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Preparación y respuesta frente a las complicaciones de la epidemia de zika.
ZIKA:
DIAGNÓSTICO EN EL LABORATORIO
Bqca. Victoria Luppo
Instituto Nacional del Enfermedades Virales Humanas
“Dr. Julio I. Maiztegui”- ANLIS
Centro Nacional de Referencia para el diagnóstico de dengue y
otros Arbovirus, Centro Colaborador
Pergamino – Buenos Aires- Argentina
[email protected]
Familia:Flaviviridae
Genero:Flavivirus
Dengue
Fiebre Amarilla
Encefalitis de San Luis
Nilo Occidental
Ilheus
Bussuquara…y se suma Zika!!!
• Virus RNA, ss (+), 11 kb
• Proteína E: hemoglutinina
viral: induce inmunidad
protectora y anticuerpos no
neutralizantes de
reactividad cruzada entre
flavivirus, en el huésped
C

No hay serotipos, hay tres linajes genéticos:

2 linajes Africanos: Este (prototipo) y Oeste.

Asiático

En las Américas, circula el linaje asiático.

Ciclos selváticos en África (primates no humanos y
mosquitos del género aedes)

En 2007 se describe epidemia en la Micronesia: 75%
de la población afectada.
Infecciones asintomática:
Phylogeny of Zika Virus in Western Hemisphere, 2015 Robert S. Lanciotti, Amy J.
Lambert, Mark Holodniy, Sonia Saavedra, Leticia del Carmen Castillo Signor Author
affiliations: Centers for Disease Control and Prevention, Fort Collins, Colorado, USA
(R.S. Lanciotti, A.J. Lambert);
Change
Alfonso J. Rodriguez-Morales, Antonio Carlos Bandeira, and Carlos Franco-Paredes
DESCRIPCIÓN
EVENTO
VIGILANCIA
CLÍNICA
VIGILANCIA POR
LABORATORIO
Vigilancia de infección
por virus Zika como
SFAI/EFE(por
transmisión vectorial o
sexual)
ENFERMEDAD POR
VIRUS ZIKA
INDIVIDUAL
E
INMEDIATA
INDIVIDUAL E
INMEDIATA
Vigilancia de síndrome
de Guillain-Barré (SGB)
y otros síndromes
neurológicos asociado a
la infección por el virus
Zika
ZIKA: SGB U OTROS SME
NEUROLÓGICOS CON
SOSPECHA DE
ASOCIACIÓN CON ZIKV
INDIVIDUAL
E
INMEDIATA
INDIVIDUAL E
INMEDIATA
Vigilancia de la
transmisión vertical de la
infección por virus Zika
ZIKA: INFECCION POR
VIRUS ZIKA EN
EMBARAZADAS
ZIKA: SÍNDROME
CONGÉNITO CON
SOSPECHA DE
ASOCIACIÓN CON ZIKV
ZIKA: ABORTO O
MUERTE FETAL CON
SOSPECHA DE
ASOCIACIÓN CON ZIKV
INDIVIDUAL
E
INMEDIATA
INDIVIDUAL E
INMEDIATA
RED NACIONAL DE DIAGNOSTICO DE VIRUS
DENGUE Y OTROS ARBOVIRUS DE ARGENTINA,
2016: CAPACIDADES PARA DENV
3
4 3
4
5
2
3 2
3
5
2
2 18
CABA:
2
6
3
• Centro colaborador de
OPS-OMS en Fiebre
Hemorrágicas Virales,
Dengue y otros
Arbovirus
Microorganismos bajo estudio -Lab. Arbovirus
Virus Dengue serotipo 1 (DENV-1)
Virus Dengue serotipo 2 (DENV-2)
Virus Dengue serotipo 3 (DENV-3)
Virus Dengue serotipo 4 (DENV-4)
Virus de la Fiebre Amarilla (YFV)
