células para neurotransplantes,
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que sean capaces de diferenciarse en neuronas. Aún
más, dado que se pueden rechazar inmunológicamente células de donante heterólogo, existe ahí una necesidad de aislamiento, perpetuación y transplante de
progenitores autólogos a partir del cerebro juvenil o
adulto, que sean capaces de diferenciarse en neuronas. Además, existe una necesidad de reparación de
tejido neuronal dañado de una manera relativamente
no invasiva, es decir, mediante la inducción de células
progenitoras para proliferar y diferenciarse en neuronas in situ.
Por tanto, un objeto principal de la presente invención es proporcionar un origen seguro de un número
ilimitado de células para neurotransplantes, que sean
capaces de diferenciarse en neuronas.
Es otro objeto de la presente invención proporcionar un método para la proliferación in vitro de células progenitoras neurales a partir de cerebro juvenil
y adulto, para diferenciación de estos progenitores en
neuronas, y para neurotransplante de las células progenitoras en un receptor heterólogo o autólogo. Se
puede inducir también a las células progenitoras para que proliferen y se diferencien in situ evitando de
esta manera la necesidad de un transplante.
Otro objeto de la invención es proporcionar un
método de generar células nerviosas con el propósito de buscar agentes terapéuticos supuestos dirigidos
al sistema nervioso.
Tal como aquí se describe, la presente invención
se refiere a un método para la producción in vitro de
un cultivo celular de células madre neurales pluripotentes, comprendiendo dicho método las etapas de:
(a) preparar o proporcionar un medio de cultivo inicial que comprende uno o más factores de crecimiento capaces de inducir la proliferación de células madre
neurales pluripotentes; (b) preparar un cultivo celular
mediante la adición al medio de cultivo de la etapa (a)
de células derivadas de tejido neural de mamíferos y
conteniendo al menos una célula madre neural pluripotente capaz de dividirse sin límite y producir progenie que es capaz de diferenciarse en neuronas y glia;
(c) hacer proliferar dicha célula madre neural pluripotente en dicho medio de cultivo celular para producir
progenie de células madre neurales que comprenda
células madre neurales pluripotentes hijas y células
hijas que son capaces de diferenciarse en neuronas y
glia; y (d) transferir dicha progenie de células madre
neurales a un medio de cultivo nuevo que contiene
uno o más factores de crecimiento capaces de inducir
la proliferación de las células madre neurales pluripotentes para hacer que proliferen dichas células madre
neurales pluripotentes hijas y para producir más progenie de células madre neurales.
En una realización preferida, la invención proporciona un método para la producción in vitro de un cultivo celular de células madre neurales pluripotentes,
tal como se describe anteriormente, en el que la proliferación de dicha célula madre neural pluripotente
en la etapa (c) o dichas células madre neurales pluripotentes hijas en la etapa (d) sucede en un cultivo en
suspensión o en un cultivo fijado a un sustrato.
Además, la invención proporciona un método tal
como se describe anteriormente, en el que dicho método comprende la perpetuación de células madre
neurales pluripotentes mediante el reinicio de la proliferación de las células madre neurales pluripotentes
hijas en la etapa (d) mediante la repetición de la etapa
(d).
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En una realización preferida del método de la invención, dicho tejido neural de mamífero proviene de
un ser humano. Lo más preferiblemente, dicho tejido neural de mamífero proviene de un feto, neonato,
juvenil o adulto.
Se prefiere que los métodos de cultivo utilizados
en las etapas (a) y (d) del método de la invención estén sin suero.
En la realización más preferida del método de la
invención, dichos uno o más factores de crecimiento
se seleccionan del grupo que consiste en factor ácido
de crecimiento de fibroblastos, factor básico de crecimiento de fibroblastos, factor de crecimiento epidérmico, un ligando similar a EGF, anfirregulina y factor
alfa de crecimiento de transformación.
Preferiblemente, dicho medio de cultivo inicial de
la etapa (a) y dicho medio de cultivo reciente de la etapa (d) del método de la invención contienen el mismo
o mismos factores de crecimiento.
Se prefiere también en el método de la invención
que dicho medio de cultivo nuevo de la etapa (d) contenga uno o más factores de crecimiento diferentes de
dicho uno o más factores de crecimiento de dicho medio de cultivo inicial de la etapa (a).
En otra realización, la presente invención proporciona un método para producir in vitro células neurales diferenciadas derivadas de la progenie de células madre neurales producida mediante el método
inventivo, tal como se describe anteriormente, que
comprende inducir dichas células hijas, que son capaces de diferenciarse, para que se diferencien mediante
siembra en placas de dichas células hijas sobre un sustrato fijo o dejando que dichas células hijas, que son
capaces de diferenciarse, se diferencien en suspensión
sin reiniciar la proliferación.
La invención proporciona también un método para la búsqueda entre diversos medicamentos de una
agente terapéutico supuesto que comprende aplicar
dicho agente al cultivo celular producido mediante el
método inventivo descrito anteriormente y vigilar la
respuesta de dicho cultivo celular.
Además, la invención se refiere a un cultivo celular producido por el método aquí descrito para su
uso en el tratamiento de enfermedades neurológicas o
neurodegenerativas o traumas del CNS, en el que dicho cultivo celular se deriva de una fuente autóloga
con respecto al receptor previsto.
La invención también proporciona el uso de un
cultivo celular producido mediante el método inventivo aquí descrito en la fabricación de un medicamento
para tratar enfermedades neurológicas o neurodegenerativas o traumas del CNS. Preferiblemente, dicho
cultivo celular se deriva de una fuente autóloga con
respecto al receptor previsto.
En otra realización, la presente invención se refiere al uso de un cultivo celular de la invención y descrito anteriormente en el que dicha enfermedad neurológica o neurodegenerativa es la enfermedad de Parkinson , enfermedad de Alzheimer, corea de Huntington, esquizofrenia, esclerosis lateral amiotrófica, epilepsia, parálisis cerebral o apoplejía o la enfermedad
neurodegenerativa que causa balismo o atetosis.
La invención describe un método para la proliferación y diferenciación in vitro de células progenitoras,
que comprende las etapas de (a) aislar la célula de un
mamífero, (b) exponer la célula a un medio de cultivo
que contiene un factor de crecimiento, (c) inducir a la
célula a que prolifere, y (d) inducir a la célula a que
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se diferencie. Se puede llevar a cabo la proliferación
y perpetuación de la célula progenitora o en cultivos
en suspensión, o dejando a las células que se adhieran
a un sustrato fijo. Se puede realizar la proliferación
y diferenciación antes o después del transplante, y en
diferentes combinaciones de estados in vitro o in vivo, comprendiendo (1) proliferación y diferenciación
in vitro, a continuación transplante, (2) proliferación
in vitro, transplante, seguidamente más proliferación
y diferenciación in vivo, y (3) proliferación in vitro,
transplante y diferenciación in vivo. La invención describe también la proliferación y diferenciación de las
células progenitoras in situ, que se puede hacer directamente en el receptor sin la necesidad de transplante.
La invención también describe la conservación de
las células progenitoras mediante criogénesis.
La invención también describe un método para el
transplante in vivo de una célula progenitora, tratada
según cualquiera de (1) a (3) anteriores, que comprende implantar, en un mamífero, estas células que se han
tratado con al menos un factor de crecimiento.
Además, la invención describe un método para
tratar las enfermedades neurodegenerativas que comprende administrar a un mamífero células progenitoras que se han tratado según cualquiera de (1) a (3),
se han tratado con un factor de crecimiento y se ha inducido para que se diferencien en neuronas. La invención describe también un método para tratar enfermedades neurodegenerativas que comprenden estimular
in situ células progenitoras del CNS de mamíferos para que proliferen y se diferencien en neuronas.
