Download Inicio de la caracterización molecular de la heterocromatina de S

Escribá MC (1,2), Villasante A (2), Goday C (1)
(1) Centro de Investigaciones Biológicas, CSIC, Madrid
(2) Centro de Biología Molecular "Severo Ochoa", CSIC-UAM. Madrid
CICLO CROMOSÓMICO DE Sciara coprophila
soma masculino
2
1
XX
LLL
cigoto
1
meiosis II
A•A X•X
L•L L•L
X•X
A
LL
A•A
X•X
L
L
A
A•A
X•X
5
X
3
meiosis I
meiosis
masculina
L
AA
XXX
LLL
AA
X
4
A•A A•A
X•X X•X
L•L L•L
célula
germinal
6
5
espermatozoide
LLL
meiosis femenina (ortodoxa)
2
A
XX
LL
X
soma femenino
A, X cromosomas maternos
A, X cromosomas paternos
AA
XX
AXL
oocito
Eliminación de los cromosomas X y L en el soma embrionario
L
Xp
Meiosis masculina en S coprophila
Meiosis I
L
Meiosis II
M+L
Xm
Xm
xm
L
P
profase I
pro-metafase I
P
P
anafase I
P
anafase II telofase II
metafase II
P: cromosomas paternos
M: cromosomas maternos
Xm: X materno
L: cromosomas L
P
Características Heterocromatina y Eucromatina.
HETEROCROMATINA
EUCROMATINA
Muy condensada
Poco condensada
Regiones pericentroméricas y telómeros
Brazos de los cromosomas
Rica en secuencias repetidas
Pocas secuencias repetidas
Pobre en genes
Rica en genes
Replica tardíamente en la fase S
Replica en la fase S
No recombina durante la meiosis
Recombina durante la meiosis
Histonas hipoacetiladas, histona H3 metilada
Histonas acetiladas
en la lisina 9, proteínas heterocromáticas (HP1)
Regiones heterocromáticas de los cromosomas eucarióticos
•


Heterocromatina del Centrómero:
Típicamente compuesta por satélites de rápida evolución, por lo que no está conservada, lo que contrasta
con su función conservada.
El análisis comparativo de los centrómeros de: Drosophila melanogaster, vertebrados y plantas, muestra
una organización común con islas de transposones embebidas en grandes regiones de secuencias
repetidas.
Regiones heterocromáticas de los cromosomas eucarióticos
•


•

Heterocromatina del Centrómero:
La heterocromatina centromérica está típicamente compuesta por satélites de rápida evolución, por lo
que no está conservada, lo que contrasta con su función conservada.
El análisis comparativo de los centrómeros de: Drosophila melanogaster, vertebrados y plantas, muestra
una organización común con islas de transposones embebidas en grandes regiones de secuencias
repetidas.
Heterocromatina subtelomérica:
Las regiones subteloméricas de todos los organismos eucariotas consisten en mosaicos de repeticiones y
retrotransposones estructurados de una forma notablemente similar a centrómeros.
Regiones heterocromáticas de los cromosomas eucarióticos
•


Heterocromatina del Centrómero:
Típicamente compuesta por satélites de rápida evolución, por lo que no está conservada, lo que contrasta
con su función conservada.
El análisis comparativo de los centrómeros de: Drosophila melanogaster, vertebrados y plantas, muestra
una organización común con islas de transposones embebidas en grandes regiones de secuencias
repetidas.
•

Heterocromatina subtelomérica:
Las regiones subteloméricas de todos los organismos eucariotas consisten en mosaicos de repeticiones y
retrotransposones estructurados de una forma notablemente similar a centrómeros.
•

Telómeros:
Región final del cromosoma que se requiere para completar la replicación, apareamiento meiótico, y la
estabilidad del cromosoma.
La secuencia (TTNGGG)n está conservada en la mayoría de especies eucariotas.
La secuencia telomérica (TTAGGG)n se encuentra en todos los vertebrados.
