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Análisis y anotación de genomas
Fernán Agüero
August 9, 2017
© 2001 - Fernán Agüero
Historia
• Primer proyecto de secuenciación de un
genoma: Escherichia coli (US + Japón).
Comenzó en 1992 y terminó en 1997. 4.6 MB
• Primer genoma (eubacteria): Haemophilus
influenzae (1995). 1.83 MB
• Primer genoma (archaea): Metanococcus
jannaschii (1996). 1.6 MB
• Primer genoma (eukarya): Caenorhabditis
elegans (). XXX MB
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Qué es un genoma?
• Una colección de
– genes
• que codifican productos proteicos
• que codifican RNAs
– pseudogenes
– regiones no codificantes
• regulatorias (expresión)
• estructurales
– attachment a matriz nuclear
– mitosis / meiosis
– elementos repetitivos
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Qué es anotar?
• Agregar información, de la manera más
confiable y actualizada que se pueda para
describir una secuencia
• Información asociada a coordenadas
genómicas (comienzo..fin), a distintos
niveles
• Interpretar la información cruda de
secuencia en un marco biológico
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Anotación genómica
• Dos niveles de anotación
– Estructural: encontrar genes y otros sitios con
relevancia biológica. Armar un modelo del genoma:
cada gen/sitio es un objecto asociado a una posición
en el genoma
– Funcional: los objetos son utilizados en búsquedas
(y experimentos). El objetivo es atribuir información
biológica relevante a los objetos.
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Más niveles de anotación
• Organismo: fenotipo: morfología, fisiología,
comportamiento, respuestas ambientales
• Celula: vías metabólicas, cascadas de
señalización, localización subcelular.
• Molecula: sitios de binding, actividad
catalítica, estructura tridimensional
• Dominio
• Motif
• Residuo
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De donde proviene la anotación?
• Fuentes utilizadas en la anotación:
– publicaciones que reportan nuevas secuencias
– reviews que actualizan periódicamente la anotación
de familias o grupos de proteínas
– expertos externos
– análisis de secuencia
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Anotación genómica
ab initio gene
prediction
Genomic DNA
transcription
Unprocessed RNA
RNA processing
Mature mRNA
Gm3
AAAAAAA
translation
Comparative gene
prediction
Nascent polypeptide
folding
Active enzyme
Functional
identification
Function
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Reactant A
Product B
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Annotation & functional genomics
La anotación del genoma es esencial en el desarrollo de
estrategias funcionales (functional genomics)
proteome based functional genomics
RNAi phenotypes
Gene
Knockout
Expression Microarray
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Anotación: busqueda de genes
• Buscar genes en el genoma
– RNA
• ribosomal RNAs
 BLASTN
• tRNAs
 tRNAscan
– protein coding
• ab initio gene prediction  ORFs, codon usage, frecuencia de
hexámeros, modelos, etc.)
• similarity
 BLASTX, otros
• Buscar regiones no codificantes
– regulatorias
• ab initio
• similarity
– repetitivas
• similarity
• ab initio
• En todos los casos
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 Gibbs sampling
 patterns, profiles
 literatura!
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Integrar resultados
BLASTX
BLASTN
Secuencia
genoma
DB
RepeatMasker
tRNASCan
flatfiles
gene prediction
Visualización
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Genome annotation: C. elegans
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Resumir resultados de análisis
• Guardar el reporte crudo de un BLAST (lista de hits,
alineamientos) es demasiado
• Prácticamente cualquiera de los análisis que se realizan
sobre DNA o proteínas para anotar un genoma pueden
resumirse en:
– secuencia
– cromosoma1
start
1723
end
3456
• Este formato básico es la base del formato GFF (Sanger)
secuencia
Contig1
Contig1
Contig1
metodo
similarity
cds
similarity
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programa
blastx
glimmer
blastn
start
100
85
80
end
1000
1201
1300
frame
+1
+1
.
score
132
1321
136
extra
gi|12345|AF34093 casein kinase ...
ORF0001; overlap with ORF0002
gi|54321|AF09990 complete genome
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Anotación: herramientas
• Artemis
– http://www.sanger.ac.uk/Software/Artemis
– Permite visualizar
• secuencia, con sus traducciones virtuales (6)
• tracks de anotación (entries)
• plots (built-ins y creados por el usuario)
– Lee secuencias en formato FASTA, EMBL, GenBank
– Lee features en formato EMBL, GenBank, GFF,
MSPcrunch, BLAST
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Artemis: main window
Sequence view
Sequence view
Feature list
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Artemis: plots
%GC plot
AA properties
plot para un
CDS
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Artemis: display de análisis
Frameplot
BLASTX
BLASTN
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Artemis:
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Artemis: zoom
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Artemis: spliced genes
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Artemis: comparar análisis
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Otras estrategias
• Artemis se usa para anotar genomas bacterianos o
para pequeños proyectos (cósmidos, BACs, etc.)
