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Tema 5. Mutagénesis clásica
Genética clásica vs. genética reversa. Generación de individuos
mutantes, análisis fenotípico. Identificación del gen mutagenizado,
clonaje posicional: cartografía molecular, paseo cromosómico.
Confirmación de la identidad del mutante: Análisis de la actividad
génica en el mutante, complementación.
Genética clásica vs. Genética reversa
Del fenotipo al gen vs. Del gen al fenotipo
Tema 5. Mutagénesis clásica
Generación de individuos mutantes:
•Mutágenos Físicos: X-rays, g-rays, b-rays or UV
•Mutágenos Químicos: ethylmethane sulfonate (EMS), 1methyl-3-nitro-1-nitrosoguanidine (MNG), 1-ethyl-1-nitrosourea
(ENU), and the 1-methyl-1-nitrosourea (MNU).
•Inserción: T-DNA, Transposones
Tema 5. Mutagénesis clásica
La cuestión del tamaño de la población mutagenizada
If the GECN (genetically effective cell number) is one per
seed, we should treat at least 46049 seeds to recover at least
one mutation of the desired type with a probability of 99%
assuming that the mutation rate is 10-4.
In Arabidopsis the GECN = 2 so the required seed number is
23025.
El screening
Tema 5. Mutagénesis clásica
Análisis genético, con los mutantes identificados
debemos responder a las siguientes preguntas:
•¿Dominante o recesivo?
•¿Gen único?
•¿Alelos o genes?
Tema 5. Mutagénesis clásica
Análisis fenotípico
• Permite determinar la influencia de un gen en
un carácter
• En muchos casos es posible diseccionar
complejos procesos biológicos mediante el
análisis de fenotipos mutantes y dobles
mutantes
Tema 5. Mutagénesis clásica
Análisis fenotípico, un ejemplo
An outer envelope membrane component of the plastid protein import apparatus plays
an essential role in Arabidopsis. Diane Constan, Ramesh Patel, Kenneth Keegstra and Paul
Jarvis. Plant Journal Volume 38 Issue 1 Page 93 - April 2004
La pérdida de
función de PPi3 no
parece tener un
efecto fenotípico
claro
En este caso se conocía la naturaleza del
gen afectado, una proteína de la envuelta
de cloroplastos, éstos son sin embargo
normales en el KO
Tema 5. Mutagénesis clásica
Análisis fenotípico, un ejemplo
En raíces si se observa un ligero
fenotipo, precisamente donde
apenas se expresa un gen
relacionado PPi1
El doble mutante ppi1-ppi3 es
letal, de hecho ppi3 es dominante
en un fondo ppi1/ppi1
Tema 5. Mutagénesis clásica
Identificación del gen mutagenizado.
+/+ +/m +/+ +/+ +/+ +/m +/m +/m
• En los casos en los que la mutación se ha
producido por gene tagging es posible el
análisis de ligamiento
Alternativamente, diversas técnicas (transposon display) permiten tener acceso a la
identidad de los genes que contienen inserciones de transposones (ver tema 7)
Tema 5. Mutagénesis clásica
Clonaje posicional:
Cartografía molecular, paseo cromosómico
Mapas Genéticos????:
Problemas de 2 y 3 puntos
Construcción del mapa, Mapas “saturados”
Introducción del carácter en el mapa
Tema 5. Mutagénesis clásica
Clonaje posicional:
Positional Cloning in Arabidopsis. Why It Feels
Good to Have a Genome Initiative Working for
You.
Wolfgang Lukowitz*, C. Stewart Gillmor, and Wolf-Rudiger Scheible.
Plant Physiology, July 2000, Vol. 123, pp. 795–805,
Tema 5. Mutagénesis
clásica.
Clonaje posicional:
Marcadores moleculares
Tema 5. Mutagénesis
clásica.
Clonaje posicional:
Tema 5.
Mutagénesis
clásica.
Clonaje posicional:
F1
Pool
Tema 5. Mutagénesis
clásica.