Parece ser que la secuencia (TTAGG)n está restringida a los artrópodos, existiendo en la mayoría de
especies de insectos, excepto en dípteros y algunos coleópteros.
Se considera que las especies de Dípteros no tienen telomerasa y en consecuencia carecen de las típicas
repeticiones teloméricas ricas en GT.




Genoma de S. coprophila
•
Organización molecular poco conocida. Recientemente se han identificado, las primeras proteínas
heterocromáticas (ScoHET 1 y ScoHET2).
•
S coprophila tiene un bajo contenido en heterocromatina y ADN altamente repetido en comparación
con Drosophila melanogaster (Abbott et al., 1981).
•
Se desconocen las secuencias de ADN que conforman la heterocromatina en S. coprophila, presente en
las regiones pericentroméricas, telómeros y zonas subterminales de los cromosomas del complemento
regular y en los cromosomas L, exclusivos de la línea germinal y de función desconocida (1).
•
La heterocromatina próxima al centrómero en el brazo corto del cromosoma X contienen la mayoría de
las copias de los genes ribosómicos (1).
1 (Crouse, 1943; Grabrusewycz-Garcia, 1964; Eastman et al., 1980)
¿Por qué es de interés investigar la organización molecular de la heterocromatina en
S. coprophila?
1.
Importancia conocida en la segregación cromosómica (cohesión de cromátidas,
centrómero).
2.
Existen datos concluyentes que indican un papel importante de la heterocromatina
adyacente al centrómero del cromosoma X, en la regulación de la eliminación de
cromosomas X paternos en las células somáticas embrionarias, y también en la nodisyunción del cromosoma X materno durante la meiosis II masculina. En esta región
heterocromática existe un elemento denominado “CE” (controlling element), que controla
estos fenómenos y que es aún desconocido (Crouse et al., 1977; Crouse, 1979).
T1
T29
T32
H1
T23
T70
H2
H3
X
II
III
IV
X
T1
II
II
X
X
II
T32
II
X
X
IV
T29
IV
X
X
IV
T70
IV
X
X
T23
III
III
X
(Crouse et al., 1977; Crouse, 1979)
¿Por qué es de interés investigar la organización molecular de la heterocromatina en S. coprophila?
1.
Importancia conocida en la segregación cromosómica (cohesión de cromátidas,
centrómero).
2.
Existen datos concluyentes que indican un papel importante de la heterocromatina
adyacente al centrómero del cromosoma X en la regulación de la eliminación de
cromosomas X paternos en las células somáticas embrionarias y también en la nodisyunción del cromosoma X materno durante la meiosis II masculina. En esta región
heterocromática existe un elemento denominado “CE” (controlling element), que controla
estos fenómenos y que es aún desconocido (Crouse et al., 1977; Crouse, 1979).
3.
Los cromosomas L (germline-limited chromosomes) son de naturaleza heterocromática, se
desconoce su organización a nivel molecular y se eliminan del soma de forma idéntica a los
cromosomas X. Se supone que contienen una o mas copias del elemento CE.
Microdissection and Cloning of DNA from a Specific Region of Drosophila melanogaster
Polytene Chromosomes
F. Scalenghe , E. Turco , J.E. Edström , V. Pirrotta and M. Melli (1981)
Chromosoma (Berl.) 82, 205416
Cloning regions of the Drosophila genome by microdissection of polytene chromosome DNA
and PCR with nonspecific primer
Cedric S.Wesley, Mathew Ben, Martin Kreitman, Nabil Hagag', and Walter F.Eanes(1989)
Nucleic Acids Research, Vol. 18, No. 3
Molecular Cloning of DNA from Specific Chromosomal Regions by Microdissection and
Sequence-Independent Amplification of DNA
DANIEL H. JOHNSON (1990)
GENOMICS 6,243-251
Microdissection and sequence analysis of pericentric heterochromatin from the Drosophila
melanogaster mutant Suppressor of Underreplication
Yuri M. Moshkin · Stepan N. Belyakin Nikolay B. Rubtsov · Elena B. Kokoza Artem A. Alekseyenko · Elena I.
