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Fosforilación oxidativa
Dr. Octavio Loera Corral
Membrana externa
Poros no específicos
Permeable (10 KDa)
Membrana interna
75% Proteínas (p/p)
Impermeable
(Excepto a O2, CO2 y H2O)
Transportadores de:
ATP, ADP, Piruvato,Ca2+, Pi
4 Complejos
Multi-unidades
Al menos 10 centros redox unidos a proteínas
FOSFORILACIÓN OXIDATIVA
Hipótesis del acoplamiento
• Acoplamiento Químico (Edward Slater, 1953)
– Intermediarios con “alta energía”
• Acoplamiento Conformacional (Paul Boyer, 1964)
– “Edos. Energéticos” de las proteínas mitocondriales
• Acoplamiento por Quimiosmósis (Peter Mitchell, 1961)
– ΔG del transporte de e- usada para expulsar H+
– Formación de un gradiente electroquímico
– Gradiente
síntesis de ATP
Acoplamiento Químico (Edward Slater, 1953)
Intermediarios con “alta energía”
Basado en la estrategia Química de la Glucólisis
1.
Adición de P a la glucosa
2.
Conversión a intermediarios fosforilados… ¿por qué?
3.
Acoplamiento de estas transferencias a la formación de ATP
Go de la hidrólisis de fosfatos orgánicos
COMPUESTO
Go (kJ/mol)
Fosfo-enol-piruvato
-61.9
1,3-Bifosfo-glicerato
-49.4
Fosfato de acetilo
-43.1
Fosfato de creatina
-43.1
Pirofosfato (PPi)
-33.5
ATP
AMP + PPi
-32.2
ATP
ADP + Pi
-30.5
Fosfato-1-de Glucosilo
-20.9
Fosfato-6-de Fructosilo
-13.8
Fosfato-6-de Glucosilo
-13.8
Fosfato-3-de Glicerilo
-9.2
*
*
*
*
*
* Intermediarios de la glucólisis
Dos etapas:
I. Utilización de ATP para generar
2 triosas fosfatadas (2 GAP).
Rxs 1 a 5
II. Conversión del GAP a Piruvato,
formando ATP.
Rxs 6 a 10
Balance Global:
Glucosa + 2ADP + 2Pi + 2NAD+
2Piruvato + 2ATP + 2NADH + 2H+
+ 2H2O
Reacción 1
Para otras reacciones
Enzima Hexoquinasa (HK)
Las HK´s trasfieren grupos fosforilo entre el ATP y un metabolito
La misma HK puede hacer la transferencia a otras hexosas
El Mg2+ también es sustrato
Debido al ∆Go´, [G6P] puede inhibir la Rx
Grupo acil-fosfato de alta energía
Reacción 6
¿Qué átomo de C cambió el edo. de oxidación?
Enzima Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH)
In vivo la Rx se favorece por la relación alta:
NAD+ / NADH
[NAD+ ] elevada
El 1,3-BPG es el primer intermediario capaz de transferir el P al ADP
Para 1,3-BPG, ∆Go´ de transferencia del P = -49.4 kJ/mol
Reacción 7
Enzima Fosfogliceratoquinasa (PGK)
La Rx es libre de agua en el sitio catalítico, como la HK
Estructuras similares, pero secuencias distintas entre HK y PGK
1,3-BPG transfiere el P al ADP
“Fosforilación a nivel sustrato”
Reacción 10
De Rx 1
Enzima: Piruvatoquinasa (PK)
Sin embargo, no se han identificado intermediarios “de alta energía” en la
Cadena de electrones…
Se descarta la hipótesis de Edward Slater.
Acoplamiento por Quimiosmósis (Peter Mitchell, 1961)
Evidencias de la Hipótesis Quimiosmótica
• La fosforilación oxidativa requiere membranas
internas íntegras
• Estas membranas son impermeables a iones como H+,
OH-, K+ y Cl-, cuyo difusión libre rompería el
gradiente electroquímico
• El transporte de e- transloca H+ fuera de la
mitocondria
• Hay desacoplantes del gradiente, que no interrumpen
el flujo de e-
El incremento de la acidez fuera de la membrana interna, estimula la síntesis de ATP
Complejo V = ATP sintasa
El pH de la matriz mitocondrial es casi 1 unidad más alto
El Complejo V requiere 3 H+ para cada ATP…
Complejo V : F0 y F1
Analogía con una presa
¿Qué mueve a la turbina (Complejo V) en la mitocondria?
Estructura de F1
Vista Lateral
Vista Superior
O: open
L: loose
T: tight
La energía es cedida por el paso favorable de H+ a través de F0
Los cambios comformacionales modifican
AFINIDADES de LIGANDOS
Paul Boyer tenía razón, pero la energía para el cambio proviene
del gradiente electroquímico
Control de la Producción de ATP
• Las Rxs en el transporte de e- tiene ΔG°´ ~ O
– Desde el Complejo I hasta Cit c
• La Rx en el Complejo IV es irreversible
– Sitio de control
– El mayor efecto lo tiene su sustrato: Cit c Reducido (c2+)
Desde el Complejo I hasta Cit c
El Complejo V requiere 3 H+ para cada ATP…
El Cit c Reducido está en equilibrio con el resto de los intermediarios
En el Complejo IV el mayor efecto lo tiene su sustrato:
Cit c Reducido (c2+), en equilibrio con la relación :
Y con la ley de acción de masas:
Keq
*
Situación de una célula en crecimiento rápido sin limitación de nutrientes:
[ Cit c Reducido] ALTA
ALTA
y
BAJA
AUMENTA
[ Cit c Reducido] ALTA
LA ACTIVIDAD
DEL COMPLEJO IV
El ATP se produce en las células mayormente por:
GLUCÓLISIS (GLUC)
CICLO DE KREBS (TCA)
FOSFORILACIÓN OXIDATIVA (FO)
Se mantiene alta por GLUC y
TCA .
