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Genética Molecular 2011
Expresión y purificación
de Proteínas de Fusión
¿Qué es una proteína de fusión?
Es a combinación de una proteína de interés fusionada a otra proteína o péptido
conocidos, denominados Tags. Los Tags pueden estar en el NH2 o COOH.
Tag
Mi Proteína
Mi Proteína
Tag
¿Qué herramienta biológica de la síntesis de proteínas se
utiliza para crear una proteína de fusión?
Básicamente, un mRNA con un marco abierto de lectura (open reading frame,
ORF) de codones cualquiera, sin STOPs, puede ser traducido a proteína. Las
proteínas de fusión se basan en esta premisa.
Codón de inicio: ATG (Met)
Codones STOP: TAG, TGA TAA
¿Por qué son importantes las proteínas de fusión?
Las técnicas de ADN recombinante revolucionaron la producción y purificación de
proteínas. Permite la purificación de la proteína en pocos pasos, y evita purificar
proteínas endógenas.
ADN recombinante
Clonado de gen de interés en
marco con la secuencia del
Tag
bacterias
(o cel. eucariota)
Fusión de secuencia del gen
de interés con secuencia del Tag
mucha proteína
Introducción del ADN
recombinante en
bacterias o línea celular donde
se expresa la proteína de fusión
¿Qué sistema elegirían para expresar proteínas recombinantes
y tener mucha proteína?
Lo más común es usar Escherichia coli
Ventajas:
Se obtiene mucha cantidad de proteína, es fácil de crecer, de inducir y de
purificar la proteína de fusión.
Desventajas:
No realizan modificaciones post-traduccionales, necesarias para el correcto
plegamiento y/o actividad de ciertas proteínas. Es posible que no haya un
correcto plegamiento de la proteína y haya que pasar a otro sistema (células
de mamífero, de insecto, levaduras…).
¿Cuando se debe inducir la expresión de una proteína en
bacterias?
Fase exponencial (o Log): máxima tasa de división celular; maquinaria transcripcional
y traduccional muy activa.
Vectores inducibles de expresión en procariotas:
se basan en el sistema del operon lac (requerido para el
transporte y metabolismo de la lactosa en E. coli)
En la práctica:
situaciones de
represión y
activación de la
transcripción del
gen de interés
Sistema pET: doble sistema de inducción;
disminuye la expresión “leaky”
Cuerpos de inclusión: problema o ventaja?
Son agregados insolubles de proteína desnaturalizada.
Su formación depende de la naturaleza de la proteína y su nivel de expresión.
Son fácilmente purificables (casi todo proteína recombinante), pero para obtener
la proteína hay que hacerlo en condiciones desnaturalizantes (urea 8M).
Cuerpos de inclusión
de β-lactamasa en E.
coli.
Las fusiones permiten:
• Fácil y rápida purificación de la proteína expresada en bacterias,
basada en las propiedades del Tag (cromatografía de afinidad, anticuerpos).
M: marker
L: lisado de bacterias
F: percolado
E: eluído
Las fusiones permiten:
• Direccionar la localización de proteínas de fusión en bacterias:
Periplasma: fácil purificación, pocas proteínas contaminantes, ambiente
favorable para el buen plegamiento y la formación de puentes disulfuro.
Secreción al medio: pocas proteínas contaminantes, fácil purificación.
• Aumentar la solubilidad de las proteínas de fusión.
• Caracterización de proteínas (principalmente en interacciones proteína:proteína;
ensayo de doble hibrido, GST-pull down, co-inmunoprecipitación).
• Localización de proteínas en células eucariotas por fusión a proteínas o Tags
fluorescentes (microscopía de fluorescencia) o Tags contra los que hay
anticuerpos comerciales (inmunofluorescencia).
Clasificación de Tags (muchos Tags cumplen más de una función)
Por afinidad a un ligando (GST)
De purificación
De purificación
GST (Glutathione S-Transferase):
26 kDa, originalmente clonada del parásito Schistosoma japonicum. Muy fácil
purificación. GST aumenta la solubilidad de la proteína.
CO H
2
O
H
N
H N
2
OH
N
H
O
O
H
La proteína de fusión
se purifica por
cromatografía de
afinidad usando
glutation inmobilizado
sobre agarosa.
Ventajas:
Elución suave
Buen rendimiento
Único paso de purificación
Glutathione (GSH)
Glutathione
and electrophile E
(toxic products)
S -transferase
CO H
2
O
H
N
H N
2
N
H
O
S
E
OH
O
Desventaja:
solo puede realizarse en
condiciones nativas
Clasificación de los Tags (muchos Tags cumplen más de una función)
Por afinidad a un ligando (GST)
De purificación
Por características químicas del Tag (His-Tag).
De purificación
His-Tag:
Tag lineal que contiene 4, 6 o 10 Histidinas consecutivas.
Es muy pequeño (menor a 1kDa).
Permite la purificación aún en condiciones desnaturalizantes (Urea 8M).
Se obtiene buen rendimiento de purificación. Único paso de purificación.
El Tag no interfiere con el plegamiento ni con la función de la proteína.