Volkova Elena S. Belyaeva · Igor V. Makunin · Pierre Spierer and Igor F. Zhimulev (2002)
Chromosoma 111:114–125
Molecular evolution of homologous gene sequences in germline-limited and somatic
chromosomes of Acricotopus
Wolfgang Staiber(2004)
Genome 47: 732–741
Microdisección
DOP PCR
(Librerías de
ADN)
Clonaje en
TOPO
Secuenciación
Hibridación in
situ
Microdisección de regiones heterocromáticas del genoma de
S. coprophila
(C. Goday,V. Trivonov y M. Fergusson-Smith.
Cambridge University. UK )
•
Región pericentromérica del cromosoma X y regiones teloméricas de autosomas, a partir de
cromosomas politénicos de glándulas salivales.
Cromosomas politénicos de las glándulas salivares de S. coprophila
C
III
IV
C
X
C
C
II
Microdisección de regiones heterocromáticas del genoma de
S. coprophila
(C Goday,Vladimir Trivonov y M Fergusson-Smith.
Cambridge University. UK )
•
Región peri-centromérica del cromosoma X y regiones teloméricas de autosomas, a partir de
cromosomas politénicos de glándulas salivales.
•
Cromosomas L enteros a partir de núcleos pre-meióticos de la línea germinal.
Célula de la línea germinal
L
Microdisección de la heterocromatina del Cromosoma X
X
DOP-PCR
DOP PCR
•
PCR al azar con el primer degenerado DOP {CCGACTCGAGNNNNNNATCTCG}
•
Este “primer,, o iniciador contiene una mezcla de todos los cuatro posibles nucleótidos
(abreviados en la letra N) en una posición determinada.
•
Resultado: obtenemos una conjunto de secuencias correspondientes a la zona microdiseccionada, que podrán ser clonadas.
Genotecas generadas
Telómeros (5)
Cromosomas L (3)
Heterocromatina del cromosoma X(2)
Comprobación del marcaje de la genoteca mediante hibridación in situ
Los clones obtenidos se están secuenciando y su localización en la
heterocromatina se está determinando mediante experimentos de
hibridación in situ sobre cromosomas politénicos y cromosomas de
células germinales de S. coprophila
- número de clones secuenciados: 768
- número de clones analizados por hibridación in situ: 52
- localizados en los cromosomas: 23
3X01 C3 (rDNA
CGACTCGAGGTACATATGTGGCCGA
CTCGAGGTACCAATGTGGCCGACTC
GAGGTTCGTATGTGGCCGACTCGAG
GGCCCTATGTGGCCGATCCGACTCG
AGGGGGGGATGTAGGTCTTCTTTCC
CCGCTAATTATTCCAAGCCCGTTCC
CTTGGCTGTGGtTTCGCTAGATAGT
AGATAGGGACAGTAGGAATCTCGTT
AATCCATTTATGCGCGTCACTAATT
AGATGACGAGGCATTTGGCTACCTT
AAGAGAGTCATAGTTACTCCCGCCg
tTTACCCGCGCTTACTTGAATTTCT
TCACTTTGACATTCAGAGCACTAGG
CAGAAATCACaTTGTGTCAACACCC
GCTAGGGCCATCACAATGCTTtGTt
TTAATTAGACAGtCgGATTCcCCag
GaCCgTGCCAGTTCTGAATtAATtG
TTtATtGATAATCGAACTtGATGGA
AAGCcGTTAAGCCCTCtACcATCAt
AGCAAGAAAGcTCCACAtCTTTG
X
28s)
3X01 F7 (Repeticiones)
