Download células competentes

TRANSFORMACIÓN
Fred Griffith 1928, estudió
Streptococcus pneumoniae
Conclusión: Las células R
“absorbieron” “algo” de las células S
“principio transformante”
El Principio transformante es DNA!
TRANSFORMACIÓN
CAMBIO HEREDABLE EN UNA CÉLULA U ORGANISMO PRODUCIDO POR LA
INTRODUCCIÓN DE DNA EXÓGENO
Puede ser:
NATURAL (se han encontrado
aproximadamente 40 especies
que pueden realizar este
proceso)
ARTIFICIAL (INDUCIDA)
TRANSFORMACIÓN
¿Para qué tomar DNA exógeno?.... Grandes maquinarias
proteícas intervienen en el proceso de transformación
Algunas hipótesis que no son excluyentes…..
I. Para la diversidad genética (por ejemplo: obtener
resistencia a antibióticos)
II. Para la reparación de DNA
III. Como nutrientes: El DNA es fuente de carbono,
nitrógeno y fósforo
SEMEJANZAS Y DIFERENCIAS
TRANSFORMACIÓN vs CONJUGACIÓN
¿existe DNA libre en todos los ambientes, es estable?
TRANSFORMACIÓN NATURAL,
las bacterias más estudiadas son
GRAM +
GRAM -
Streptococcus pneumoniae
Bacillus subtilis
Neisseria gonorrhoeae
Haemophilus influenzae
El proceso de transformación se puede dividir en 2 ETAPAS
ETAPA 1: Desarrollo de un estado competente
Unión
ETAPA 2: Procesamiento del DNA
Importe
Recombinación
Etapa 1: Desarrollo de un estado competente
¿Qué es una célula competente?
Estado fisiológico inducible
Factores que inducen el estado
de competencia en la
transformación natural:
Limitación en los nutrientes
Mitomicina C
Alta densidad celular
Temperatura, pH
La transcripción de los
genes com se inducen
durante el estado de
competencia
Velocidad de transferencia: 90-100 nucleótidos/segundo a 30°C
La transcripción de los genes com se inducen
durante el estado de competencia
TRANSFORMACIÓN ARTIFICIAL
El “caballito de batalla” es la bacteria Escherichia coli
Es una técnica fundamental en biología molecular:
clonación y generación de organismos transgénicos
PLÁSMIDOS
OBJETIVO DE LA PRÁCTICA:
OBTENER BACTERIAS RESISTENTES A
KANAMICINA
Escherichia coli
Medio LB + KANAMICINA
En la transformación artificial
¿cómo se induce el estado
competente de una bacteria?
1. Tratamiento químico
2. Electroporación
Preparar células competentes de E. coli
E. coli
A= 0.6 – 0.8 a 600 nm
3 mL medio
Luria
Incubar toda la
noche a 37°C
Preparar células competentes de E. coli
5000 r.p.m.
5 min
4°C
3 mL NaCl
5 mL CaCl2
Resuspender
Resuspender
CÉLULAS
COMPETENTES
Incubar 20 min
2500 r.p.m
7 min
LA TRANSFORMACIÓN SE REALIZARÁ POR CHOQUE TÉRMICO
Plásmido 1 hr
42°C
70 s
Incubar a
37°C con
agitación por
45 min
1 mL medio
SOC
Inmediatamente en
hielo
Esquema general
A nivel molecular
Electroporación
Utilizaremos el plásmido pET-TEM
Sitio múltiple de
restricción
Gen que confiere
resistencia a kanamicina:
kanamicina fosfotransferasa
Origen de
replicación
Enzimas inactivadoras de aminoglucósidos:
La resistencia de las cepas se hace por síntesis de enzimas
generalmente codificadas por plásmidos.
La inactivación de los aminoglucósidos se hace por:
1.Adenilación de grupos hidroxilo.
2.Fosforilación de grupos hidroxilo.
3.Acetilación de grupos amino.
ENZIMA INACTIVADORA
AMINOGLUCÓSIDO
INACTIVADO:
Gentamicina adeniltransferasa
Gentamicinas, Sisomicina,
Kanamicinas, Tobramicina.
Gentamicina acetiltransferasa
Netilmicina, Tobramicina,
Gentamicinas, Sisomicina.
Kanamicina acetiltransferasa
Netilmicina, Amikacina,
Neomicina, Kanamicinas,
Tobramicina, Gentamicinas,
Sisomicina.
Neomicina, Kanamicina
fosfotransferasa
Gentamicina A, Neomicina,
Kanamicina
TRANSFORMACIÓN: HERRAMIENTA ÚTIL EN EL CAMPO
DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR
VECORES GENÉTICOS: molécula de DNA que es usada como vehículo para
transportar segmentos de DNA foráneo en una célula huésped,
ESQUEMA GENERAL
SESIÓN I: TRANSFORMAR cepas de E. coli con un plásmido para
que adquieran resistencia a un antibiótico
SESIÓN 2: AISLAR el plásmido mediante la técnica de
Lisis alcalina
SESIÓN 3: FUNCIóN DE LAS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
Cortar el plásmido aislado con enzimas de restricción y visualizarlo en
un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio
Células
no
transformantes
Células
transformantes
Medio Luiria + KANAMICINA