Se purifican por IMAC
(Immobilized-metal affinity chromatography)
El His-Tag se une a cationes divalentes
(el más usado es Ni2+) inmobilizados en la resina.
Se eluye compitiendo las histidinas con Imidazol
(residuo de la histidina
)
Purificación en condiciones desnaturalizantes:
La proteína expresada se aglutina en “cuerpos de inclusión”. Son agregados
insolubles que mayormente contienen la proteína de interés. Pueden ser
disueltos usando detergentes suaves y UREA 8M, con la consecuente
desnaturalización de las proteínas.
Esto puede ocurrir por:
Expresión muy alta de la proteína de interés y que esta no se llegue a plegar
bien.
Proteínas muy poco solubles, no solubles o que tengan pasos transmembrana
hidrofóbicos.
Proteínas que necesiten modificaciones post-traduccionales para su correcto
plegamiento.
De purificación
His-Tag:
Esquema de purificación:
Muy usado en expresión en bacterias.
Las resinas son reusables.
Alto rendimiento.
Clasificación de los Tags (muchos Tags cumplen más de una función)
Por afinidad a un ligando (GST)
De purificación
Por características químicas del Tag (His-Tag).
Por anticuerpos comerciales (T7, FLAG, HA, C-Myc, etc)
Purificación por anticuerpos comerciales sobre tags cortos:
T7-Tag: derivado del gen 10 del fago T7 que es la proteína más abundante del
fago. Secuencia: MASTGGQQMG
FLAG: péptido comercial muy inmunogénico. Secuencia: DYKDDDDK
HA-Tag: residuos 98-106 del la hemaglutinina del virus de influenza humano.
Secuencia: YPYDVPDYA
C-Myc: residuos 408-439 del producto del oncogen c-myc humano.
Todos estos Tags pueden usarse para purificar las proteínas tanto de bacterias
como de células eucariotas transfectadas, usando anticuerpos comerciales. No
es lo más recomendable en bacterias en el caso de poder usar fusiones a GST
o HIS-Tag.
Clasificación de los Tags (muchos Tags cumplen más de una función)
Por afinidad a un ligando (GST)
De purificación
Por características químicas del Tag (His-Tag).
Por anticuerpos comerciales (T7, FLAG, HA, C-Myc, etc)
De localización en bacterias
Secuencias de localización periplásmica
(mejora el plegamiento por favorecer
formación de S-S).
Secuencias que permiten la secreción al
medio de cultivo (fácil purificación).
De aumento de solubilidad
NusA. Es una de las proteínas más solubles
conocidas.
Localización de proteínas
GFP, DsRed.
Anticuerpos comerciales contra Tags (FLAG, HA,
c-Myc, T7) por inmunofluorescencia.
Localización de proteínas
GFP (Green Fluorescent Protein):
Provenie de la medusa Aequorea victoria.
GFP es una proteína muy estable de 238 aa.
Cuando se expresa en células eucariotas o procariotas,
y es iluminada por luz azul o UV, emite fluorescencia verde brillante
(energía de una fuente lumínica es absorbida y reemitida).
La fluorescencia de GFP es independiente de la especie que la expresa, no
necesita cofactores, sustratos u otros productos génicos de A. victoria.
Ampliamente usada como proteína de fusión o gen reportero.
Hay variantes de GFP logradas por mutaciones puntuales.
Localización de proteínas
GFP (Green Fluorescent Protein):
Puede usarse para ”taguear” proteínas individuales en células vivas, y hasta 2
o más proteínas distintas en una misma célula con las variantes de GFP.
No modifica la localización de su proteína “partner”.
Usada en todos los organismos, desde levaduras hasta mamíferos.
Proteína de fusión
expresada en levaduras
Ratones que expresan GFP
en todas sus células
Localización de proteínas
DsRed (Proteína Roja Fluorescente):
• Proviene del coral de arrecife Discosoma sp.
• Muy usado últimamente como marcador de células y como tag de fusión.
• Comparte las mismas características con GFP.
• A través de mutaciones en la secuencia de AA se han podido crear variantes
de absorción y emisión muy útiles para usar más de un tag por célula.
mHoneydew mBanana mOrange tdTomato mTangerine mStrawberry mCherry
Localización de proteínas
Tags cortos contra los que existen anticuerpos comerciales:
Inmunofluorescencia indirecta:
FLAG, HA,
c-Myc, T7
1°. Anticuerpo primarios (mAb)
2°. Anticuerpo secundarios conjugados a fluoróforos
Permiten ver localización subcelular de proteínas fusionadas a estos Tags
(solo en células fijadas = MUERTAS); los anticuerpos deben ser introducidos
dentro de las células).
Volviendo a las proteínas recombinantes...
Muchas veces se necesita eliminar el Tag de la proteína de interés
Corte de los Tags
secuencia de clivaje por proteasas incluída
Obtención de la estructura primaria nativa de la proteína por corte
con una proteasa. Secuencia de clivaje entre el Tag y la proteína de interés.
TAG
PDI
Esquema de obtención de proteínas nativas clivadas del Tag
Por hoy ya es suficiente…