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TEMA 3. Algunas aplicaciones de la biotecnología
genética a la biotecnología alimentaria
1- Diagnóstico de patologías hereditarias con repercusión sobre la
cantidad o calidad de los productos
2- Detección de genes con influencia en la cantidad o calidad de
los productos
3- Identificación genética individual, racial o específica
4- Detección de microorganismos en alimentos
5- Detección de transgénicos
1. DIAGNÓSTICO DE PATOLOGÍAS HEREDITARIAS
OMIA (Online Mendelian Inheritance in Animals) :
Base de datos de genes y enfermedades hereditarias en
137 especies animales
DOG
VACA
GATO
CERDO
CABALLO
OVEJA
POLLO
CABRA
CONEJO
OTROS
TOTAL
Total
Caracteres
567
408
298
223
205
202
188
72
59
593
2815
Caracteres
mendelianos
204
119
66
37
88
79
81
11
21
117
773
Caracteres
Mendelianos
(mutación
conocida)
150
70
37
15
24
25
28
8
7
52
416
Potenciales
modelos
caracteres
humanos
268
137
151
75
104
75
40
29
38
255
1172
Malignant hyperthermia (Phene ID 1193, Group 000621) in Sus scrofa
Possible human homologue (MIM number) 145600 180901
Symbol PSS
Cross Species Summary
Malignant hyperthermia. A progressive increase in body temperature, muscle rigidity and metabolic acidosis,
leading to rapid death.
Summary
In pigs, malignant hyperthermia (MH) leads to rapid post-mortem changes in muscle, resulting in pale soft
exudative (PSE) meat. MH can be triggered by a minor stress, such as loading, transport, sexual
intercourse, high ambient temperature, or exposure to the anaesthetic halothane. Susceptibility to
halothane-induced MH is an autosomal recessive trait in pigs. Together, sudden death syndrome and PSE
constitute porcine stress syndrome (PSS), which became a major economic problem in many countries in
the 1970s. In part, this was due to strong selection for increased leanness, which is associated with
susceptibility to PSS. In 1991, a major breakthrough occurred when a Canadian research team led by David
MacLennan (Fujii et al., 1991) showed that MH is due to a base substitution (C-T) in the 1843rd
nucleotide of the gene for the calcium release channel in the sarcoplasmic reticulum of skeletal
muscle. The base substitution causes an amino-acid substitution (arginine - cysteine) in the 615th position
of the calcium release channel, resulting in altered calcium flow. A PCR genotyping test based on the
causative mutation has been used extensively in many countries, leading to the elimination of the mutation
from many herds.
Species Specific Name
Porcine Stress Syndrome
Genetic Test
Various PCR genotyping tests have been devised, all based on detection of an RFLP resulting from the
causative base substitution.
Single Locus yes
Characterised at a molecular level Yes
SINDROME DE ESTRÉS PORCINO (PSS)
El Síndrome Estrés Porcino (PSS) es una enfermedad hereditaria, que
presenta un modelo de herencia recesiva
SINTOMAS
Taquicardia
Rigidez muscular
Aumento progresivo de la temperatura corporal
Muerte
LESIONES
Hipertrofia muscular
Edema pulmonar
CARNES PSE (pale, soft, exhudative)- palidas, blandas y exhudativasCARNES DFD (dark, firm, dry) – dura, seca y oscura
CARACTERÍSTICAS CARNES EN ANIMALES CON PSS
Característica
Glucólisis, descenso pH
Carne PSE
Carne DFD
muy rápido
Lentamente y
parcial
Valor pH
< 5,8
>6,2 (también
pH)
Color
pálida
oscura
Consistencia
blanda
densa, pegajosa
Capacidad de enlace de agua
baja
elevada
Pérdida de líquidos
alta
baja
Conservación
Dureza
reducida
menor
reducida
mayor
DETECCIÓN DEL SINDROME DE ESTRÉS PORCINO (PSS)
Mutación en el gen de RYR-l: Receptor de la ryanodina- Gen
para la liberación del calcio en el músculo esquelético -
Sustitución C-T en el nucleótido 1843
Sustitución arginina–cisteina en al posición 615
C/C: Individuos sanos y no portadores
C/T: Individuos sanos y portadores
T/T: Individuos enfermos
DETECCIÓN DEL SINDROME DE ESTRÉS PORCINO
PCR/RFLPs
199bp
PCR
199bp
Alelo C
Alelo T
165bp
34bp
BsiHKA I
2- Detección de genes con influencia en la
cantidad o calidad de los productos