Virus de la Encefalitis de San Luis (SLEV)
Virus del Nilo Occidental (WNV)
Virus Ilheus (ILHV)
Virus Bussuquara (BSQV)
Virus Rocio (ROCV)
Virus de la Encefalitis Equina del Este (EEEV)
Virus de la Encefalitis Equina del Oeste (WEEV)
Virus de la Encefalitis Equina Venezolana (VEEV)
Virus Oropouche (OROV)
Virus Mayaro (MAYV)
Virus Chickungunya (CHIKV)
Virus Kairi, Una y Aura
Virus Zika (ZIKV): desde 2015.
Avances en la disponibilidad de
diagnóstico de ZIKV en la Red Nacional
de Laboratorios de Salud Pública
Integración de Zika en el sistema de
vigilancia del Síndrome Febril
Inespecífico
Transferencia
qRT-PCR ZIKV
a los
laboratorios
con capacidad
de diagnóstico
molecular
Aislamiento del
ZIKV en
Argentina
Puesta a punto
de la
detección
serológica de
ZIKV en el
INEVH
Producción de
reactivos de
referencia
Gestión de
insumos
comerciales y
para provisión a
los laboratorios
de la red
Ufp/ml
IgG suero (2º)
Anticuerpos
IgG suero (1ª)
IgM suero
Viremia
Eliminación de virus en Orina
-5
-4 -3
-2 -1
0
Inicio síntomas
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10
15
días
Objetivo primario del laboratorio:
Muestras con 0- 15 dpi: detección
del genoma viral combinando la
muestra de suero y orina
qRT- PCR :
-suero (hasta 5 dpi)
- orina ( 5-15 dpi)
15dpi : Detección de IgM y confirmación
por Neutralización en par serológicoPANEL DE FLAVIVIRUS
-SE REQUIERE MAYOR CONOCIMIENTO
SOBRE LA RESPUESTA INMUNE
TOMA DE MUESTRA Y
Envío de la muestra
-Siempre con la ficha clínico-epidemiológica
completa (fecha de inicio de los síntomas, Fecha
toma de muestra, Historia de viajes, antecedentes
de vacunación, etc)
-Triple envase
-DERIVACIÓN A LABORATORIOS PROVINCIALES RED NACIONAL
-Referencia y serologia en el INEVH, Pergamino
-Carga de los casos en SIVILA:
Grupo de eventos: Infecciones por virus del Zika
(con todos sus variantes de eventos: aborto o muerte fetal por ZIKV,
enfermedad por ZIKV, SGB u otro SME neurológico, síndrome congénito
asociado a ZIKV)
•
Cepas de ZIKV aisladas en el INEVH: n=6
•
Origen: Viajeros argentinos procedentes de
Venezuela, Brasil y Colombia. Cepa autóctona
aislada en paciente de la provincia de Tucumán
•
Aislados en cultivos de células VERO C76,
VERO E6. Efecto citopático al 5º día.
•
Títulos de las cepas ≈106 ufp/ml
•
Caracterización: qRT-PCR ZIKV en el
sobrenadante celular.
ENERO 2016: INICIO DE LA TRANSFERENCIA DE
REAL TIME RT-PCR PARA ZIKV
•Adaptado a plataforma de DENV RT-PCR (CDC/DB- Puerto Rico)
 Utiliza el mismo ARN para ambas pruebas
 Utiliza los mismos reactivos de CDC DENV RT-PCR
 Utiliza los mismos parámetros de ciclado en ABI 7500
 Simultáneamente se pueden procesar las muestras para