La invención también describe un método para la
transfección de estas células progenitoras con vectores que puedan expresar los productos génicos para
factores de crecimiento, receptores de factores de crecimiento, y neurotransmisores peptídicos, o expresar
enzimas que están implicadas en la síntesis de neurotransmisores, incluyendo los de para aminoácidos,
aminas biogénicas y neuropéptidos, y para el transplante de estas células transfectadas en las regiones
de neurodegeneración.
La invención describe también un método para la
búsqueda de compuestos farmacéuticos potenciales
neurológicamente terapéuticos.
Con lo anterior y otros objetos, ventajas y características de la invención que serán aquí aparentes a
continuación, se puede entender más claramente la
naturaleza de la invención mediante referencia a la siguiente descripción detallada de la invención y a las
reivindicaciones anejas.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1
Desarrollo inducido mediante EGF de un conjunto de
células indiferenciadas procedentes de una única célula
Con dilución limitada de la suspensión celular, se
sembraron e identificaron células aisladas en la base
de placas de 96 pocillos. (A-D). Microfotografías de
contraste de fases de una célula (A) después de 3 días
in vitro (DIV). La misma célula empezó a dividirse
después de 5 DIV (B) y generó un conjunto de células observadas después de 7 (C) y 10 (D) DIV. Los
arañazos en el plástico (cabeza de la flecha) sirvieron
para identificar el campo. Barra, 10 µm. (E-F). Microfotografía de contraste de fases (E) del conjunto
de células de 10 DIV, generado en respuesta a EGF.
La mayoría de las células en este conjunto contenían
nestina-IR (F). Barra, 10 µm.
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Figura 2
Células NSE-IR en conjuntos proliferantes de células
inducidos con EGF y TGFα
Se examinó la presencia de células NSE-IR en
conjuntos de proliferación de células inducidos con
EGF y TGFα a los 20 y 25 DIV. Antes de 15 DIV
no se detectaron células NSE-IR. Las células NSE-IR
aparecieron después de 16-18 DIV y se vieron inicialmente en el núcleo de la proliferación. (A, B).
Después de 20 DIV, se identificaron numerosas células NSE-IR en las células tratadas con EGF (A) y
con TGFα (B). Se hallaron pocas células NSE-IR fuera del núcleo de proliferación y no había diferencias
aparentes entre las células NSE-IR en los cultivos tratados con EGF y con TGFα. (C, D). Después de 25
DIV, se observaron cientos de células NSE-IR. Además de grandes números de células NSE-IR en el núcleo de proliferación, habían migrado muchas células
IR. En este estado, se hicieron aparentes algunas diferencias en la morfología neuronal entre (C) células
tratadas con EGF y (D) células tratadas con TGFα.
Mientras que las células tratadas con EGF tenían neuritas cortas, algunas de las células NSE-IR en los cultivos tratados con TGFα habían desarrollado procesos
bastante largos (flechas). Barra, 20 µm.
Figura 3
Aparición de células GFAP-IR en cultivos tratados
con EGF y TGFα
GFAP-IR aparecieron primero a los 16-18 DIV.
En el DIV 20 se observaron unas pocas células GFAPIR emigrando fuera del núcleo de proliferación. No
había diferencias aparentes entre cultivos tratados con
EGF y con TGFα. En el DIV 25, una gran mayoría de las células que habían emigrado del núcleo
central eran GFAP-IR. En este estado todas las células GFAP-IR en cultivos tratados con EGF tenían
una morfología estrellada, mientras que muchas de las
GFAP-IR en los cultivos tratados con TGFα tomaban
una morfología de astrocitos protoplasmáticos inmaduros (todavía se veían algunas células estrelladas).
En el DIV 30, todas las células GFAP-IR en los cultivos tratados con EGF exhibían una morfología estrellada. Al contrario, casi todas las células GFAP-IR en
los cultivos tratados con TGFα eran protoplasmáticas.
Barra, 20 µm.
Figura 4
Fenotipo de neuronas generadas mediante proliferación inducida con EGF de células progenitoras estriadas adultas
Microfotografías de fluorescencia de células con
morfología neuronal, en cultivos de 21 DIV de una
única esfera generada con EGF cultivada en un sustrato fijo, después de teñir para GABA (a) y sustancia
P (b).
Figura 5
Neuroesferas de ratón transplantadas se diferencian
en neuronas en el CNS de rata
Se utilizó un anticuerpo monoclonal, M6, que reconoce una proteína superficial hallada solamente en
neuronas de ratón para marcar los progenitores de ratón transplantados que se habían diferenciado en neuronas en la rata receptora. Se identifican cuerpos celulares marcados positivamente (grandes flechas) y neuritas (pequeñas flechas).
La presente invención proporciona el aislamiento de células progenitoras neurales de un animal, la
perpetuación estas células in vitro o in vivo en presencia de factores de crecimiento, la diferenciación de
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estas células en neuronas y glia, para la criogénesis
de células progenitoras, y el uso de estas células para
neurotransplantes en un receptor para tratar enfermedades neurodegenerativas y traumas neurológicos, y
para aplicaciones de búsqueda de medicamentos. La
inducción de la proliferación y diferenciación en estas células progenitoras se puede hacer o mediante el
crecimiento de células en adherencia o en suspensión
en cultivo tisular, o, bajo condiciones adecuadas, en el
receptor en las siguientes combinaciones: (1) proliferación y diferenciación in vitro, a continuación transplante, (2) proliferación in vitro, transplante, seguidamente más proliferación y diferenciación in vivo, (3)
proliferación in vitro, transplante y diferenciación in
vivo, y (4) proliferación y diferenciación in situ. La
proliferación y diferenciación in situ implica una acción no quirúrgica que ayuda a las células progenitoras a proliferar in situ con manipulación farmacéutica.
Se piensa que las células progenitoras están bajo
una influencia inhibidora tónica que mantiene a los
progenitores en un estado de supresión hasta que sea
necesaria su diferenciación. Esta influencia inhibidora
tónica puede ser un factor soluble, puesto que fracciones de lisados neurales vueltos a añadir a las células
progenitoras pueden inhibir su proliferación in vitro.
En cultivo, estas células progenitoras pueden no ser
sujetos de la misma influencia inhibidora. Estas células son ahora capaces de proliferar, y, a diferencia de
las neuronas que están diferenciadas de una manera
terminal y por tanto no se dividen, se pueden producir
en número ilimitado y son por tanto muy apropiadas
para el transplante en receptores heterólogos y autólogos con enfermedades neurodegenerativas.
Por progenitor se quiere decir una célula madre
oligopotente o pluripotente que es capaz de dividirse
sin límite y bajo condiciones específicas puede producir células hijas que se diferencian al final en neuronas
y glia. Estas células se pueden utilizar para transplantes en un receptor heterólogo o autólogo. Por heterólogo se quiere decir un receptor diferente del animal
del cual se derivaron originalmente las células progenitoras. Por autólogo se quiere decir el receptor idéntico del cual se derivaron originalmente las células.
Se pueden obtener las células de tejido neural
post-natal, juvenil o adulto de cualquier animal. Por
cualquier animal se quiere decir cualquier animal
multicelular que contenga tejido nervioso. Más particularmente, se quiere decir cualquier insecto, pez,
reptil, ave, anfibio o mamífero y similares. Los donantes más preferidos son mamíferos, especialmente
ratones y humanos.
