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Plásmidos Moléculas de DNA doble cadena que replican independientemente del cromosoma bacteriano que llevan información no indispensable para la supervivencia pero si que le confiere una ventaja adaptativa Ej: Resistencia a antibióticos, enzimas de restricción, enzimas para degradar sustratos poco comunes, toxinas etc. El replicar independientemente, ser pequeños y de fácil manejo (se pueden aislar y transferir a otras bacterias facilmente) los hacen candidatos ideales para utilizar como vectores para transportar informción genética. Aplicaciones Transferir material genético Aislar y estudiar genes Amplificar Fragmentos de DNA Transcripción in vitro Expresar proteínas Secuenciar Generar alelos de un gen, mutaciones. Plásmidos Tipos de plásmidos Clonado Expresión Suicidas Killer Shuttle Características generales MCS R Ori Sitio múltiple de clonado Plásmidos Región donde se agrupan secuencias de reconocimiento para enzimas de restricción. Estas secuencias no se repiten en ningún otra lugar del vector Origen de replicación Copia única Bajo número de copias (15-20 copias) Intermedio número de copias (50-100 copias) Alto número de copias (500-700 copias) Los replicones que más se usan son los derivados de pS101, pBM1 o colE1. pS101 pertenece a un grupo de compatibilidad diferente que pBM1 y colE1 Plásmidos Antibióticos Ampicilina, B-lactámicos. Inhibe pared celular. Bacteriostático. R: b-lactamasa Kanamicina, aminoglucósidos. Interfiere en la síntesis proteica (interactúa con proteínas ribosomales y con algunas bases del 30S). Bactericida R: fosfotransferasa Tetraciclina, Tetraciclinas. Interfiere en la síntesis proteica (interrumpe Bactericida. R: antitransportadora la unión codón-anticodón). Cloranfenicol. Interfiere en la síntesis proteica (inhibe peptidil transferasa). Bactericida. R: acetiltransferasa Plásmidos Pásmidos de clonado Segundo sistema de selección: sistema de selección de inserto pBR322 BamHI SpHI SalI Amp R= MCS Cepa: AmpS, TetS Tamaño: 4361 pb ColE1, no Relajado Tet R Plásmidos Series pUC LaqI BamHI EcoRI Frag a LacZ 5-ATG AAT GGA TCC CCC GAA TTC CAG CAT TAG-3 5-CAT TTA CCT AGG GGG CTT AAG GTC GTA ATC-3 p Lac O Lac Cepa: AmpS, ∆M15 DH5a, Xl1Blue Amp R ColE1, no Relajado/ relajado Tamaño: 3162 pb Plásmidos pBlueScript SK/KS LaqI KpnI SacI Frag a LacZ p Lac O Lac pT7 pT3 pT7 3´ 5´ 3´ 5´ pT3 ColE1, relajado Amp R Cepa: AmpS, ∆M15 DH5a, Xl1Blue Tamaño: 2958 pb Plásmidos pGEM-T LaqI EcoRI EcoRI Frag a LacZ -T p Lac O Lac sP6 TT3 Cepa: AmpS, ∆M15 DH5a, Xl1Blue Tamaño: 3015 pb ColE1, relajado Amp R Plásmidos pZeRO LACI XbaI XhoI Frag a LacZ/ccdb p Lac pSp6 O Lac pSp6 pT7 3´ 5´ 3´ 5´ pT7 ColE1, relajado Kan R Cepa : KanS , ccda- Top10 Tamaño: 3298 pb Plásmido de expresión LaqI Plásmidos XbaI XhoI pT7 O Lac RBS ColE1, relajado Kan R Tamaño: 3-5 kpb