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1944 Universidad estatal de Kazan, Rusia
Evgeniy Zavoisky
Resonancia Paramagnética Electrónica (EPR)
CuCl2·2H2O
Premios Nobel y resonancia
• Física 1952 - for their development of new methods for
nuclear magnetic precision measurements and
discoveries in connection therewith - Felix Bloch y
Edward Mills Purcell
• Química 1991 - for his contributions to the development
of the methodology of high resolution nuclear magnetic
resonance (NMR) spectroscopy - Richard R. Ernst.
• Química 2002 - for his development of nuclear magnetic
resonance spectroscopy for determining the threedimensional structure of biological macromolecules in
solution - Kurt Wüthrich
• Fisiología o Medicina 2003 - for their discoveries
concerning magnetic resonance imaging - Paul C.
Lauterbur y Sir Peter Mansfield
Resonancia paramagnética
electrónica (EPR)
• ¿Qué se detecta?
Moléculas con uno o más electrones desapareados
• ¿En qué se basa?
- Los electrones desapareados tienen momento
magnético de spin
- El spin electrónico tiene dos números cuánticos
que tienen la misma energía en ausencia de
campo magnético
- Cuando se exponen a un campo magnético se
generan dos estados energéticos y por lo tanto
una transición
Meth. Enz. 246: 536
Absorción
El experimento
m s= - ½
h
Bo
Campo magnético (B)
Señal de EPR
m s= ½
Campo magnético (B)
Primera derivada
Bo
Campo magnético (B)
El espectro de EPR
E = h = g Bo β
g = cociente giromagnético (2.0023 para un electrón libre)
β = Magnetón de Bohr (momento angular del electrón;
9.2741 x 10-24 JT-1)
Bo = Campo magnético aplicado
 ~ 9.75 GHz para la banda X
Desdoblamiento hiperfino
• El campo magnético experimentado por el electrón
desapareado se ve afectado por los núcleos cercanos que
tengan spin nuclear
Spin nuclear:
Estados energéticos:
1H
I=½
2H
I=1
12C
I=0
13C
I=½
14N
I=1
15N
I=½
I = ½: + ½, -½
I = 1: -1, 0, 1
Núm. de líneas = 2n (I + ½)
n = núcleos equivalentes
Desdoblamiento hiperfino
I = 1 : 14N
E
ms
mI
½
1
0
-1
1
0
-1
h
aN
-½
aN
-1
0
1
Desdoblamiento
hiperfino
-1
0
1
Campo magnético
Desdoblamiento
hiperfino
Sin desdoblamiento
1 núcleo I=1/2 (1H)
1 núcleo I=1 (14N)
2 núcleos idénticos I=1/2
1 núcleo I=5/2 (17O)
10 Gauss
El desdoblamiento hiperfino es aditivo
H3C
O
+
N
OH
N
H O
aN
4-POBN-CH(CH3)OH
aH
aN
aH
Campo magnético
aH
Consideraciones acerca de
líneas e intensidades
• (2 I + 1) líneas por cada núcleo
• (2 I1 + 1) (2 I2 + 1) …. para más de un núcleo
• (2 nI + 1) en el caso de n núcleos equivalentes
• El espectro debe ser simétrico con respecto al centro. Si no…
- Más de un radical con valores diferentes de g
- Tiempo de correlación lento
• No hay una línea central intensa: número impar de núcleos
equivalentes con I = ½
Señales de EPR de iones metálicos de transición
• Varían mucho según:
i) el ion metálico
ii) el estado de oxidación
iii) el estado de spin
iv) los ligandos
v) el número de iones metálicos asociados
• Depende mucho de interacciones spin-orbital e interacciones
spin-spin cuando hay más de un electrón desapareado
• A veces necesitan temperaturas bajas para ser detectables (N2
o He líquidos)
• Dependen mucho de la simetría alrededor del ion metálico
• Observables en iones metálicos con spines semienteros (S
= ½, 3⁄2, 5⁄2) pero no en iones con spines enteros (S =1, 2)
Configuración electrónica de algunos
iones metálicos de transición
3d5
Fe3+, Mn2+
S = 5/2, (alto spin)
S = 1/2, (bajo spin)
3d6
Fe2+
S = 2, (alto spin)
S = 0, (bajo spin)
3d9
Cu2+
S = 1/2
3d10
Cu+
S=0
Galactosa
oxidasa
JBC (1988) 263: 6074
Biochemistry (2009) 47:6637
¿Quién está interesado en EPR
para bioquímica?