En el caso de animal donante heterólogo, se le
puede aplicar la eutanasia al animal, y retirarle el cerebro y el área específica interesada utilizando un procedimiento estéril. Las áreas del cerebro de particular interés comprenden cualquier área de las cuales
se puedan obtener las células progenitoras que servirán para restablecer la función de una zona regenerada
del cerebro del receptor. Estas regiones comprenden
áreas del sistema nervioso central (CNS) incluyendo
la corteza cerebral, cerebelo, mesencéfalo, base del
cerebro, médula espinal y tejido ventricular, y áreas
del sistema nervioso periférico (PNS) incluyendo el
cuerpo carotídeo y la médula adrenal. Más particularmente, estas áreas incluyen regiones de los ganglios
basales, preferiblemente el cuerpo estriado que consiste en el caudado y el putamen, o diferentes grupos
celulares, tales como el globus pallidus, el núcleo sub-
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talámico, el núcleo basal que se halla degenerado en
pacientes con la enfermedad de Alzheimer, o la pars
compacta de la sustancia negra que se encuentra degenerada en pacientes con la enfermedad de Parkinson.
Este último grupo celular se nombra así y se identifica por su color oscuro debido a la presencia de elevados niveles del pigmento melanina. La melanina se
deriva de la tirosina o dopa mediante la acción de la
tirosinasa.
Se pueden derivar las células progenitoras neurales heterólogas humanas de tejido fetal obtenido por
aborto voluntario, o de un donante de órganos postnatal, juvenil o adulto. Se puede obtener el tejido neural autólogo mediante biopsia, o de pacientes que sufren neurocirugía en la cual se elimina tejido neural,
en particular durante la cirugía por epilepsia, y más
particularmente durante lobectomías temporales e hipocampolectomías.
Se pueden obtener células de tejido donante mediante disociación de células individuales de la matriz
extracelular conjuntiva del tejido. Se puede obtener la
disociación utilizando cualquier procedimiento conocido, incluyendo tratamiento con enzimas, tales como
tripsina, colagenasa y similares, o utilizando métodos
físicos de disociación , tales como un instrumento romo. Se puede llevar a cabo la disociación de las células fetales en medio de cultivo tisular, mientras que
un medio preferible para la disociación de células juveniles o adultas es fluido espinal cerebral artificial
(aCSF, por sus siglas en inglés). ACSF regular contiene NaCl 124 mM, KCl 5mM, MgCl2 1,3 mM, CaCl2
2 mM, NaHCO3 26 mM, y D-glucosa 10 mM. ACSF
con bajo Ca++ contiene los mismos ingredientes excepto MgCl2 , con una concentración 3,2 mM y CaCl2
con una concentración de 0,1 mM.
Se pueden colocar las células disociadas en cualquier medio de cultivo capaz de soportar crecimiento
celular, comprendiendo MEM, DMEM, RPMI, F-12,
y similares, conteniendo complementos que se necesitan para el metabolismo celular, tales como glutamina y otros aminoácidos, vitaminas, minerales y proteínas útiles, tales como transferrina y similares. El medio puede contener también antibióticos para evitar
la contaminación con levaduras, bacterias y hongos,
tales como penicilina, estreptomicina, gentamicina y
similares. En algunos casos, el medio puede contener
suero derivado de bovinos, equinos, pollos y similares. Un medio particularmente preferido para células
es una mezcla de DMEM y F-12.
Las condiciones del cultivo deben ser lo más próximas a las condiciones fisiológicas. El pH de los medios de cultivo debe ser lo más próximo al pH fisiológico, preferiblemente entre pH 6-8, más preferiblemente cercano a pH 7, incluso más particularmente
pH 7,4 aproximadamente. Las células se deben cultivar a una temperatura cercana a la temperatura fisiológica, preferiblemente entre 30ºC-40ºC, más preferiblemente entre 32ºC-38ºC, y lo más preferido entre
35ºC-37ºC.
Se pueden hacer crecer las células en suspensión o
sobre un sustrato fijo, pero la proliferación de los progenitores se hace preferiblemente en suspensión para
generar grandes números de células. En el caso de células en suspensión, se agitan bien los matraces y se
dejan a las neuroesferas que se sedimenten en el fondo
del matraz. A continuación se transfieren las esferas
a un tubo de centrifugadora de 50 ml y se centrifugan a baja velocidad. Se aspira el medio, se vuelven
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a suspender las células en una pequeña cantidad de
medio con factor de crecimiento, y se disocian mecánicamente las células. A continuación se cuentan las
células y se vuelven a sembrar.
El cultivo de células sobre un sustrato fijo puede
llevar a la diferenciación del progenitor en una célula terminalmente diferenciada que ya no es capaz de
dividirse, pero que se puede utilizar para transplantes para formar conexiones con otras dianas neurales.
Se puede inducir también la diferenciación en suspensión si las células se cultivan durante un periodo de
tiempo sin disociación y reinicio de la proliferación.
Los factores de crecimiento que se pueden utilizar para inducir la proliferación comprenden cualquier factor trófico que permita proliferar a las células progenitoras, incluyendo cualquier molécula que
se una a un receptor sobre la superficie de la célula para ejercer un efecto trófico o inductor del crecimiento
sobre la célula. Tales factores comprenden factor de
crecimiento de los nervios (NGF, por sus siglas en inglés), factor de crecimiento ácido y básico de fibroblastos (aFGF, bFGF, por sus siglas en inglés), factor
de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF, por sus
siglas en inglés), hormona liberadora de la tirotropina
(TRH, por sus siglas en inglés), factor de crecimiento
epidérmico (EGF, por sus siglas en inglés), un ligando
similar a EGF, anfirregulina, factor alfa y beta de crecimiento transformante (TGFα, TGFβ, por sus siglas
en inglés), factor de crecimiento similar a la insulina
(IGF−1 , por sus siglas en inglés) y similares.
Los factores más preferidos son EGF y TGFα. Estos factores de crecimiento son polipéptidos de cadena simple de 53 y 50 aminoácidos respectivamente,
que compiten para unirse al receptor de EGF (EGFR).
Se ha demostrado que EGF y TGFα influyen en la
diferenciación celular. Se ha observado en el CNS
de roedores y humanos inmunorreactividad (IR) a
TGFα, EGF-IR y EGF-IR, así como a mRNAs de
TGFα y EGF. Los resultados de estudios de unión de
ligandos han demostrado que el número de sitios de
unión de [125 I]EGF en el cerebro de roedores aumenta
durante la gestación y son más elevados en la primera semana después del nacimiento que en el adulto, de
acuerdo con el papel de este factor en el desarrollo del
CNS. EGF induce la proliferación de una célula progenitora multipotente a partir del cuerpo estriado que
da origen a los astrocitos estrellados y neuronas con
ramificaciones cortas, y TGFα induce la proliferación
de una célula progenitora pluripotente que da origen
a astrocitos protoplasmáticos y neuronas con neuritas
largas y bien desarrolladas. La concentración utilizada de factores de crecimiento es 1 fg/ml - 1 mg/ml,
preferiblemente 20 ng/ml.
Las células neuronales y gliales se pueden derivar
después de la diferenciación de las células progenitoras pluripotentes. Se puede inducir la diferenciación
de las células por cualquier método conocido en la
técnica que active la cascada de sucesos biológicos
que llevan al crecimiento, que comprende la liberación de trifosfato de inositol y Ca++ intracelular, liberación de diacil-glicerol y la activación de la proteína
quinasa C y otras quinasas celulares, y similares. El
tratamiento con ésteres de forbol, factores de crecimiento y otras señales químicas, así como el crecimiento sobre un sustrato fijo, tal como una superficie
cargada iónicamente, tal como poli-L-lisina y poli-Lornitina y similares puede inducir la diferenciación.
Se puede inducir también la diferenciación dejando
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las células en suspensión en la presencia continuada
de factor de crecimiento, en ausencia de reinicio de
proliferación.