ZIKV/DENV
Abarata costos de laboratorio y vigilancia para ambos virus
2
CABA
Los limitantes para el 100% de
transferencia fueron:
-Inicialmente la no disponibilidad de
controles positivos
-La falta de sondas, primers
específicos y enzimas
-La transferencia de qRT- PCR ZIKV se inició
mediante RNA ZIKV cedido por CDC Fort Collins y
envío del POE.
-Actualmente se emplea RNA cepa asiática
aislada en el INEVH a partir de un viajero ( Título
de Semilla viral :106 ufp/ml)
-Se envía el CT de referencia y se solicita la
realización de la curva dinámica para
evaluación de sensibilidad analítica (Diluciones
de 10-1 a 10-7)
2016: Puesta a punto de MAC- ELISA ZIKV
•Inicialmente puesto en marcha con
cantidades limitadas de antígeno y
Control positivo cedido por CDC y UTMB
•Implementado con el mismo formato de
IgM CHIKV “ in house”
•Se utiliza antígeno negativo para
descartar reacciones inespecíficas del
suero
•Hasta el momento no hay estudios
específicos que aporten información de
la cinética de la IgM en infecciones por
ZIKV
•Un resultado IgM requiere
confirmación por PRNT sobre todo en
este momento de epidemia de dengue
donde predomina la circulación de
este virus
4. Anticuerpo monoclonal
anti-flavivirus marcado (6B 6C-1)
3. antígeno
flavivirus
2. muestra de suero
1. anti-IgM
Fase sólida (placa de ELISA)
Estamos en condiciones de
iniciar la transferencia a las
provincias de la detección de
MAC ELISA Zika en el corto
PROVISIÓN DE REACTIVOS A LA RED:
PRODUCCIÓN DE ANTÍGENO DE ZIKV PARA USO
EN MAC-ELISA (INEVH, 2016)
PROCEDIMIENTO
• AMPLIFICACIÓN DE LA LÍNEA CELULAR VERO E6
• INOCULACIÓN CON LA CEPA VIRAL AISLADA EN CASOS
IMPORTADOS DETECTADOS EN ARGENTINA EN UNIDAD
BSL3.
• OBSERVACIÓN DE ECP Y CONGELAMIENTO A -70ºC
• DESCONGELADO, SONICADO Y CENTRIFUGACIÓN A
10.000 RPM
• LIOFILIZACIÓN
• RADIACIÓN GAMMA PARA INACTIVACIÓN (CONEA)
• TEST DE SEGURIDAD EN CULTIVOS CELULARES
• LOTE 1: ABRIL DE 2016
PROVISIÓN DE REACTIVOS A LA RED: CONJUGADO 6B6CPEROXIDASA USADO EN MAC-ELISA ZIKV Y OTROS FLAVIVIRUS:
El conjugado usado
actualmente es provisto por
CDC y la OPS.
En 2015 el INEVH inició la
producción local
- CDC Fort Collins cedió al INEVH
un vial de semilla del hibridoma
- Se logró la amplificación celular en el
INEVH
- Se obtuvieron los primeros lotes de
anticuerpos monoclonales
- Próximos pasos: evaluación de título
de anticuerpos, purificación y marcado
con la enzima peroxidasa para usar en
MAC-ELISA FLAVIVIRUS y pasar a tener
provision nacional del conjugado
MARZO DE 2016: INCORPORACIÓN DE ZIKV EN EL PANEL DE FLAVIVIRUS
UTILIZADO EN LA PRNT 90 PARA CONFIRMACIÓN SEROLÓGICA
• Actualmente cada par serológico que
se procesa por PRNT en el INEVH se
enfrenta a stocks virales de DEN-1, DEN2, DEN-3, DEN-4, SLE, WN, YF y ZIK (en
ocasiones se amplia incluyendo Ilheus y
Bussuquara)
• El procesamiento requiere cultivos de
48 hs e incubación durante 6 dias hasta
la coloración con Rojo Neutro y lectura
de las UFP virales
Por PRNT hemos identificado diferentes brotes por Flavivirus en
Argentina porque ha predominado un patron de respuesta
inmune primaria
Infección primaria
•Muestra aguda con título IgG  160
La gran limitación de la
•Muestra convaleciente con título IgG < 1280
serología : en Infecciones
•Bajo cruce serológico
MUESTRAS
DEN-1
DEN-2
S1
<20
20
<20
S2
<20
40
<20
DEN-3
secundarias
o secuenciales la
FA
ZIK WN SLE
CONFIRMADO
serología
no <20
permite
identificar
<20
<20
80
<20
ZIKV
el Flavivirus
20
<20
320
<20 <20
infectante….recordar la teoría
del Pecado original!!!
DEN-4
Infeccion secundaria
•Muestra aguda con título IgG > 160
•Muestra convaleciente con título IgG  1280
•Alto cruce serológico
MUESTRAS
DEN-1
DEN-2
DEN-3
DEN-4
FA
ZIKV
WN
SLE
S1
320
160
1280
320
40
1280
320
640
S2
640
2560
10240
640
l60
2560
1280
320
CONFIRMADO
FLAVIVIRUS
1º BROTE EPIDEMICO DE SLEV
EN LA PROVINCIA DE SAN JUAN :
Marzo- Junio, 2011:
56 casos sospechosos, 4 fatales, 30
convivientes estudiados = 30 casos
( 16 Sint, 11 Asint)
Marzo de 2011: caso sospechoso
de DENV, SAN JUAN: IgM (+)
DEN (UMELISA), viaje reciente al
Tigre (Bs. As)
PRNT (90)
DEN1 DEN2 DEN3 DEN4 WN SLE YF
S1 <20 <20 <20 <20
S2 <40 <40 <40 <40
<20 20 <20
<40 160 <40
Astenia
Taquipnea
> 76
7%
Disnea
0 - 15
15%
61- 75
22%
Tos
0 - 15
16- 30
19%
Taquisfignia
Taquicardia
16- 30
31- 45
46- 60
Irritabilidad
61- 75
> 76
Síndrome meningeo
46- 60
26%
Síndrome confusional
31- 45
11%
Inyección conjuntival
Vómitos
Náuseas
Distribución por
grupos etarios
Dolor retroocular
Artralgias
Mialgias
Cefalea
Fiebre
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
9/16 (57%) encefalitis
CM Fabbri, MA Morales, VC Luppo, F Cappato Berger, B Salanitro, M Manrique, L
Fierro, S Goenaga, DA Enria, S Levis. Rev. Arg. de Microbiol, supl. 1 (43) : 89.
15
¿Qué ajustes estamos en condiciones de realizar
actualmente para fortalecer la vigilancia laboratorial de
ZIKV en el país?