• En genomas más grandes, la tendencia es a
distribuir la anotación
• Los tracks de anotación son generados en distintos
centros
• Ejemplo: UCSC Genome Browser (genoma
humano, ratón).
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Anotación automática: TrEMBL
• La anotación de TrEMBL (translated
EMBL) se hace por métodos automáticos.
– Requerimientos para anotar automáticamente
• Una base de datos de referencia bien anotada (ej.
Swissprot)
• Una base de datos que sea altamente confiable (en el
sentido diagnóstico) en la asignación de proteínas a
grupos o familias (ej CDD, InterPro)
• Una serie de reglas de anotación
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Transferencia directa de anotación
• Realizar una búsqueda
en la base de datos de
referencia y transferir
la anotación
XDB
Target
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• Ejemplo: FASTA contra
una base de datos de
secuencias y
transferencia de la línea
DE del mejor hit
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Anotación a partir de múltiples fuentes
• Generalmente se
usa más de una
base de datos
externa
XDB
• Hay que combinar
los resultados
Target
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Conflictos
• Contradicción
• Inconsistencia
• Sinónimos
• Redundancia
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Traducción de anotaciones
• Es necesario utilizar un
traductor para mapear el
lenguaje utilizado en la base
de datos externa (XDB) al
lenguaje utilizado en la base
de datos target que queremos
anotar
XDB
Target
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Traducciones: algunos ejemplos
ENZYME TrEMBL
CA L-ALANINE=D-ALANINE
CC -!- CATALYTIC ACTIVITY: L-ALANINE=
CC
D-ALANINE.
PROSITE TrEMBL
/SITE=3,heme_iron
FT METAL
IRON
Pfam TrEMBL
FT DOMAIN
FT ZN_FING
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zf_C3HC4
C3HC4-TYPE
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Requerimientos de un sistema de anotación automática
•
•
•
•
•
•
Corrección
Escalable
Actualizable
Poco redundante
Completo
Vocabulario controlado
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Cómo funciona?
• Una proteína en TrEMBL es reconocida
como un miembro de cierto grupo o
familia de proteínas
• Este grupo de proteínas en Swissprot
comparten entre sí partes de la anotación
• La anotación común es transferida
automáticamente a la proteína en TrEMBL
y marcada como ‘annotated by similarity’
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Anotación: evidencias
• Las anotaciones suelen estar acompañadas de TAGS que indican la
evidencia en la que se basa la anotación
• Ejemplos de algunos TAGS utilizados en TrEMBL:
– EMBL: la información fue copiada del original (EMBL/GenBank/DDBJ)
– TrEMBL: anotación modificada para corregir errores o para adecuarse a
la sintaxis propia de Swissprot
– Curator: juicio del curador
– Similarity: por similitud con otra secuencia, a juicio del curador
– Experimental: evidencia experimental de acuerdo a una referencia, que
usualmente es un paper.
– Opinion: opinión emitida por el autor de una referencia, usualmente con
poca o ninguna evidencia experimental
– Rulebase: información derivada del uso de una regla de anotación
automática
– SignalP: programa de predicción
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Anotación: manual vs automática
• La anotación de un genoma ocurre en
etapas
– anotación automática
• correr todos los análisis sobre el genoma
• generar un primer borrador con todos los datos
organizados. Por ejemplo en páginas web o integrando
todos los datos en un display unificado (Artemis)
– anotación manual: cura de los datos
• una persona (curador) revisa la anotación, gen por
gen, verificando la anotación automática, agregando
anotaciones manuales, corriendo eventualmente algún
programa particular
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Qué herramientas se usan?