1. Áreas relacionadas con estrés
oxidativo y antioxidantes
2. Áreas relacionadas con catálisis
enzimática que involucra radicales
3. Áreas relacionadas con
metaloproteínas no enzimáticas
Estrés oxidativo y antioxidantes
1969
Coenzima o cofactor Enzima
Enzima
Coenzima o cofactor
Flavoproteínas
Flavoproteína oxidasas
Óxido nítrico sintasa
Tetrahidropterinas
Hidroxilasas de aminoácidos aromáticos
Óxido nítrico sintasa
Cu, Zn, Mn, Ni, Fe
Superóxido dimutasas
Quinoproteínas
Metanol deshidrogenasa
Metanol deshidrogenasa
Amino oxidasas de cobre
Hemo proteínas
Citocromos P450
Peroxidases
Catalasa
Prostaglandina sintasa
Complejos di-hierro
Metano monooxigenasa
Ribonucleótido reductasa (clase I)
Hierro mononuclear
Lipooxigenasa
Catecol dioxigenasas
Prolil-4-hidroxilasa
Chem. Rev. (2006)
106: 3302
Radicales de aminoácidos en catálisis
enzimática
Ribonucleótido reductasa
(RNR) clase I
Fotosistema II
YD·
YZ·
Prostaglandina H sintasa
Radicales de aminoácidos en catálisis
enzimática
RNR clase II
RNR clase III
piruvato formiato
liasa
citocromo peroxidasa
Radicales de aminoácidos en catálisis
enzimática
Galactosa oxidasa
Amina oxidasas de Metilamina
plasma
deshidrogenasa
Metaloproteínas no enzimáticas
Detección de nitrosil Hb en sangre de ratas tratadas con LPS
g ~ 2.07
Sangre
venosa
g ~ 2.08
Ax = 17 G
Sangre
arterial
g ~ 2.02
80 G
Az = 17 G
g ~ 1.98
g ~ 2.00
80 G
g ~ 1.98
Kosaka et al., AJP 1994
Detección de radicales en biología por EPR
Método
1. EPR directo (en
solución)
Ventajas
Desventajas
Proporciona la estructura del
radical
a. Estático
Necesita muestras
pequeñas
Aplicable a radicales de
vida larga (t½ > min)
b. Flujo rápido
Aplicable a radicales de vida
corta
Necesita muestras
grades, algunos radicales
son indetectables
2. EPR directo
(muestras
congeladas)
Aplicable a radicales de vida
corta ((t½ < 10-6 s)
Necesita muestras
pequeñas
Proporciona información
estructural en caso de
complejos metálicos
Uso limitado en radicales
orgánicos debido a la
anisotropía
3. Spin-trapping
Amplias aplicaciones
Información estructural
limitada
Espectros de EPR de plasma
Plasma
Plasma
+ 0.5 mM ONOO-
Vasquez-Vivar et al, Biochem. J, 1996
EPR con flujo continuo
Detección de radical carbonato
ONOO- + CO2
35%
CO3.- + .NO2
65%
CO2 + NO3-
HCO3/CO2
Celda
de
mezcla
Campo
magnético
ONOO-
9 mm/
5 ms
Detección de radical carbonato
ONOO- + CO2
CO3.- + .NO2
65%
CO2 + NO3ONOOHCO3-/CO2
ONOOH13CO3-/13CO2
Bonini et al. , JBC 1999
Detección de radical cromanilo
Botti et al. , Chem. Res.
Toxicol. 2004
Detección de radical cromanilo
Botti et al. , Chem. Res.
Toxicol. 2004
EPR directo con muestras congeladas
• Aplicable a
radicales de vida
corta y metales de
transición
• 77 K (nitrógeno
líquido) o 4 K (helio
líquido)
• Uso limitado debido
a la anisotropía
SPIN TRAPPING
ST
+
spin trap
(diamagnético)
R.
SA.
radical
transitorio
aducto de spin
(paramagnético)
• Gran aplicación pero brinda información estructural muy
limitada
• Hay dos clases principales de ST: nitronas y nitrosos
Spin traps de nitrona
• DMPO (5,5-dimetilpirrolina N-óxido)
Me
+
Me
N
H
R.
Me
Me
O-
R
N
O
.
H
• PBN (fenil-N-t-butilnitrona)
R
C
+
N
H
O-
C (C H )
33
R
.
C
H
N
O
.
C(C H )
33
+ Reaccionan con gran variedad de radicales (-RC., RO., RS.)
+ Los aductos son a menudo muy estables
+ No son demasiado tóxicos
- La asignación estructural es difícil porque los espectros son similares
Spin traps de compuestos nitroso
• MNP (2-metil-2-nitrosopropano)
O
N
C (CH3 )3
.R
.O
N
C(CH3 )3
R
• DBNBS (3,5-dibromo-4-nitrosobencensulfonato)
Br
Br
O
SO3-
N
.R
.O
SO3-
N
R
Br
Br
+ Brindan una identificaciónmás fácil del radical
- Aductos térmicamente inestables y sensibles a la luz
- Forman dímeros inertes
- Poco confiables para radicales centrados en oxígeno
Spin trapping con proteínas
Espectros de la reacción de HbO2 con peroxinitrito en
presencia de MNP: Formación de radicales en la proteína
.O
N
C(CH3 )
3
1 mM HbO2
1 mM ONOO20 mM MNP
R
MNP
20 G
+ Pronasa
20 G
2G
acoplamiento superhiperfino
Romero et al., JBC 2003