Priorizar el estudio de casos clínicos compatibles con exantema
en una región hasta confirmación de circulación autóctona

En la detección genómica dejar al mismo nivel ZIK-DEN-CHIK y
aplicar criterios clínico-epidemiológicos para priorizar o iniciar
el laboratorio
PRIORIZAR EL ESTUDIO DE ZIKV EN:

Embarazadas con antecedente epidemiológico ( viajado o residan
en área de circulación viral) y que tengan clínica compatible o
malformación fetal.

Mortinatos o abortos con antecedente epidemiológico

Niños con microcefalia u otras malformaciones, hijos de madres
con antecedente de exposición a virus Zika o aquellas que hayan
cursado el mismo en zonas con brote de dengue en curso

Casos Guillain- Barré y antecedente epidemiológico de viaje a zona
con circulación viral confirmada de Zika o zonas con brotes por
arbovirus en Argentina
Vigilancia de Microcefalia en Maternidades de la RENAC
- Se está coordinando el estudio retrospectivo para
ZIKV de los casos notificados como rubeolasarampion con resultado negativo durante 2016

Resta trabajar para continuar con la descentralización de metodologías para
ZIKV, fundamentalmente técnicas serológicas

Vamos a evaluar la utilidad de la serología para el diagnóstico de ZIKV en
Argentina
Aprovechar la ventana de diagnóstico molecular hasta el día 15, a través de
las muestras de orina


Al confirmarse circulación autóctona de ZIKV, deberemos sumar el estudio de
este flavivirus como diagnóstico diferencial, evaluando los antecedentes
epidemiológicos.

Si bien nos encontramos en un momento crítico por la no disponibilidad de kits
comerciales y por el agotamiento de los insumos disponibles, la red de
laboratorios y el INEVH poseen las herramientas técnicas empleadas nivel
internacional para realizar una vigilancia laboratorial de calidad de los
arbovirus con circulación autóctona en el país y otros potencialmente
emergentes o re-emergentes.

Resultará clave la integración interdisciplinaria que potencie las fortalezas
individuales para dar una mejor respuesta a la población que resulte afectada
por ZIKV en Argentina
Muchas gracias por su atención!!!!