• Oakridge Genome Annotation Channel
– http://compbio.ornl.gov/channel
• ENSEMBL
– http://ensembl.ebi.ac.uk
• Artemis
– http://www.sanger.ac.uk/Software/Artemis
• GeneQuiz
– http://www.sander.ebi.ac.uk/genequiz
• Genome browsers: varios
– cada consorcio/proyecto desarrolló el suyo: Apollo
(FlyBase, Drosophila), AceDB (C. elegans),
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Anotación: fuentes de error
• Transferencia transitiva de anotaciones
– gen1 mal anotado como ‘casein kinase’ presente en
los bancos de datos
– gen2 con alta similitud con gen1, resulta anotado
como casein kinase
• Solución:
– usar bases de datos curadas: por ejemplo Swissprot
– revisar la anotación de más de un hit
– verificar que las anotaciones de todos los hits
concuerden
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Anotación confiable: proyecto HAMAP
• High-quality Automated Microbial Annotation of
Proteomes
– Swissprot (Swiss Bioinformatics Institute-European
Bioinformatics Institute)
– CNRS Lyon
– INRIA Grenoble
– INRA Toulouse
– CNRS Marseille
– Pasteur Institute
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HAMAP
• Hay muchos genomas bacterianos terminados, pero va a
haber muchos más en los próximos años
• El número de proteínas bacterianas proveniente de estos
genomas llegará al millón muy rápidamente
• Pero el análisis funcional y una caracterización detallada
van a exsitir sólo en unos pocos casos:
– todas las proteínas de organismos modelo (E. coli, B. subtilis)
– proteínas involucradas en patogénesis (interés médico e
industrial)
– proteínas involucradas en vías metabólicas específicas (interés
biotecnológico)
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Prioridades del proyecto HAMAP
• Anotación de proteínas huérfanas
• Pre-anotación de proteínas pertenecientes a
familias grandes/complejas (transportadores ABC,
HTH, sistemas de dos componentes, SDH)
• Anotación de alta calidad de proteínas
pertenecientes a familias bien caracterizadas
• Anotación manual de proteínas caracterizadas
experimentalmente en ese organismo
• Anotación manual de proteínas no caracterizadas
que muestren similitud con otras proteínas
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Estrategia HAMAP
ORFans
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HAMAP: ORFans
• No tienen similitud con otras proteínas (excepto
tal vez otras proteínas de organismos muy
cercanos)
• No tienen hits contra InterPro (Prosite, PRINTS,
Pfam, ProDom, SMART)
• Qué se hace:
–
–
–
–
Predicción de señales
Predicción de regiones trans-membrana
Predicción de coiled-coils
Anotación de repeticiones
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HAMAP: ORFan antes
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HAMAP: ORFan después
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HAMAP: large/complex families
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HAMAP: anotación automática
• Transferencia automática de anotación
– Usando reglas específicas para cada famila de proteínas
– Usando reglas específicas para un organismo particular
• La transferencia de anotación puede ir
acompañada de advertencias para el curador
– Por ejemplo:
• WARNING: this genome contains MF_00031 (ruvA) but not
MF_00016 (ruvB)
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HAMAP: ejemplo reglas
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HAMAP: Escherichia coli
• De acuerdo al análisis original: 4286 proteínas
–
–
–
–
–
60 proteínas no detectadas (casi todas < 100 aa)
120 muy probablemente no existan
50 pares o tripletes de ORFs tuvieron que ser fusionados
719 con errores en la asignación del codón de inicio
~1800 todavía sin caracterización bioquímica
(aproximadamente una asignación funcional por semana)
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Chromosome browsers
• UCSC Genome Browser
– provee un display rápido de cualquier región genómica
– con varios “tracks” de anotación alineados al genoma
– Por el momento sólo: Human & Mouse
• Annotation tracks
–
–
–
–
–
–
–
–
–
genes conocidos (RefSeq, GenBank)
predicted genes (Genscan, FGENESH, GeneID, Acembly)
spliced ESTs
CpG islands
assembly gaps
cobertura
bandas cromosómicas
elementos repetitivos
etc
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UCSC Genome browser
• UCSC sólo genera la mitad de los tracks
• El resto proviene de la comunidad biomédica
• El Genome Browser es una herramienta de
visualización
• No saca conclusiones! Simplemente integra en
forma gráfica toda la información que posee
sobre una región, dejando la exploración y la
interpretación al usuario.
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UCSC Genome Browser: gene expression
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UCSC Genome browser: alternative splicing
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UCSC Genome browser: complex transcription
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UCSC Genoma browser: user tracks
•
•
•
•
Ustedes pueden agregar sus propios tracks
Pueden ser públicos o privados
No necesitan saber programar
Tienen que proveer información en formato
GFF (u otros similares: GTF, BED)
chrom start
end
[name strand score]
chr1 1302347 1302357 SP1 +
800
chr1 1504778 1504787 SP2 –
980
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Ejemplo
• Secuenciación de
ESTs de Tupaia
belangeri
– Mamífero pequeño
– Bibliotecas de cDNA
sustractivas de
hipocampo
Alfonso et al J Neurosci Res (2004) 78: 702
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Anotación ESTs
• Anotación y
clasificación
funcional de los
ESTs
Alfonso et al J Neurosci Res (2004) 78: 702
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ESTs Tupaia
• ESTs que mapean en intrones de genes
conocidos
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ESTs Tupaia
• ESTs que mapean dentro de intrones de
genes conocidos
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Tupaia ESTs
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Acknowledgements
• Nicola Mulder, EBI
• Daniel Lawson, Sanger Centre
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