Existen genes que determinan el sexo
y que tiene una secuencia distinta en
machos o en hembras
Importante determinar el sexo del embrión para los
programas MOET = ovulación múltiple y transferencia de
embriones, pero también el origen de determinados
productos en los que la características y el valor economico
pueden variar según el sexo
Más genes interesantes…
GENES RELACIONADOS CON LA GRASA
DAGT 1 en vacuno:
tiene una gran
influencia en la
cantidad de grasa en
la leche
G
G
grasa en
la leche
A
A
Grasa en
la leche
SI ANALIZAMOS EL ADN DE LOS INDIVIDUOS
PODREMOS SELECCIONAR DIRECTAMENTE POR EL
GENOTIPO
HAY OTROS GENES DE INTERES RELACIONADOS
CON CARACTERES PRODUCTIVOS
K-Caseína - mayor rendimiento en la producción de queso
IGF2 – Desarrollo muscular y depósitos grasos
RYR 1 – Desarrollo muscular e hipertermia maligna
Síndrome de estrés porcino (SSP)
PRKAG 3 – Aumenta la cantidad de glucógeno del músculo
en un 70% y el desarrollo muscular
MIOSTATINA –Hipertrofia muscular o doble musculatura
GEN DE LA MIOSTATINA
PERDIDA DE FUNCIÓN DEL GEN GENERA UN FENOTIPO
SIMILAR EN LAS TRES ESPECIES DE MAMÍFEROS
Hipertrofia muscular
“ CULONES “
- mayor rendimiento a la canal
- mayor proporción de músculo
- menor proporción de hueso
- mucha menor proporción de grasa
Fotografías obtenidas de Genome
research (Womack, 2005)
3. IDENTIFICACIÓN GENÉTICA
TRAZABILIDAD
AUTENTIFICACIÓN
En ambos casos se trata de utilizar los marcadores del DNA con diferentes
propósitos:
1.- Identificación individuos en diferentes etapas del proceso productivo (de la granja
a la mesa)- Verificación de otros sistemas de identificación- Sistema trazabilidad
2.- Identificación de origen genético (raza). Verificación denominaciones de origen o
marcas de calidad
3.- Identificación de especies. Identificación de especies en mezclas o sustituciones
Seguridad alimentaria
PREOCUPACIÓN CRECIENTE ENTRE LOS CONSUMIDORES
Crisis de las vacas locas, listeriosis,
dioxinas, etc
OBLIGATORIEDAD DE ESTABLECIMIENTO
DE UN SISTEMA DE TRAZABILIDAD
¿ Qué significa TRAZABILIDAD ?
“Establecimiento de un sistema que permita
identificar un animal y poder llevar a cabo el
seguimiento de sus movimientos a lo largo de toda
su vida desde el nacimiento hasta la llegada de
su carne hasta el consumidor”
Sistema de trazabilidad genética
Sistema basado en el análisis del ADN
Los animales presentan
diferencias en su ADN, a excepción
Marcadores
utilizados
:
de los
gemelos monocigóticos
o los
clones.
FUNDAMENTO:
MICROSATÉLITES
Como
media, 1 de
cada 1000Ybases
del ADN (de
SISTEMA
FIABLE
REPETIBLE
los 3.000.000.000) es diferente entre animales
La información genética
SNPs contenida en las
células es igual en todas las partes del cuerpo
del animal y no varía con el tiempo
IDENTIFICACIÓN DE ORIGEN RACIAL
CONTROL DE CALIDAD
Ejemplo: productos derivados de cerdo ibérico
(UTILIZACIÓN DE MARCADORES ESPECÍFICOS DE RAZA)
ANÁLISIS DE LOS GENES MC1R Y Pink
MC1R- Receptor de la melanocortina 1
PCR/RFLPs
Genes que determinan el color de la capa
Pink
MC1R y Pink presentan alelos fijados en la raza Duroc que no aparecen en poblaciones de cerdo ibérico
Datos obtenidos de Fernández et al 2003
IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES
Autentificación
> Demanda
de productos de calidad
Razones filosóficas
y religiosas
Cuestiones legales
Fraudes
económicos
Identificación de especies mediante RAPDs
Aplicable a la detección de fraudes en patés
C/Pt
Pt
O
Pv
Pll
C
Pt
Identificación de especies mediante RAPDs
Aplicable a carne o a quesos
750 pb
340 pb
310 pb
290 pb
Caprino
Ovino
Bovino
Identificación de especie mediante amplificación
de fragmento específico de porcino
( Patente LAGENBIO- Universidad de Zaragoza )
b
o
cp
cv pll
pv
pt
e
-
Muestras sanguíneas de diferentes especies- solamente se amplifica en cerdo
AMPLIFICACIÓN DEL FRAGMENTO ESPECÍFICO DE CERDO
EN DIFERENTES RAZAS
Pietrain
Chato Murciano
Landrace Large White
Cuantificación
Nos permite demostrar no solo que hay presencia de cerdo,
sino en que proporción en una mezcla.