Se retiran del animal células de la región neural
particular utilizando un procedimiento estéril, y se
disocian mecánicamente utilizando cualquier método
conocido en la técnica. Se disocia directamente tejido
del cerebro justo después del nacimiento en el medio
de cultivo, mientras que tejidos cerebrales juveniles
o adultos se disocian en fluido espinal cerebral artificial (CSF). Se centrifugan las células disociadas a
baja velocidad, entre 200 y 2000 rpm, y más particularmente entre 400 y 800 rpm, y seguidamente se
vuelven a suspender en medio de cultivo. Las células
se vuelven a suspender a aproximadamente 5 x 104 a
2 x 105 células/ml, preferiblemente 1 x 105 células/ml.
Las células sembradas sobre un sustrato fijo se siembran con una concentración aproximada de 2-3 x 103
células/ml, preferiblemente 2,5 x 103 células/ml.
Se complementan las suspensiones celulares en el
medio de cultivo con cualquier factor de crecimiento
que permita la proliferación de células progenitoras y
cultivo en cualquier receptáculo capaz de mantener
células, particularmente matraces de cultivo, placas
de cultivo o botellas cilíndricas, y más particularmente en pequeños matraces de cultivo, tales como matraces de cultivo de 25 cm2 . Las células proliferan en 34 días en una incubadora a 37ºC, y se puede reiniciar
la proliferación en cualquier momento después de eso
mediante disociación de las células y resuspensión en
medio de cultivo nuevo que contenga factores de crecimiento.
En ausencia de sustrato, las células se despegan
del fondo del matraz y siguen proliferando en suspensión formando una esfera hueca de células indiferenciadas. Después de aproximadamente 3-10 días in vitro, y más particularmente aproximadamente 6-7 días
in vitro, se alimentan los conjuntos proliferantes (neuroesferas) cada 2-7 días, y más particularmente cada
2-4 días mediante suave centrifugación y resuspensión en el medio que contiene factor de crecimiento.
Después de 6-7 días in vitro, se pueden separar
las células individuales de las neuroesferas mediante disociación física de las neuroesferas con un instrumento romo, más particularmente mediante trituración de las neuroesferas con una pipeta, especialmente una pipeta pasteur pulida al fuego. Las células
aisladas de las neuroesferas disociadas se suspenden
en medio de cultivo conteniendo factor de crecimiento, y un porcentaje de estas células proliferan y forman nuevas neuroesferas compuestas principalmente
de células indiferenciadas. Se puede inducir la diferenciación de las células mediante siembra de las células sobre un sustrato fijo, comprendiendo matraces,
placas o cubres recubiertos de poli-L-lisina y poli-Lornitina en la presencia continuada de EGF, TGFα o
cualquier factor capaz de mantener la diferenciación,
tal como factor básico de crecimiento de fibroblastos (bFGF) y similares. La diferenciación se puede
inducir también dejando a las células en suspensión
en presencia de un factor de crecimiento, incluyendo
EGF o TGFα, sin reinicio de la proliferación.
Para identificar moléculas celulares en los dos tipos de células que se forman después de la diferenciación inducida por factor de crecimiento, es decir
neuronas y glia, se lleva a cabo una inmunocitoquímica utilizando anticuerpos específicos para marcadores
celulares conocidos. Se pueden utilizar anticuerpos
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específicos para cualquier proteína neuronal o glial
para distinguir las características celulares o propiedades fenotípicas de neuronas de glia. En particular,
estos marcadores celulares comprenden , para neuronas, enolasa específica de neuronas (NSE, por sus siglas en inglés) y neurofilamento, y para glia, proteína
glio-fibrilar ácida (GFAP, por sus siglas en inglés), galactocerebrósido y similares.
También útiles para identificar células neuronales
son anticuerpos contra neurotransmisores. Éstos comprenden anticuerpos contra la acetilcolina (ACh), dopamina (DA), epinefrina (E), norepinefrina (NE), histamina (H), serotonina o 5-hidroxitriptamina (5-HT),
neuropéptidos, tales como sustancia P (SP), hormona adrenocorticotrópica (ACTH), vasopresina u hormona antidiurética (ADH), oxitocina, somatostatina,
angiotensina II, neurotensina, y bombesina, hormonas liberadoras hipotalámicas, tales como hormona
liberadora tirotrópica (TRH) y hormona liberadora
de la hormona luteinizante (LHRH), péptidos gastrointestinales, tales como péptido intestinal vasoactivo
(VIP) y colecistoquinina (CCK) y péptidos similares a
CCK, péptidos opioides, tales como β-endorfina similar a endorfinas y encefalinas, tales como met- y leuencefalina, prostaglandinas, aminoácidos tales como
ácido gamma-aminobutírico (GABA), glicina, glutamato, cisteína, taurina y aspartato y dipéptidos, tales
como carnosina.
Son también útiles anticuerpos contra enzimas
sintetizadoras de neurotransmisores, tales como descarboxilasa del ácido glutámico (GAD), que está implicada en la síntesis de GABA, acetil-colina-transferasa (CAT) para la síntesis de ACh, dopa-descarbixilasa (DDC) para dopamina, dopamina-β-hidroxilasa
(DBH) para NE, y aminoácido-descarboxilasa para
5-HT.
Pueden ser también útiles anticuerpos contra enzimas que están implicadas en la desactivación de
neurotransmisores, tales como acetil-colinesterasa
(AChE) que desactiva ACh. Anticuerpos contra enzimas implicadas en la retoma de neurotransmisores en los terminales neuronales, tales como monoamina-oxidasa (MAO) y catecol-o-metil-transferasa (COMT) para DA, MAO para 5-HT, y GABAtransferasa (GABA-T) para GABA pueden también
identificar neuronas.
Otros marcadores para neuronas comprenden anticuerpos contra receptores de neurotransmisores, tales como los receptores nicotínicos y muscarínicos de
AChE, receptores adrenérgicos α1 , α2 , β1 y β2 , el receptor de dopamina y similares.
Las células que contienen un elevado nivel de melanina, tales como las que se encuentran en la sustancia negra, se podrían identificar utilizando un anticuerpo para la melanina.
Se pueden identificar células progenitoras con anticuerpos que se unen específicamente a proteínas halladas solamente en células progenitoras, y no en células que se han diferenciado. En particular son anticuerpos para una proteína de filamento intermedia,
y más particularmente un anticuerpo llamado Rat401,
que se dirige a la nestina, una proteína intermedia de
filamento hallada específicamente en células madre
neuroepiteliales.
Se puede utilizar cualquier anticuerpo secundario
o anti-inmunoglobulina heteróloga que se una al anticuerpo primario, y que permita su detección al estar
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conjugado a una enzima particular, isótopo, partícula o tinción. Se pueden originar tales anticuerpos en
cualquier animal, tales como cabras, ovejas, conejos,
cerdos, caballos, ratones, ratas y similares. Y estar
dirigidos contra un anticuerpo primario formado en
cualquier animal heterólogo de las mismas variedades. Se pueden conjugar los anticuerpos secundarios
a las tinciones, tales como fluoresceína, rodamina u
otra tinción, se pueden marcar con cualquier isótopo,
tal como 125 I o conjugar a una proteína radiomarcada, tal como digoxina, o se pueden conjugar con partículas que se puedan ver al microscopio, tales como
partículas inmuno-oro o similares. Se pueden también
conjugar los anticuerpos secundarios a cualquier enzima que pueda reaccionar con un sustrato para formar
un producto de reacción visible o detectable, tales como peroxidasa de rábano picante y fosfatasa alcalina. Anticuerpos particularmente útiles son anticuerpos secundarios que consisten en IgG anti-ratón de
cabra purificada por cromatografía de afinidad conjugada con fluoresceína e IgG anti-conejo de cabra purificada por cromatografía de afinidad conjugada con
rodamina.