Clonaje posicional:
Análisis de tres puntos
Permite concentrarse en los
individuos que presentan
recombinación en la zona
de interés
Desarrollo de nuevos
marcadores
Tema 5. Mutagénesis clásica
Objetivo
Se actúa sobre
1
Crear un mutante para el carácter en
estudio
Una población silvestre
2
Introducir la mutación en una
población de mapa
Creación de una F2 entre líneas
P polimórficas
3 Situación en una región cromosómica
4
Identificación de marcadores
flanqueantes
Con marcadores
Resultado
Un fenotipo mutante
Localización del gen
mutado en una región
cromosómica
Segregantes agrupados en
familias con y sin el carácter
Un número pequeño,
dispersos por el genoma
Una sub-población de unos 100
individuos
Marcadores situados a
De la región en la que se
ambos lados del gen de
localiza el gen
interés y a 5-10CM
Sub-población F2 en la
que se ha producido
recombinación en las
proximidades del gen
Disminuir el tamaño de la población
5
segregante
El total de la población
Flanqueantes (paso 4)
6 Mapa fino
Sub-población F2 seleccionada
en 5.
Todos los posibles,
situación del gen en
nuevos y diseñados para una región de no mas
el experimento
de 50Kbp
7 Identificación del gen
El genoma
???????????????
El gen
Tema 5. Mutagénesis clásica.
Clonaje posicional:
El clonaje posicional puede ser complicado por varios factores
dependientes del sistema particular que esta siendo estudiado:
Carácter controlado por varios genes
Regiones genómicas con bajo nivel de recombinación y
abundancia de secuencias repetidas
Y después?:
El análisis posterior depende del tipo de gen, algunas alternativas
obvias son la complementación y el análisis molecular de genes
candidatos
Tema 5. Mutagénesis clásica.
Clonaje posicional, un ejemplo
MOS2, a Protein Containing G-Patch and KOW Motifs, Is Essential for
Innate Immunity in Arabidopsis thaliana. Zhang Y, Cheng YT, Bi D, Palma
K, Li X. Curr Biol. 2005. 15:1936-1942
La mutación npr1 bloquea la respuesta de defensa inducida por SA
en Arabidopsis
snc-1 fue identificado como un supresor de npr-1. Las plantas snc1
npr1-1 muestran expresión constitutiva de genes de resistencia y son
resistentes a varios patógenos. Tienen además un tamaño pequeño y
expresan constitutivamente una construcción pBGL2-GUS
Tema 5. Mutagénesis clásica.
Clonaje posicional, un ejemplo
En un nuevo experimento de mutagénesis, esta vez sobre plantas
snc1 npr1-1, se identificó un nuevo supresor, mos-2
Las plantas mos2-1 snc1 npr1-1 tienen un
tamaño intermedio y el marcador pBGL2GUS no se expresa en ellas
El cruzamiento mos2-1 snc1 npr1-1 x
snc1 npr1-1 produjo plantas F1 de
fenotipo idéntico a snc1 npr1-1
La mutación mos-2 es recesiva
Tema 5. Mutagénesis clásica.
Clonaje posicional, un ejemplo
En el triple mutante, la expresión constitutiva de genes de resistencia
está abolida, y las plantas son tan sensibles a patogenos (ejem
Peronospora parasitica) como el mutante npr-1
Tema 5. Mutagénesis clásica.
Clonaje posicional, un ejemplo
En el triple mutante, los niveles de
SA son menores que en las plantas
snc1 npr1-1, pero superiores a los
encontrados en npr1-1, la
mutación mos-2 no afecta a la
síntesis de SA
Tema 5. Mutagénesis clásica.
Clonaje posicional, un ejemplo
A partir de plantas mos2-1 snc1 npr1-1 se han derivado plantas
mutantes mos2 pero silvestres para los otros dos genes.
Mediante cruzamiento mos2-1 snc1 npr1-1 x wt y selección
contra las mutaciones snc1 y npr1-1 en los segregantes
(utilizando primers específicos de alelos).
Las plantas mos2-1 muestran mayor susceptibilidad que el
silvestre al ataque de patógenos, Mos2 es necesario para la
respuesta basal de resistencia.
