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La reacción de PCR y sus aplicaciones Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) primers DNA producto PCR: cinética nº ciclos PCR: diseñando ciclos 92ºC 72ºC 92ºC 55ºC 72ºC 55ºC 92ºC 72ºC 55ºC RT Desnaturalización: Lo mas corto posible Evita inactivación enzima Anillamiento: Lo mas cerca posible de las Tm de los primers Extensión: Lo mas extenso posible para asegurar fragmentos completos DNA producto primers Enzyme activity PCR: cinética nº ciclos DNA polimerasas termoestables • Procesividad: 5’-3’ actividad de síntesis • Fidelidad: 3’-5’ exonucleasa • Adición de As Procesividad 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ Tiempo de extensión: Taq polimerasa: 2 Kb/min Pfu polimerasa: 0.5 Kb/ min Pwo polimerasa: 1 Kb/min Fidelidad en la PCR 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ Polimerasa 3’-5’ exo Tasa de error % productos con mutación Taq polimerasa NO 8.0x10-6 16.0 Pfu polimerasa SI 1.3x10-6 2.6 Pwo polimerasa SI 0.4x10-6 0.7 Adición de As -A3’ 5’ 3’A- -A3’ 5’ Adición de As: Taq polimerasa: SI Pfu polimerasa: NO Pwo polimerasa: NO -T3’ 3’T- -T A A T Optimización de PCR • • • • • • Parametros del ciclo – Minimo numero de ciclos – Las tres reglas Diseño de oligos – Tm’s 55-80ºC – No concentrar GC en el extremo 3’ Concentración de Mg2+ (0.5-3 mM) – Demasiado da inespecificidad – Poco da poca producción Coadyuvantes – BSA: estabiliza la polimerasa y secuestra inhibidores no especificos – Formamida: Baja la temperatura de desnaturalización (moldes ricos en GC) – DMSO: Ayuda la elongación en moldes ricos en GC Mezcla de polimerasas Hot start Algunas aplicaciones • • Obtener genes – PCR degenerada – PCR reversa Modificar genes – Introducir sitios de restricción – Mutagénesis dirigida – Mutagénesis al azar PCR degenerada ADRGT 5’ACNGCYTGNTGRCGN3’ • • • YKILP 5’NTTNCAYGARTCYTT3’ PCR en condiciones poco estrictas – Temperatura – Mg++ – Concentracion de oligos Diseño de los primers: – Tamaño minimo (21 mer) – Evitar aminoacidos con mas de un tipo de codon – No mas de tres G o C seguidas en los ultimos tres nucleotidos PCR con primers en solitario PCR reversa PCR reversa Touch-down PCR Nested touch-down PCR Nested PCR X bp Y bp Fragmento A: Z pb X bp Fragmento B: Z -(X+Y)pb Y bp Touch-down PCR 94ºC 60-65ºC Introduciendo sitios de restricción RE2 RE1 RE1 RE1 RE2 RE2 RE1 RE2 Mutagénesis al azar localizada RE2 RE1 RE1 RE2 RE1 RE1 RE1 RE2 • RE1 RE2 RE2 RE1 RE1 PCR en condiciones de baja fidelidad – Desbalance de nucleotidos – Mn ++ en vez de Mg++ – Polimerasas mutantes RE2 RE2 RE1 RE2 RE2 RE1 RE1 RE2 RE2 Mutagénesis sitio-específica MUT1 RE1 MUT2 RE1+MUT1 RE2+MUT2 RE2 RE1 RE1 RE2 RE2