Se cultivan las células sobre cualquier sustrato sobre el cual las células puedan crecer y diferenciarse,
y que se pueda analizar utilizando microscopía, tales
como placas de cultivo, portas de vidrio, cubres y similares. Se cultivan las células hasta 6 semanas, y más
preferiblemente durante 14-30 días in vitro, y se pueden fijar en cualquier solución deshidratante, tal como un alcohol o acetona, o en una solución de aldehídos reticulantes. A continuación se tiñen las células
utilizando anticuerpos primarios dirigidos a cualquier
característica celular particular que se va a identificar,
seguido de la reacción con anticuerpos conjugados secundarios para su detección.
Se pueden administrar las células transplantadas
a cualquier animal con síntomas anormales neurológicos o neurodegenerativos obtenidos de cualquier
manera, incluidos los obtenidos como un resultado
de lesiones químicas o electrolíticas, como un resultado de aspiración experimental de áreas neurales,
o como un resultado de procesos de envejecimiento. Lesiones particularmente preferibles en animales no humanos se obtienen con 6-hidroxi-dopamina
(6-OHDA), 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina
(MPTP), ácido iboténico y similares.
A causa de que los inmunosupresores tienen algo de riesgo de morbilidad y mortalidad como resultado de infecciones que pueden ocurrir, solamente se puede hacer en ausencia de estos medicamentos
transplantes autólogos o transplantes heterólogos utilizando tejido de padres o parientes. Se puede hacer el
transplante de forma bilateral, o, en el caso de un paciente que sufre enfermedad de Parkinson, de manera contralateral con respecto al lado más afectado. Se
realiza la cirugía de una manera en la cual las regiones particulares del cerebro se puedan localizar, tales
como en relación con las suturas del cráneo, particularmente con una guía estereotáctica. Se suministran
las células en toda área neural afectada, en particular
en los ganglios basales, y preferiblemente al caudado y putamen, al núcleo basal y a la sustancia negra.
Se administran las células a la región particular utilizando cualquier método que mantenga la integridad
de las áreas circundantes del cerebro, preferiblemente
mediante cánula de inyección.
Las células administradas a la región neural parti-
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cular forman preferiblemente un injerto neural, en el
que las células forman conexiones neuronales o sinápticas normales con las neuronas vecinas, y mantienen
contacto con las células gliales que pueden formar
vainas de mielina alrededor del axón de la neurona,
y proporcionan una influencia trófica a las neuronas.
Cuando estas células transplantadas forman conexiones, restablecen las redes neuronales que se han dañado debido a la enfermedad y el envejecimiento.
Se puede inducir a las células progenitoras a que
proliferen y se diferencien in situ administrando al receptor cualquier factor de crecimiento o composición
farmacéutica que inducirá la proliferación y diferenciación a las células. Estos factores de crecimiento
comprenden cualquier factor de crecimiento conocido
en la técnica, incluyendo los factores de crecimiento descritos anteriormente para la proliferación y diferenciación in vitro, y en particular EGF y TGFα.
Las composiciones farmacéuticas comprenden cualquier sustancia que bloquee la influencia inhibidora
y/o estimulen al progenitor a que prolifere y se diferencie finalmente. Se puede hacer la administración
de hormonas de crecimiento mediante cualquier método, incluyendo cánula de inyección, transfección de
células con vectores que expresen hormonas de crecimiento, inyección, aparatos de liberación controlada
que pueden administrar sustancias al lugar deseado,
y similares. Se pueden administrar las composiciones farmacéuticas mediante cualquier método, incluyendo cánula de inyección, inyección, administración
oral, aparatos de liberación controlada y similares.
Se puede examinar la supervivencia del injerto en
el receptor vivo utilizando diferentes escaners no invasivos, tales como tomografía axial computerizada
(TAC o escáner TC), resonancia magnética nuclear
o imagen por resonancia magnética (RMN o IMR) o
más preferiblemente escaners de tomografía de emisión de positrones (TEP). Se puede realizar el examen post-mortem de supervivencia del injerto retirando el tejido neural, y examinando macroscópicamente la región afectada, o más preferiblemente utilizando microscopía. Se pueden teñir las células con cualquier tinción visible en las condiciones del microscopio óptico o electrónico, más particularmente con tinciones que sean específicas para neuronas y glia. Particularmente útiles son los anticuerpos monoclonales
que identifican marcadores superficiales de las células
neuronales, tales como el anticuerpo M6, que identifica las neuronas de ratón. Los más preferibles son
los anticuerpos que identifican cualquier neurotransmisor, particularmente los dirigidos al ácido gammaamino-butírico (GABA) y a la sustancia P, y a las
enzimas implicadas en la síntesis de neurotransmisores, en particular, descarboxilasa del ácido glutámico (GAD). Se pueden también identificar las células
transplantadas mediante incorporación anterior de tinciones trazadoras, tales como microesferas marcadas
con rodamina o fluoresceína, azul rápido, bis-benzamida o marcadores histoquímicos introducidos retroviralmente, tales como el gen lac Z, que produce betagalactosidasa.
La integración funcional del injerto en el tejido
neural del receptor se puede asegurar mediante examen de la efectividad de los injertos en la restauración de diferentes funciones, comprendiendo, pero no
limitado, a ensayos de las funciones endocrina, motora, cognoscitiva y sensorial. Los ensayos motores que
se pueden utilizar comprenden aquellos que cuantifi9
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can el movimiento rotacional lejos del lugar degenerado del cerebro, y aquellos que cuantifican la lentitud
de movimientos, equilibrio, coordinación, aquinesia o
falta de movimientos, rigidez y temblores. Los ensayos cognoscitivos comprenden diferentes ensayos de
capacidad para realizar las tareas diarias, así como diferentes ensayos de memoria, incluyendo resolución
de laberintos.
En otra realización de la invención, se transplantan las células progenitoras a un receptor, y se induce que proliferen y/o se diferencien en ese receptor,
ya sea por (1) proliferación y diferenciación in vitro,
seguidamente transplante, (2) proliferación in vitro,
transplante in vivo, o (3) proliferación in vitro, transplante y diferenciación in vivo. De manera alternativa, se pueden inducir a las células que proliferen y
se diferencien in situ mediante inducción con factores
de crecimiento particulares o composiciones farmacéuticas que inducirán su proliferación y diferenciación. Por tanto, este último método no es quirúrgico,
y por ello evita los problemas asociados con la intervención médica y las reacciones inmunes a células
extrañas. Se puede utilizar cualquier factor de crecimiento, particularmente EGF, TGFα, aFGF, bFGF y
NGF. Se pueden administrar estos factores de crecimiento de cualquier manera conocida en la técnica en
la cual los factores o puedan pasar a través de o eviten la barrera sangre-cerebro (BBB, por sus siglas en
inglés).
Los métodos para permitir que los factores pasen
a través de la barrera sangre-cerebro comprenden minimizar el tamaño del factor, o proporcionar factores
hidrofóbicos que permitan pasarla más fácilmente.
Los métodos para evitar la barrera sangre-cerebro comprenden transfección de las células progenitoras con vectores de expresión conteniendo genes que
codifican los factores de crecimiento, de tal manera
que las mismas células producen el factor. Se pueden
transfectar las células mediante cualquier método conocido en la técnica, comprendiendo transfección de
CaPO4 , transfección de DEAE-dextrano, transfección
por polibreno, mediante fusión de protoplastos, electroporación, lipofección, y similares.
Se puede utilizar cualquier vector de expresión conocido en la técnica para expresar el factor de crecimiento, siempre que tenga un promotor que sea activo
en la célula, y terminación apropiada y señales de poliadenilación. Estos vectores de expresión comprenden vectores de virus de vacunas recombinantes incluyendo pSC11, o diferentes virus derivados de vectores, tales como virus 40 de simios (SV40, es decir pSV2-dhfr, pSV2neo, pko-neo, pSV2gpt, psVT7 y
pBABY), del virus de sarcoma de Rous (RSV, es decir
pRSVneo), de virus tumorales de las mamas de ratón
(MMTV, es decir pMSG), de adenovirus (pMT2), de
virus de herpes simples (HSV, es decir pTK2 y pHyg),
del papilomavirus bovino (BPV, es decir pdBPV y
pBV-1MTHA), del virus de Epstein-Barr (EBV, es
decir p205 y pHEBo) o cualquier otro vector de expresión eucariótico conocido en la técnica.