CCGACTCGAGCGTGCCATGTGGTTAT
TATATACGAATATTATCCTGATATTA
TGCGCTTATTATACACGAAtATTATT
TCGATATTATCCTGATGCGATTAATA
TACACGAATATTATCTCGATGTTATC
CTGATTCGATTATCATAGACGAATAT
TATCTCTATATTATACTGATATTATG
CGGTTATTATATACGAATATTATCTC
TATATTATCCTGATGCGTTTATTGTA
CACGAATATTATTTCGATATTATCCT
GATTCGATTATTATACACGAATATTA
TCTCGATATTATCCTGATATTATGTG
GtTATCATACACGAATATTATCTCGA
TATTATCCTGATATTATGCAGTTATT
ATACAGGAATATTATATCGAATTATA
CTGATATTATGTCGTTATTATATACG
AATATTATCCTGATATTATGCGCTTA
TTATACACGAATATTATCTCGATATT
ATCCTGATGCGATTAATATACACGAA
TATTATCTCGATGTTATCCTGATTCG
ATTATCATAGACGAATATTATCTCTA
TATTATACTGATATTATGCGGTTATT
ATATACGAATATTATCTCTATATTAG
CCACATCCTACCCTCGAGTCGGCCAC
ATCGCTAACTCGAGTCGGcCACATCT
TGTTCTCGAGTCGGCCACATCTTGTT
CTCGAGtCGG
X
L
X
IV
4Tel01 F4
(Transcriptasa reversa, Ostrinia nubilalis)
CCGACTCGAGGGGGAGTGTGGTCTCTAGTTCATGATC
TTTTTGGTCCAACGTTCGTCCGTCCTTCTTGCAATAT
GTCCCGCCCAGCTCCACTTTAAAGATGCTATTCTTTC
CATGACATCAACGACCCTGGTTTGTTGTCGAATCCAT
TGATTTGTCATTCTATCTCTGAGCGTAATTCCAAGCA
TACTTCGTTCCATAGCTCTTTGTGCCACTCTTAATTT
ATTTTCGGAAGCTTTTGTTAACGTTAACGTTTACGCT
CCACATAAAGCCCTCGAGTCGG
C
II/III
IV
C
C
X
C
4Tel01 F8 (Repeticiones)
IV
C
X
CCGACTCGAGATGAACATGTGGGTTTAGCACTGCTAT
AGGTACTAAGGCGCAATATTCAAAAATCCTTCAGAGT
GTAAAAAACTTAGAGGGCATGGCTCGGGCATGTAAAA
AGTACCTTCACTAGCTATAGCAGCAAATGGTAGCCGA
ATCTGTCACTTAAAAAAATGTGTCCTCCCGGCTGAAC
AATAACCATACGCTATTATTATTATTATAGTAGAACC
TGCAATTGGTACTGCAGCTGTACTAATGCTGTATTGG
TTACCGTTTTTCAAAGGCTAGTAGTAATCATTCTTTG
ACTTTGGATGCAATTGTTCGCAAGATCTATGCAATAA
TGTGGCATAATGTGCTTGCTATCTCAGCCGGAATGTT
CAACTTGACATGAATTTTTAATAAAACGGGAATGTTC
TAAGAAATTATCGTAATGAACAAAAAAGATAAGTCGA
CAGAAGTGTCACAATTCTAACTAGAACTTTAGTGAAG
CCTAATGGTGAATTGCTACCATTAGACTTCATTAAAG
TATTCATGGTACTAAAGATACTATTGGTAATAATGGT
ACTAAACTAATGGTATTAATGGTACTAATGGTACTAA
TGGTGTGAATTGTATGCGTGATAATGGTGTGAATGGT
ACTAATGGTGTGAATGGAACTAATGGTGTGAATAGCA
CTAATGGTGTGAATAGCATTAGTGGTGTGAATGGTAT
GAATGGTACTATTGGTGGGAATGGTACTGATGGTATG
AATGATACTAATTCCCTTGACTGAAAGTCAGGGTCTT
ATGAAAGAAAATACCCCTTAAATGTCCGTAACGCTAA
GTTCACTTTGATATTTTGAAATGTTCCTATATtGGCA
AAAAACGTTAAATACAGAAAACGTCCGTACCCTTGTG
GACTCGATAGCtCGAGTAaTtCTTTACcGATTTGCAA
AATTTTGGTTTTATCCGAcGGaAAATGAAAATCaTGG
aGGTTAAGTTCGTAGAATGGCCAAtaTTGGGGTATGa
GATGGGaGTTATTCTCAaGGATTTTTTTTCTtGTTAC
CCCCaCAtACCCCCCTCGagtcGG
X’
X
GINOGINIA Y ANDROGINIA EN Sciara coprophila
A
a
W
s
Hembra ginogénica
(productora de hembras)
X’X
Línea
somática
X’X
Línea
somática
FM
A a a
W s s
Hembra ginogénica
XX
a a
s s
XX
a a
s s
a a
s s
A a
W s
A
W
X
XX
oocitos
X’
X
Gametos
Hembra androgénica
(productora de machos)
a
s
A a
W s
Línea
germinal
Machos
espermatozoides
XX
a a
s s
a
s
FM
oocitos
X
a a a
sX’Xs s
Hembra androgénica
A alelo constitutivo del factor
