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Resección tumoral guiada por fluorescencia.
Patricia Priego Sanz.
Grado en Óptica y Optometría. Universidad Complutense de Madrid.
[email protected]
Tutores: Oscar Gómez Calderón, Eduardo Cabrera Granado, Sonia Melle.
[email protected]
Resumen: La fluorescencia emitida por la protoporfirina acumulada en las células
cancerígenas permite eliminar con mayor precisión la zona afectada.
Palabras clave: Fluorescencia, 5-ALA, protoporfirina IX, tumor.
1. Introducción.
La fluorescencia es un fenómeno físico que se produce en sustancias que al absorber
energía cuando las iluminamos con luz de una longitud de onda adecuada, tienen la
capacidad de emitir energía luminosa en una longitud de onda mayor que la
absorbida de forma que la energía del fotón emitido es menor que la energía del
fotón absorbido [1]. A estas sustancias se les denomina fluoróforos.
Figura 1. Diagrama de Jablonski.
Para entender este proceso utilizamos el diagrama de Jablonski (Fig. 1), que muestra
las posibles transiciones que se pueden dar entre los diferentes niveles energéticos de
la molécula. La molécula está en su nivel de menor energía. Al hacer incidir sobre ella
luz de una determinada longitud de onda, se excita a un nivel energético superior
debido a la absorción de la luz recibida (proceso 1 en Fig. 1). Desde este nivel excitado
la molécula pierde energía en forma de calor pasando a un subnivel energético
inferior dentro del nivel excitado (proceso 2 en Fig 1). Finalmente vuelva a su estado
inicial emitiendo luz de mayor longitud de onda que la radiación incidente (proceso 3
en Fig. 1). La radiación emitida se llama fluorescencia.
En este trabajo vamos a estudiar la resección de tumores tanto cerebrales como
medulares guiada por la fluorescencia de la protoporfirina IX (PpIX) que se genera a
partir del ácido aminolevulínico (5-ALA). Esta técnica se ha utilizado en el tratamiento
quirúrgico de distintos tipos de tumores (gliomas, meningiomas invasivos, metástasis
cerebrales y tumores intramedulares) demostrándose que puede ser útil para
conseguir resecciones completas sin dejar restos tumorales que puedan pasar
inadvertidos durante la cirugía.
2. Formación de la protoporfirina IX.
El 5-ALA (ácido 5-aminolevulínico) es un precursor natural de la PpIX, etapa que
precede a la formación del anillo hemo, un paso esencial en el metabolismo
mitocondrial. El excesivo aporte de 5-ALA exógeno conlleva un acúmulo temporal de
la PpIX a nivel mitocondrial, alterando el mecanismo que regula su concentración
celular.
Figura 2. Formación de la PpIX.
Para explicar la formación de la PpIX, empezamos con las reacciones iniciales de la
síntesis del hemo, que ocurren en los tejidos del ser humano, sobre todo en médula
(hemoglobina) e hígado (citocromos P450). La primera etapa se produce en la
mitocondria, con la síntesis del ALA (δ-aminolovulinato). Dos moléculas de ALA se
unen para formar el porfobilinófeno sintasa. Cuatro moléculas de ésta se unen para
formar un tetrapirrol lineal que junto a la enzima hidroximetilbilano lineal ó
pordobilinófeno desaminasa, se cicla formando uroporfirinógeno III. Que se produce
en el citoplasma una descarboxilación de los acetatos a metilos, por lo que
obtenemos coprotoporfirina IX, este compuesto pasa a la mitocondria donde se
produce una descarboxilación oxidativa de dos propionatos laterales a vinilos
(coproporfirinógeno oxidasa), se oxidan y se unen a los diferentes pirroles
(protoporfirinógeno oxidasa) y obtenemos la protoporfirina IX (Fig.2).