Se puede utilizar para la expresión en las células
progenitoras cualquier factor de crecimiento para inducir proliferación, crecimiento o diferenciación de
las células progenitoras, comprendiendo NGF, FGF,
EGF, TGFα y similares. Se pueden transformar también las células con receptores para cualquier factor
de crecimiento, tal como para bFGF, NGF, EFG y
similares. Además, se pueden transfectar las células
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con cualquier gen que codifique un neurotransmisor o
enzima sintetizadora de neurotransmisor, que se listó
anteriormente o cualquier otra para la cual se desea la
expresión en el receptor.
Otros métodos para proporcionar factores de crecimiento al área del transplante comprenden el implante en el cerebro en proximidad con el injerto de
cualquier dispositivo que pueda proporcionar una infusión del factor a las células circundantes.
Se pueden criopreservar las células progenitoras mediante cualquier método conocido en la técnica, suspendiendo las células en una solución isotónica, preferiblemente un medio de cultivo celular, conteniendo un crioconservante particular. Tales
crioconservantes comprenden sulfóxido de dimetilo
(DMSO), glicerol y similares. Estos crioconservantes
se utilizan con una concentración de 5-15%, preferiblemente 8-10%. Se congelan las células gradualmente a una temperatura de -10ºC a -150ºC, preferiblemente -20ºC a - 100ºC, y más preferiblemente -70ºC
a -80ºC.
Se pueden utilizar las células progenitoras cultivadas in vitro para la búsqueda de composiciones potenciales neurológicamente terapéuticas. Se pueden
aplicar estas composiciones a células en cultivo con
diferentes dosis, y controlar la respuesta de las células para diferentes periodos de tiempo. Se pueden
analizar las características físicas de las células mediante la observación del crecimiento de la célula y
de la neurita con microscopía. La inducción de la expresión de niveles nuevos o aumentados de proteínas,
tales como enzimas, receptores y otras moléculas de
la superficie celular, o de neurotransmisores, aminoácidos, neuropéptidos y aminas biogénicas, se puede
analizar con cualquier técnica conocida en la técnica que pueda identificar la alteración de los niveles
de tales moléculas. Estas técnicas comprenden la inmunohistoquímica utilizando anticuerpos contra tales
moléculas, o análisis bioquímico. Tal análisis bioquímico comprende ensayos de proteínas, ensayos enzimáticos, ensayos de unión a receptores, ensayos inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), análisis
electroforéticos, análisis con cromatografía líquida de
elevada resolución (HPLC), western blots, y radioinmunoensayos (RIA). Los análisis de ácido nucleico,
tales como northern blots, se pueden utilizar para examinar los niveles de mRNA que codifica estas moléculas, y para enzimas que sintetizan estas moléculas.
De manera alternativa, las células tratadas con estas composiciones farmacéuticas se pueden transplantar a un animal, y examinar, tal como se ha descrito
anteriormente su supervivencia, capacidad para formar conexiones neuronales, y características bioquímicas e inmunológicas.
Los siguientes ejemplos se presentarán para aclarar más detalladamente las realizaciones preferidas de
la invención. Sin embargo no se deben considerar de
ninguna manera como limitación del alcance de la invención, tal como se define en las reivindicaciones
que se acompañan.
Ejemplo 1
Se decapitaron embriones de ratón albino CD1
(Charles River) de 14 días de edad y se les quitó el
cerebro y los cuerpos estriados utilizando un procedimiento estéril. Se disoció mecánicamente el tejido
con un pipeta Pasteur pulida al fuego en un medio
sin suero compuesto de una mezcla 1:1 de medio de
Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) y nutriente
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F-12 (Gibco). Se centrifugaron las células disociadas
a 800 r. p. m. durante 5 minutos, se aspiró el sobrenadante, y se volvieron a suspender las células en medio
DMEM/F-12 para el recuento.
Ejemplo 2
Se quitó tejido cerebral de tejido cerebral de ratón
joven y adulto y se cortó en secciones de 500 µm y se
transfirió inmediatamente a fluido cerebroespinal artificial oxigenado con bajo contenido en calcio (aCSF
con bajo Ca++ ) conteniendo 1,33 mg/ml de tripsina,
0,67 mg/ml de hialuronidasa, y 0,2 mg/ml de ácido
quinurénico. Se agitó el tejido en esta solución durante 90 minutos a 32ºC-35ºC. Se eliminó el aCSF
y se sustituyó con aCSF oxigenado nuevo durante 5
minutos. Se transfirió el tejido a solución DMEM/F12/hormona al 10% conteniendo 0,7 mg/ml de ovomucoide y se trituró con una pipeta pasteur pulida al
fuego. Se centrifugaron las células a 400 r. p. m. durante 5 minutos, se aspiró el sobrenadante y se volvieron a suspender las células peletizadas en mezcla
DMEM/F-12/hormona al 10%.
Ejemplo 3
Se diluyeron células disociadas preparadas como en los Ejemplos 1 y 2 aproximadamente 1 célula/pocillo en una placa de cultivo de tejidos de 96
pocillos (100 µl/pocillo) para examinar la naturaleza
clonal de la proliferación inducida mediante EGF. Se
confirmó la presencia de una única célula por pocillo
con microscopía de contraste de fases.
Ejemplo 4
Se sembraron 2500 células/cm2 preparadas como
en el Ejemplo 1 sobre cubres de vidrio recubiertos de
poli-L-ornitina (15 µg/ml; Sigma) en placas de cultivo Nunclon de 24 pocillos (0,5 ml/pocillo). El medio de cultivo era un medio sin suero compuesto de
DMEM/F-12 (1:1) comprendiendo glucosa (0,6%),
glutamina (2 µM), bicarbonato sódico (3 mM), y tampón HEPES (ácido 4-[2-hidroxietil]-1-piperazín-etanosulfónico) (5 mM) (todos de Sigma excepto la glutamina [Gibco]). Se utilizó en lugar de suero una
mezcla hormonal definida y mezcla de sales (Sigma)
que comprendía insulina (25 µg/ml), transferrina (100
µg/ml), progesterona (20 nM), putrescina (60 µM), y
cloruro de selenio (30 nM). Los cultivos contenían el
medio anterior junto con 16-20 ng/ml de EGF (purificado de submaxilar de ratón, Collaborative Research) o TGFα (recombinante humano, Gibco). Después
de 10-14 días in vitro, se reemplazaron los medios
(DMEM sólo más mezcla de hormonas) y los factores
de crecimiento. Este cambio de medio se repitió cada
dos a cuatro días. Se determinó el número de células
supervivientes in vitro a los 5 días mediante incubación de los cubres en azul tripano al 0,4% (Gibco)
durante dos minutos, lavado con solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,3) y recuento del número de células que no se teñían con un microscopio
invertido Nikon Diaphot.
Ejemplo 5
Se suspendieron en el medio de cultivo descrito
en el Ejemplo 4 células disociadas de cerebro de ratón preparadas como en los Ejemplo 1 y 2 (1 x 105
células/ml), junto con 20 ng/ml de EGF y TGFα. Se
sembraron las células en un matraz de cultivo T25 y se
guardaron en una incubadora a 37ºC, 100% de humedad, 95% de aire/5% de CO2 . Las células empezaron
a proliferar en 3-4 días y, debido a la falta de sustrato,
se separaron del fondo del matraz y continuaron proliferando en suspensión formando una esfera hueca de
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
20
células indiferenciadas. Después de 6-7 días in vitro,
se alimentaron los conjuntos proliferantes (neuroesferas) cada 2-4 días mediante suave centrifugación y
resuspensión en DMEM con los aditivos descritos anteriormente.