Wmaterno
marcador dominante “wavy”
a
s
FM
a a a
sX’ s s
Macho
Factor mate
s marcador recesivo
“sw
HETEROCROMATINA DE Sciara coprophila
T1
T29
T32
H1
T23
T70
H2
X
II
III
IV
H3
X
T1
II
II
X
X
T32
II
II
X
X
T29
IV
IV
X
X
T70
IV
IV
X
Helen V. Crouse Chromosoma
A
B
maternal autosomes
paternal autosomes
maternal X chromosome
paternal X chromosomes
C
Meiosis I
A
BB
Meiosis II
C
paternal autosomes
maternal autosomes
maternal X chromosome paternal X chromosome
D
E
polar complex
microtubules
bud
MODELO DE DOS FACTORES
MODELO DE UN FACTOR
Embrión hembra
Embrión macho
Xm
Xp
Xp
FM
XpXp
Eliminación del cromosoma X
Xm
Xp
Factor cromosómico
Factor materno
Xm
Xp
Xp
FC FC
FM
FM
Xp
Xm
Xp
Xp
Embrión hembra
Xm
Xp
Embrión macho
FC
Eliminación del cromosoma X
Xm
Xp
Xm
Xp
Xp
FM
FC
XpXp
Xm
Cell type
Eliminated
chromosomes
Relevant cytological events
Proposed elimination
mechanism
Embryonic
somatic cells
One paternal X
chromosome in
female embryos. Two
paternal X
chromosomes in male
embryos.
All L chromosomes.
Incomplete anaphasic movement of
eliminating chromosomes.
Failure of sister chromatid
separation.
Embryonic
germ cells
One paternal X
chromosome in male
and female embryos.
All L chromosomes
but two.
Atypical intherphasic chromosome
condensation.
Chromosome extrusion into a nuclear
bulge.
Active participation of the nuclear
membrane.
Primary
spermatocytes
Paternal X
chromosome.
Paternal autosomes.
No pairing of homolog chromosomes.
Formation of a monopolar first meiotic
spindle.
Absence of metaphasic alignment.
Bud formation and generation of nonspindle microtubules.
Differential kinetic behavior of
maternal and paternal chromosomes
is accomplished by the first meiotic
spindle and by non-spindle
cytoplasmic bud-microtubules.
Maternal autosomal
chromatid set.
L chromatid set.
Maintenance of the first spindle polar
structure and formation of an asterless
second meiotic spindle.
Non-disjunction of maternal X
chromosome.
Presence of bud-generated microtubules.
Elimination is mediated by the
second meiotic spindle and by nonspindle cytoplasmic budmicrotubules.
(M eiosis I)
Secondary
spermatocytes
(M eiosis II)
Chromosome elimination in the soma
Cytological events
(Anaphase)
Proposed elimination
mechanisms
Alterations in centromere
kinetic activity
Sciaridae
E
Incomplete anaphasic movement
of chromosomes.
Chironomidae
E
Lack of anaphasic movement of
chromosomes.
Failure of sister chromatid
separation at centromeric regions.
Aberrant anaphasic movement
of chromosomes.
Alterations in centromere
kinetic activity.
Failure of sister chromatid
separation at chromosomes arms.
E
Cecidomyiidae
E
E
E