ETC, ETC, ETC SOBRE CARACTERIZACIÓN GENÉTICA Y
FENOTÍPICA
Tema 5. Mutagénesis clásica.
Clonaje posicional, un ejemplo
Para el clonaje posicional, las plantas mos2-1 snc1 npr1-1 fueron
cruzadas por Ler-snc1 dando lugar a una población de mapa.
Las semillas F3 de 183 plantas F2 se sembraron en placas con Kn
para seleccionar portadores del reporter pBGL2-GUS
De 147 líneas seleccionadas, 34 mostraron ausencia de señal
GUS (=homocigosis para mos2)
Estas 34 plantas fueron utilizadas para el análisis de ligamiento
con marcadores distribuidos por el genoma de arabidopsis
Tema 5. Mutagénesis clásica.
Clonaje posicional, un ejemplo
Tabla de los marcadores utilizados en el posicionamiento final del
gen.
Tema 5. Mutagénesis clásica.
Clonaje posicional, un ejemplo
En una primera aproximación se localizó la mutación entre los BAC
F17F8 and F28J9 en el cromosoma 1.
Para el mapa fino, se seleccionaron
288 plantas F3, descendientes de una
planta F2 heterocigota para mos2-1 y
homocigota para pBGL2-GUS.
Estas plantas se genotiparon con
F17F8 y F28J9. Se encontraron 70
plantas recombinantes, que fueron
fenotipadas mediante tinción GUS.
Con estos recombinantes, y nuevos marcadores, el intervalo en que se
encuentra la mutación se redujo al comprendido entre F6N18 y
F14M2.
Tema 5. Mutagénesis clásica.
Clonaje posicional, un ejemplo
Para continuar con el “mapeo”, otras
539 plantas de la misma línea fueron
genotipadas para F6N18 y F14M2.
Se encontraron 18 recombinantes.
El análisis de estos recombinantes con
nuevos marcadores situó mos2-1 entre
los marcadores T16O9 y T1E4, con 2
recombinantes a cada lado.
La región entre T16O9 y T1E4 tiene
unas 120 kb.
Los autores secuenciaron las 120 kbp en la línea mos2-1, mediante
fragmentos solapantes de PCR
Tema 5. Mutagénesis clásica.
Clonaje posicional, un ejemplo
La secuenciación permitió encontrar
una inserción de dos T que causa un
salto en el marco de lectura de Mos2.
Aunque la transcripción no se ve
afectada, la proteína resultante es
muy probablemente no funcional.
El análisis genético muestra que un alelo de inserción mos2-2 muestra
el mismo fenotipo que mos2-1, tiene la mismas propiedades en cuanto
a la supresión de snc1 y no complementa la mutación mos2-1.
Tema 5. Mutagénesis clásica.
Clonaje posicional, un ejemplo
La transformación de plantas mos21 snc1 npr1-1 con una construcción
35S-Mos2 restaura el fenotipo snc1
npr1-1
Mapas genéticos:
Una de las aplicaciones más importantes del análisis
genético es la construcción de mapas en los que los genes (y
en general cualquier tipo de marcador) aparecen ordenados y
separados por distancias genéticas. El proceso de
construcción de un mapa implica:
1. Establecimiento de líneas puras y producción de una
población de mapa (F2)
2. Anotación del genotipo de cada individuo para cada
uno de los marcadores que se van a emplear en el
mapa
Individuo
F21
F22
F23
F24
F25
A
A
A
a
BB
Bb
Bb
Enfermedad/
no En.
No E
E
D,d
Dd
Dd
carácter
A,a
B,b
....
......
......
F299
F21000
A
a
A
Bb
bb
BB
bb
No E
No E
E
No E
No E
DD
Dd
dd
Dd
Dd
3. Análisis del ligamiento de dos en dos y luego de tres en
tres (vía ordenador)
4. Integración en un mapa
5. La
unión
secuencial
de
marcadores
al
mapa
va
produciendo
grupos
de
ligamiento
6. En un mapa saturado (un gran
número
de
marcadores
separados entre si por pocos
cM, cubriendo todo el genoma)
el número de grupos de
ligamiento es igual al número de
cromosomas de la especie.
Algodón