El acúmulo de PpIX inducido por el 5-ALA tiene afinidad por el epitelio y las células
tumorales. Aún no están suficientemente claras las razones por las que se produce
este acúmulo en las células cancerígenas. Una teoría achaca el aumento de la
absorción del 5-ALA a la hiperactividad de las células tumorales. Otros creen que el
aumento de la actividad enzimática de estas células cancerosas incrementa la síntesis
de protoporfirina IX. Por último, otros autores lo asocian con el descenso de
ferroquelatasa que se produce en células cancerígenas ya que ésta es indispensable
para la conversión de la PpIX en hemo. Al iluminar la PpIX con luz UV-azul, de
longitud de onda entre 380 y 450 nm, la PpIX emite en el rango de los rojos con un
máximo en 635 nm (Fig.3).
Figura 3. Espectros de excitación y emisión de la PpIX.
Para la observación del acúmulo de la PpIX, hemos construido en el laboratorio un
microscopio de fluorescencia.
3. Microscopio fluorescente
El microscopio de fluorescencia se ha construido adaptando un microscopio
convencional de bajo coste (Fig. 4). Para ello he elegido la fuente de excitación y los
filtros específicos para la PpIX [5]. Colocamos el brazo de iluminación en la dirección
horizontal y el brazo de detección en la dirección vertical. En el brazo de iluminación
colocamos la fuente LED que emite con un máximo en 400 nm y una lente
convergente, para iluminar uniformemente la muestra. Colocamos un filtro dicroico
(Di02-R442-25x36) a 45 grados para enviar el haz procedente del LED sobre la
muestra situada en la platina del microscopio. En el brazo de detección colocamos un
filtro de emisión (BLP01-594R-25), que deja pasar las longitudes de onda en las que
la PpIX fluoresce, eliminando la luz azul procedente del LED. Y por último colocamos
la cámara CCD conectada a un portátil para el procesado de imágenes.
Figura 4. Microscopio fluorescente.
Hemos caracterizado la fluorescencia emitida por muestras con distinta
concentración de PpIX. Como ejemplo, en la Fig. 5 (izda) mostramos una foto de la
cubeta que contiene PpIX en la que puede apreciarse su fluorescencia. Con el fin de
cuantificar el tamaño de los objetos detectados con este microscopio hemos
superpuesto unos hilos sobre las cubetas que contienen PpIX (ver imagen de
fluorescencia en la parte central de la Fig. 5) y hemos estimado su tamaño. En el
panel derecho de la Fig. 5 mostramos una de las imágenes obtenidas al introducir
PpIX en gelatina alimentaria con el fin de simular el tejido cerebral.
Figura 5. Foto de la cubeta que contiene PpIX (izda). Imagen de fluorescencia de una muestra de
PpIx cubierta por hilos (centro) y una muestra de gelatina que contiene PpIx (dcha).
4. Conclusiones.
La finalidad de este trabajo ha sido el estudio de la fluorescencia del fluoróforo PpIX,
que se excita iluminando con luz UV-azul y emite en rojo. Para medir este proceso,
construí un microscopio de fluorescencia modificando un microscopio convencional
de bajo coste que me ha permitido obtener imágenes de fluorescencia de la PpIX en
un tejido simulado.
Este tipo de fluorescencia se utiliza tanto en neurocirugía como en dermatología y
urología, como técnica de guía para poder localizar las células cancerígenas, ya que
permite ver con más detalle el borde del tumor a eliminar y no dañar así los tejidos
sanos circundantes.
5. Bibliografía.
[1]http://media.invitrogen.com.edgesuite.net/tutorials/1Intro/player.html
[2]http://enzimologia.fcien.edu.uy/BQII%202011/Metabolismo%20del%20Hemo%20
%2812-09-11%29.pdf
[3] L.M. Bernal-García; et al. Resección de tumor intramedular guiada por
fluorescencia con ácido aminolevulínico. Neurocirugía v.21 n.4 (2010)
[4] Ramón Abascal García. Diagnóstico por Fluorescencia en Tumores Vesicales.
Archivos Españoles de Urología v.60 n.5 (2007)
[5] Guión de prácticas de la asignatura de Óptica Biomédica (Cuarto Curso del Grado
de Óptica y Optometría). Facultad de Óptica y Optometría, UCM.