Ejemplo 6
Después de 6-7 días in vitro, se separaron las células individuales de las neuroesferas del Ejemplo 5
mediante trituración de las neuroesferas con un pipeta
pasteur pulida al fuego. Se suspendieron células aisladas de las neuroesferas disociadas en matraces de
cultivo celular en mezcla de DMEM/F-12/hormona al
10% junto con 20 ng/ml de EGF. Un porcentaje de
las células disociadas empezó a proliferar y formaron nuevas neuroesferas compuestas principalmente
de células indiferenciadas. Se agitaron bien los matraces y se dejó a las neuroesferas que se sedimentaran
en el fondo del matraz. A continuación se transfirieron las neuroesferas a tubos de centrifugadora de 50
ml y se centrifugaron a 300 rpm durante 5 minutos. Se
eliminó el medio mediante aspiración, y se resuspendieron las neuroesferas en 1 ml de medio conteniendo
EGF. Se disociaron las células con una pipeta pasteur
estirada al fuego y se trituraron cuarenta veces. Se retiraron 20 microlitros de las células para el recuento
y se añadieron a 20 microlitros de azul tripano diluido 1:2. Se contaron las células y se volvieron a sembrar con una concentración de 50.000 células/ml. Se
indujo la diferenciación de las células manteniendo
las células en los matraces de cultivo en presencia de
EGF o TGFα con una concentración de 20 ng/ml sin
reiniciar las proliferación mediante disociación de las
neuroesferas o mediante sembrado sobre poli-ornitina
en la presencia continua de EGF o TGFα.
Ejemplo 7
Se llevó a cabo inmunocitoquímica indirecta con
células preparadas como en los Ejemplos 1 y 2 que
se habían cultivado durante 14-30 días in vitro sobre cubres. Para la inmunocitoquímica anti-NSE (o
anti-nestina) y anti-GFAP, se fijaron las células con
paraformaldehído al 4% en PBS y etanol 95%/ ácido acético 5%, respectivamente. Después de un periodo de fijación de 30 minutos, se lavaron los cubres tres veces (cada uno durante 10 minutos) en PBS
(pH = 7,3) y seguidamente se incubaron en el antisuero primario (NSE 1:300, nestina 1:1500 o GFAP
1:100) en PBS/suero normal de cabra al 10%/ TritonX100 al 0,3% durante dos horas a 37ºC. Se lavaron
tres veces los cubres (10 minutos cada vez) en PBS y
se incubaron con anticuerpos secundarios (anti-conejo de cabra-rodamina para anti-NSE o anti-nestina y
anti-ratón de cabra-fluoeresceína para anti-GFAP, ambos con una concentración 1:50) durante 30 minutos
a 37ºC. Seguidamente se lavaron tres veces los cubres (10 minutos cada vez) en PBS, se enjuagaron con
agua, se colocaron sobre portas de vidrio y se colocaron cubres encima utilizando Fluorsave, un medio de
montaje para utilizarse preferiblemente con anticuerpos conjugados con fluoresceína. Se detectó la fluorescencia y se fotografió con un fotomicroscopio Nikon Optiphot.
Ejemplo 8
Se anestesiaron ratas con nembutal (25 mg/kg intraperitonealmente) y se les inyectó sulfato de atropina (2 mg/kg intraperitonealmente). Los animales tenían una lesión por ibotenato del cuerpo estriado. 7
días después de la lesión, los animales recibieron una
inyección de células preparadas como en los Ejem11
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ES 2 198 404 T3
plos 1 o 2 bajo control estereotáctico. Se pusieron las
inyecciones en el área lesionada mediante una cánula de calibre 21 provista de un catéter de teflón en
el microinyector. Se marcaron las células inyectadas
con microesferas marcadas con fluoresceína. Se les
hizo a los animales análisis de conducta antes de la
lesión, después de la lesión, y en diferentes intervalos
después del transplante para determinar la funcionalidad de las células injertadas en diferentes momentos
post-operativos, seguidamente se sacrificaron y se les
perfundió transcardialmente con paraformaldehido al
4% tamponado, glutaraldehído al 0,1% y solución de
sacarosa al 5% a 4ºC. Se congelaron los cerebros en
nitrógeno líquido y se almacenaron a -20ºC hasta su
utilización. Se cortaron secciones del cerebro de 26
µm en un criostato, se fijaron en paraformaldehído al
4% y se tiñeron utilizando el anticuerpo monoclonal
M6 para teñir las neuronas de ratón, y a continuación
se hicieron reaccionar con un anticuerpo secundario
conjugado con fluoresceína anti-rata. Se identificaron
los fenotipos neuronales y gliales mediante marcaje
dual de las células con anticuerpo para NSE y GFAP.
Ejemplo 9
Se cultivaron células preparadas según el Ejemplo
2 durante 14-30 días in vitro sobre cubres de vidrio y
seguidamente se fijaron con paraformaldehído al 4%
en PBS. Después de un tiempo de fijación de 30 minutos, se lavaron los cubres tres veces (10 minutos
cada vez) en PBS (pH 7,3) y a continuación se incubaron en el antisuero primario (anti-GABA 1:3000,
descarboxilasa anti-glutamina 1:500, y anti-sustancia
P 1:100, en PBS conteniendo suero normal de cabra al
10%/ Triton-X-100 al 0,3% durante dos horas a 37ºC.
Se lavaron tres veces los cubres (10 minutos cada vez)
en PBS y se incubaron con anticuerpos secundarios
(de cabra anti-conejo o de cabra anti-oveja conjugados con fluoresceína o rodamina a una concentración
1:50) durante 30 minutos a 37ºC. Seguidamente se lavaron tres veces los cubres (10 minutos cada vez) en
PBS, se enjuagaron con agua, se colocaron sobre portas de vidrio y se colocaron cubres encima utilizando Fluorsave, como medio de montaje. Se detectó la
fluorescencia y se fotografió con un fotomicroscopio
Nikon Optiphot.
Ejemplo 10
Se centrifugaron a 300 r. p. m. durante 3 minutos
células preparadas como en el Ejemplo 2, se aspiró
el medio y seguidamente se volvieron a suspender las
células en medio caliente DMEM/F-12 conteniendo
glicerol al 10% con una concentración de aproximadamente 1 x 105 células/ml, y se congelaron lentamente a -20ºC durante 2 horas en un caja de espuma de estireno pre-enfriada con la tapa abierta. Una
vez congeladas, se transfirieron las células a -80ºC.
Se descongelaron las células colocando el criovial en
un baño de agua a 37ºC, se mezclaron mediante agitación suave, se añadió un volumen igual de medio
calentado a las células cada 5 minutos durante 15 minutos, y seguidamente se llevó el volumen hasta 10
ml. A continuación se centrifugaron las células durante 3 minutos a 300 rpm y se descargó el sobrenadante.
Se cogieron 10 microlitros de células para determinar la viabilidad y se cogieron 10 microlitros de células y se tiñeron con azul tripáno y se contaron en un
hemocitómetro. Se volvieron a suspender las células
en solución de DMEM/F-12/hormona al 10% en una
concentración de 100.000 células/matraz y se cultivaron 3-4 días a 37ºC en matraces de cultivo T25.
12
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
22
Ejemplo 11
Se obtuvieron las células de tejido mesencefálico
ventral de un feto humano de 8 semanas de edad después de un aborto de rutina mediante succión que se
recoge en un aparato colector estéril. Se cortó un trozo de 2 x 4 x 1 mm de tejido y se disoció como en
el Ejemplo 1. A continuación se cultivaron las células
como en el Ejemplo 5.