1%
5%
10%
25%
50%
75%
100%
CASO PRACTICO.Identificación de especies por sustitución
•Denuncia de venta de cordero en lugar de cabrito en Navidad 08
•Utilización de RAPDs
•Recepción en el laboratorio: muestra de carne
Cabra 1 Cabra 2
Muestra Muestra
problema problema
Oveja 1
Oveja 2
vaca
SOLUCIÓN: LA MUESTRA PROBLEMA ES CORDERO Y NO CABRITO
4.- DETECCIÓN DE MICRORGANISMOS
EN ALIMENTOS
-Imprescindible en la Seguridad alimentaria
En los Estados Unidos se dan aproximadamente 76
millones de casos de intoxicación alimentaria (26.000
casos por cada 100.000 habitantes),5 de los que:
350.000 son hospitalizados (111 por 100.000 hab.)
5.000 mueren (1,7 por 100.000 hab.)
-
- Salmonella , Listeria , Toxoplasma,
Campilobacter, E.coli O157 son los agentes
màs frecuentes en las infecciones causadas por
alimentos
Tests genéticos aplicados a la detección de
microorganismos
- Se aplica la técnica de PCR
- Se basa en la identificación de un
fragmento de DNA específico del
microrganismo contaminante
Bacterias en alimentos pueden ocasionar
grandes pérdidas económicas
• Deterioran los alimentos
• Origina enfermedades en consumidores por su dificultad de eliminación
VENTAJAS
1.Sensibilidad
2.Especificidad
3.Capacidad de procesamiento de gran número de muestras
DENTRO DEL PRIMER GRUPO (deterioran los alimentos):
Detección
rápida
de
bacterias
productoras
de
exopolisacáridos del tipo beta-glucano.
El uso de este método podría permitir la prevención del
ahilamiento de bebidas alcohólicas en el que están implicados
estos polisacáridos (especialmente la sidra).
Detección gen gtf mediante PCR
DENTRO DEL SEGUNDO GRUPO (causan enfermedades)
Microrganismos
Trastorno
que ocasiona
Posible producto
portador
Método
Acrobacter spp
Diarrea
Carne de aves
RAPD-PCR
Bacillus cereus
Diarrea, vómitos
Arroz, prod. Lacteos
Y cárnicos
PCR
Campilobacter spp
Diarrea
Aves, cerdo , res y
Leche cruda
PCR múltiple
Clostridium botulinum
Botulismo, vómitos
Pescado, miel, latas
PCR anidado
Clostridium perfringens
Diarrea, dolor abd.
Carne de res y aves,
Salsas
PCR duplex
E.Coli
Diarrea, colitis
Carne y productos
Lácteos
Listeria spp
Listeriosis
PCR múltiple
RT- PCR
Salmonella spp
Pate, leche, queso, carne
Mariscos, ensalada de col
Gastroenteritis
Shigella spp
Fiebre , calambres
Leche, huevo crudo, carne
de res y ave
PCR-múltiple
RT- PCR
RT- PCR
Vibrio cholera
Cólera
Yersinia enterocolitica
Yersiniosis
Mayonesa, vegetales crudos PCR simple
Leche y aves
Ostras crudas, pescado
Leche, tofu, canales de cerdo
RT- PCR
RT- PCR
EXISTEN KITS COMERCIALES
BAX (Qualicom, USA)
Salmonella
Listeria
E.Coli O157:H7
PROBELIA (Sanofi, France)
Salmonella
Listeria
TAQMAN (Perkin Elmer, USA)
Salmonella
Listeria
E.Coli O 157
VENTAJAS DE LA TÉCNICA DE PCR EN
LA DETECCIÓN DE PATÓGENOS
- Rapidez
- Simplicidad (disponibilidad de Kits
comerciales)
- Alta sensibilidad ( permite diferenciar
cepas)
- PCR cuantitativo permite la
cuantificación del nivel de patógenos
PCR
+
+
+
+
+
- -
Presencia de banda - Diagnóstico +
Ausencia de banda - Diagnóstico -
5.- Detección de transgénicos
ORGANISMO GENETICAMENTE
MODIFICADO
(Directiva 2001/18/CE)
Cualquier organismo, con excepción de los seres
humanos, cuyo material genético ha sido
modificado de una manera que no se produce de
forma natural en el apareamiento ni en la
recombinación natural
ETIQUETADO
-La UE “reconoce el derecho de los consumidores a la
información y el etiquetado como herramienta para una
elección responsable”
- La obligatoriedad del etiquetado se regula en los
reglamentos 1829 y 1830 / 2003 del Reglamento Europeo y
del Consejo de 22 de Septiembre de 2003
- El etiquetado indicando la presencia de un OMG es
obligatorio en todos los casos y sin depender de la cantidad
de OMG presente
Creación de plantas
transgénicas
Detección de transgénicos en una
mezcla con una sensibilidad 0,1%
Mediante técnica PCR
Aplicación a la verificación de etiquetas,
seguimiento y detección de fraudes
DETECCIÓN POR PCR DE MAÍZ TRANSGÉNICO