Estos e-, aumentan
Hasta que haya efecto inhibitorio
GLUC y TCA se regulan coordinadamente para
producir NADH y FADH2 a la velocidad requerida
según la demanda de ATP
Dos etapas:
I. Utilización de ATP para generar
2 triosas fosfatadas (2 GAP).
Rxs 1 a 5
II. Conversión del GAP a Piruvato,
formando ATP.
Rxs 6 a 10
Balance Global:
Glucosa + 2ADP + 2Pi + 2NAD+
2Piruvato + 2ATP + 2NADH + 2H+
+ 2H2O
NAD+
Es el agente oxidante más importante de la Glucólisis
2Hº
+ H+
Debe ser reoxidado para su uso continuo por estas vías:
1. Fosforilación oxidativa
ATP
2. Reducción de piruvato a lactato
3. Fermentación alcohólica
¿Por qué se recicla?
Vista de la Glucólisis
Glucosa
Glucólisis
Glucosa
Piruvato
Tryptophan
ATP
Entrada de ATP
2 ó 3 ATP´s por NAD+
3 ó 4 ATP´s por NADP+
ATP
Sólo en la parte final de la ruta…
PROBLEMA
Para una levadura. ¿Cómo sería el
rendimiento de ATP de la Glucólisis hasta
piruvato sin reciclar el NADH+?
Considerando 2 NAD+ por Glucosa:
a) A partir de Nicotinato
b) Suponiendo que el medio de cultivo
tiene NMN suficiente
Conversión de Piruvato a Lactato
por la Lactato Deshidrogenasa
¿Qué átomo modifica su número de oxidación?
Conversión de Piruvato a Etanol
por la Alcohol Deshidrogenasa
¿Qué átomo modifica su número de oxidación?
Fermentación Homoláctica
Glucosa + 2 ADP + 2 Pi
2 lactato + 2 ATP + 2 H2O
∆Go´ = - 196 kJ/mol
Formación de 2 ATP, ∆Go´ = + 61 kJ/mol
31% de eficiencia
Fermentación Alcohólica
Glucosa + 2 ADP + 2 Pi
2 Etanol + 2 ATP + 2 CO2
∆Go´ = - 235 kJ/mol
26% de eficiencia
En condiciones fisiológicas la eficiencia se aproxima al 50%,
Disipación por calor… proceso irreversible
Efecto Pasteur con Levaduras:
Cultivo anaerobio
Consumo Alto de Glucosa + Etanol
Cultivo aerobio
Consumo Bajo de Glucosa (no hay Etanol)
¿Cómo se explica este cambio rápido?
¿Qué enzimas se inhiben?
¿Por qué efectores?
[ATP] en cultivo aerobio >> [ATP] en cultivo anaerobio
El ATP se produce en las células mayormente por:
GLUCÓLISIS (GLUC)
CICLO DE KREBS (TCA)
FOSFORILACIÓN OXIDATIVA (FO)
Se mantiene alta por GLUC y
TCA .
Estos e-, aumentan
Hasta que haya efecto inhibitorio
GLUC y TCA se regulan coordinadamente para
producir NADH y FADH2 a la velocidad requerida
según la demanda de ATP
Efecto Pasteur con Levaduras:
Cultivo anaerobio
Consumo Alto de Glucosa + Etanol
Cultivo aerobio
Consumo Bajo de Glucosa (no hay Etanol)
¿Cómo se explica este cambio rápido?
¿Qué enzimas se inhiben?
¿Por qué efectores?
Las enzimas de la GLUCÓLISIS no se inhiben por [NADH],
Funcionan en anaerobiosis.
Aplicaciones del Conocimiento de la Regulación
Homeostásis vs. Ing. Metabólica
Uso Industrial
Síntesis Química
Mezclas Racémicas
$
?
$$$
Redirección del Flujo de C
Glucosa extracelular
X
G6P
X
Mediado por ATP
Desregulación del alosterismo
Cepa Silvestre
(Y p/s) = 30 % (Y p/s) máx
Cepa Modificada
(Y p/s) = 60 % (Y
p/s)
Báez et al., 2006
máx
…ENZIMA: 2.7.1.69
Enzima II del sistema de transferencia de fosfato (PTS, en inglés)
El aceptor es un grupo –OH (en C6 de Glucosa ó C1 de Fructosa)
Funciona en muchas bacterias.
PEP + Pa
Piruvato + Pa-P
PEP, Fosfoenolpiruvato
Pa, Péptidos acarreadores
PTS, Enzima 2.7.1.69
Pa-P
PTS-P
Glucosa
Pa
PTS
Glucosa-6-P
Hay una translocación de la Glucosa…