Ejemplo 12
Se utilizan células preparadas como en el Ejemplo
11 para neurotransplante en un receptor de grupo sanguíneo compatible con una enfermedad neurodegenerativa. La cirugía se realiza utilizando una guía estereotáctica tomográfica (CT) controlada con un ordenador BRW. Se le da al paciente anestesia local complementada con midazolamo administrado por vía intravenosa. Se le hace al paciente un escáner TC para
establecer las coordenadas de la región que va a recibir el transplante. La cánula de inyección consiste en
una cánula externa de acero inoxidable de calibre 17
con un estilete interno de calibre 19. Éste se inserta en
el cerebro en las coordenadas correctas, seguidamente
se quita y se reemplaza por una cánula de infusión de
calibre 19, que se ha cargado inicialmente con 30 µl
de suspensión tisular. Se infunden lentamente las células con un caudal de 3 µl/min, se retira la cánula. Se
realizan múltiples pasos de agujas estereotácticas por
toda el área de interés, aproximadamente a 4 mm. Se
examina al paciente mediante escáner TC post-operativamente para buscar hemorragias o edemas. Se realizan evaluaciones neurológicas a diferentes intervalos después de la operación, así como escaneos PET
para determinar la actividad metabólica de las células
implantadas.
Ejemplo 13
Se obtiene tejido neural del área ventricular mediante biopsia de un sujeto humano y se cultiva como
en el Ejemplo 5.
Ejemplo 14
Se transfectan con vectores de expresión que contienen los genes del receptor de bFGF o del receptor
NGF células que han proliferado como en los Ejemplo 1 o 2. El DNA del vector conteniendo los genes
se diluyen en 0,1 X TE (Tris 1 mM pH 8,0, EDTA 0,1
mM) con una concentración de 40 µg/ml. Se añadieron 220 µl del DNA a 250 µl de 2X HBS (NaCl 280
mM, KCl 10 mM, Na2 HPO4 2H2 O 1,5 mM, dextrosa
12 mM, HEPES 50 mM) en un tubo de plástico estéril desechable de 5 ml, Se añaden lentamente 31 µl de
CaCl2 2M y se incuba la mezcla durante 30 minutos
a temperatura ambiente. Durante esta incubación de
30 minutos, se centrifugan las células a 800 g durante
5 minutos a 4ºC. Se vuelven a suspender las células
en 20 volúmenes de PBS enfriado con hielo y se dividen en partes alícuotas de 1 x 107 células, que se centrifugan de nuevo. Se vuelve a suspender cada parte
alícuota de células en 10 ml de suspensión de DNACaCl2 , y se incuban durante 20 minutos a temperatura ambiente. A continuación se diluyen las células en
medio de crecimiento y se incuban durante 6-24 horas a 37ºC en CO2 al 5%-7%. Se vuelven a centrifugar
las células, se lavan en PBS y se devuelven a 10 ml de
medio de crecimiento durante 48 horas.
Ejemplo 15
Se transplantan células transfectadas como en el
Ejemplo 14 a un paciente humano como en el Ejemplo 12.
23
ES 2 198 404 T3
REIVINDICACIONES
1. Un método para la producción in vitro de un
cultivo celular de células madre neurales pluripotentes, comprendiendo dicho método las etapas de
(a) preparar o proporcionar un medio de cultivo inicial que comprende uno o más factores de crecimiento capaces de inducir la proliferación de
células madre neurales pluripotentes;
(b) preparar un cultivo celular mediante la adición
al medio de cultivo de la etapa (a) de células derivadas de tejido neural de mamíferos y conteniendo al menos una célula madre neural pluripotente capaz de dividirse sin límite y producir
progenie que sea capaz de diferenciarse en neuronas y glia;
(c) proliferar dicha célula madre neural pluripotente en dicho medio de cultivo celular para producir progenie de células madre neurales que comprende células madre neurales pluripotentes hijas y células hijas que son capaces de diferenciarse en neuronas y glia; y
(d) transferir dicha progenie de células madre neurales a medio de cultivo nuevo que contiene uno
o más factores de crecimiento capaces de inducir la proliferación de las células madre neurales pluripotentes para hacer que proliferen dichas células madre neurales pluripotentes hijas
y para producir más progenie de células madre
neurales.
2. El método según la reivindicación 1, en el que
la proliferación de dicha célula madre neural pluripotente en la etapa (c) o dichas células madre neurales
pluripotentes hijas en la etapa (d) ocurre en un cultivo
en suspensión.
3. El método según la reivindicación 1, en el que
la proliferación de dicha célula madre neural pluripotente en la etapa (c) o dichas células madre neurales
pluripotentes hijas en la etapa (d) ocurre en un cultivo
unido a un sustrato.
4. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que comprende la perpetuación de
células madre neurales pluripotentes mediante el reinicio de la proliferación de las células madre neurales
pluripotentes hijas en la etapa (d) mediante la repetición de la etapa (d).
5. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho tejido neural de mamífero procede de un ser humano.
6. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho tejido neural de mamífero procede de un feto, neonato, joven o adulto.
7. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el medio de cultivo utilizado
en las etapas (a) y (d) está sin suero.
8. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho uno o más factores
de crecimiento se selecciona del grupo que consiste
en factor ácido de crecimiento de fibroblastos, factor
básico de crecimiento de fibroblastos, factor de crecimiento epidérmico, un ligando similar a EGF, anfirregulina y factor alfa de crecimiento transformante.
9. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho medio de cultivo
inicial de la etapa (a) y dicho medio de cultivo nuevo
5
10
15
20
25
30
35
40
45
24
de la etapa (d) contienen el mismo o mismos factores
de crecimiento.
10. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho medio de cultivo
nuevo de la etapa (d) contiene uno o más factores de
crecimiento diferentes que dicho uno o más factores
de crecimiento de dicho medio de cultivo inicial de la
etapa (a).
11. Un método para producir in vitro células neurales diferenciadas derivadas de la progenie de células
madre neurales producida mediante el método de una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende inducir dichas células hijas que son capaces de
diferenciarse a que se diferencien mediante la siembra
de dichas células hijas sobre un sustrato fijo o dejando que dichas células hijas que son capaces de diferenciarse se diferencien en suspensión sin reiniciar la
proliferación.
12. Un método para la búsqueda entre diversos
medicamentos de un agente terapéutico supuesto que
comprende aplicar dicho agente al cultivo celular producido mediante el método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10 y vigilar la respuesta de dicho
cultivo celular.
13. Un cultivo celular obtenible mediante el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para usarse en tratar enfermedades neurológicas o neurodegenerativas o traumas del CNS, en el que dicho
cultivo celular se deriva de un origen autólogo con
respecto al receptor previsto.
14. Uso de un cultivo celular producido mediante
el método de una cualquiera de las reivindicaciones
1 a 10 o el cultivo celular según la reivindicación 13
en la producción de un medicamento para tratar enfermedades neurológicas o neurodegenerativas o traumas del CNS.
15. Uso de un cultivo celular según la reivindicación 14 que se deriva de un origen autólogo con respecto al receptor previsto.
16. Uso de un cultivo celular según la reivindicación 14 ó 15, en el que la enfermedad neurológica o
neurodegenerativa es la enfermedad de Parkinson, la
enfermedad de Alzheimer, corea de Huntington, esquizofrenia, esclerosis lateral amiotrófica, epilepsia,
parálisis cerebral o apoplejía o la enfermedad neurodegenerativa que causa balismo o atetosis.
50
55
60
65
NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art.
167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre,
relativo a la aplicación del Convenio de Patente Europea,
las patentes europeas que designen a España y solicitadas
antes del 7-10-1992, no producirán ningún efecto en España en la medida en que confieran protección a productos
químicos y farmacéuticos como tales.
Esta información no prejuzga que la patente esté o no incluida en la mencionada reserva.
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