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ELECTROFORESIS
La electroforesis esta basada en la movilidad de las moléculas cuando se
encuentran bajo el efecto de un campo eléctrico
Puede llevarse a cabo en:
Solución
Superficie hidratada de un soporte sólido (papel o acetato de celulosa)
Matriz porosa (en gel de poliacrilamida o agarosa)
Se puede controlar el tamaño del poro
efecto de tamiz molecular
Felectrica  Frozamiento
A su vez,
Fr  qE
q = carga
E = intensidad del campo
Si se asume que la partícula es esférica, a partir de la Ley de Stokes
se obtiene que,
Fr  6 R
Reordenando
qE

6 r
R = radio de la esfera
v = velocidad
η = viscosidad del fluido
La movilidad electroforética (μ) es una magnitud característica de la
partícula o molécula que refleja la velocidad relativa a la fuerza del
campo


E
A partir de la ecuación de velocidad se obtiene que:
q

6 r
La movilidad
electroforética depende
de la carga y del
tamaño de la partícula
Factores que afectan la electroforesis
La electroforesis depende del campo eléctrico y este depende de
distintos parámetros:
V  RI
Ley de Ohm
V = diferencia de
potencial
define el campo eléctrico, la velocidad de avance es
directamente proporcional a ella
R = resistencia
la movilidad de las moléculas es inversamente
proporcional a ella
I = intensidad
cuantifica el flujo de carga eléctrica, se relaciona
directamente con la distancia recorrida por las
moléculas
Temperatura
es necesario controlar el aumento de
temperatura debido al Efecto Joule
ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS
Electroforesis nativa
¿Las proteínas tienen carga?
Excepto en el pI, a cualquier pH las
proteínas tienen carga neta
¿Cuál es la concentración de acrilamida óptima para separar una
mezcla de proteínas?
Depende de la carga y tamaño de la proteína
Gráfico de Ferguson
logRf
log Rf  log Rf 0  Kr %T
Kr = coeficiente de retardo
se relaciona con el tamaño molecular
Rf = distancia que migró la proteína
distancia que migró la referencia
%T
Determinación del peso molecular mediante gráficos de Ferguson
Se determina el Kr de proteínas estándar de peso molecular conocido y
se realiza una curva de calibración
Se determina el Kr de la proteína problema y se interpola en la
curva obteniéndose el peso molecular
Inconveniente:
Las proteínas usadas para la curva de calibración deben tener la misma
forma, grado de hidratación y volumen específico que la proteína
nativa
Electroforesis desnaturalizante (SDS-PAGE)
Dodecil sulfato de sodio (SDS)
Desnaturaliza las proteínas
Confiere cargas negativas uniéndose en proporción al tamaño de la
proteína (una molécula de SDS por cada dos aminoácidos, ~1.4 g
SDS/g proteína)
Polipéptidos distintos tienen
la misma densidad de carga
migran solo según su peso molecular
logPM
distancia
que migró
la
proteína
X
X
X
X
distancia
que migró
el
colorante
X
Rf
Rf =
distancia que migró la proteína
distancia que migró el colorante de referencia
Dos consideraciones importantes
1. Para una concentración de gel dada, la relación lineal entre el logPM
y el Rf es lineal solo en un rango limitado de pesos moleculares
15 % acrilamida: 12000 – 45000 Da
10 % acrilamida: 15000 – 70000 Da
5 % acrilamida: 50000 – 200000 Da
2. En esta electroforesis la proteína está desnaturalizada, por lo tanto,
el peso molecular que se obtiene puede no ser el de la proteína nativa
Proteínas con estructura cuaternaria
(formadas por más de una subunidad)
¿ y si las subunidades están unidas por puentes disulfuro?
Agregamos un reductor como el 2-mercaptoetanol o ditiotreitol (DTT)
- 2-mercaptoetanol
PM (proteína nativa)
Proteína a: 34 KDa
b
c
a
d
Proteína b: 140 KDa
Proteína c: 64 KDa
+ 2-mercaptoetanol
b
a
c
d
Proteína d: 32 KDa
Isoelectroenfoque
Se lleva a cabo en un gradiente de pH que se establece entre dos
electrodos
El gradiente de estabiliza utilizando anfolitos
ánodo
Las proteínas migran hasta alcanzar un pH
igual a su punto isoeléctrico
Es muy útil para estudiar modificaciones
postraduccionales en proteínas, trabajar
con isoenzimas, etc
cátodo
Electroforesis en dos dimensiones
Primera dimensión: isoelectroenfoque
Segunda dimensión : SDS-PAGE
Permite analizar mezclas más complejas como extractos celulares, muestras de
sangre, etc
Electroforesis capilar
Las muestras pueden correr en
solución o en gel
Aumenta la relación
superficie-volumen: permite
un mejor control de la
temperatura y por lo tanto la
posibilidad de aplicar
voltajes mayores
Se siembran volúmenes pequeños de muestra, pero ésta debe estar
concentrada
La detección implica observar las bandas de proteína a medida que estas
pasan por una sección de capilar (detección UV, fluorescente,
espectrometría de masa)
Solo se puede analizar una muestra a la vez, pero es una técnica rápida,
no implica tinción y los datos obtenidos son cuantitativos
Visualización de las bandas en el gel
1. Tinción
Azul de Coomassie:
se une a las proteínas en forma específica (~0.1 µg de proteína)
es necesario un paso de desteñido
Plata:
100 veces más sensible que la tinción con Coomassie
Es necesario en primer lugar fijar las proteínas al gel para minimizar la
difusión
Se expone al gel a una solución de nitrato de plata y éste es reducido a
plata metálica donde se encuentran las proteínas produciendo la
precipitación de granos de plata
Puede presentar importantes backgrounds, es más cara e implica más pasos
Azul de Coomassie
Plata
2. Detección de proteínas específicas
a. Medida de actividad
Restringida a enzimas y geles nativos
xantina oxidasa
xantina + 2O2
NBT
oxidado
Purificación de xantina oxidasa a partir
de crema de leche
ácido úrico + 2O2.- + 2H+
Formazán
insoluble
b. Reacción con anticuerpos específicos (Western blot)
Se transfieren las proteínas desde el gel hacia una membrana
(nitrocelulosa o polifluoruro de vinildeno PVDF)
La membrana se pone con contacto con una solución de anticuerpos
específicos para alguna proteína o modificación proteica
Se detecta la unión antígeno-anticuerpo por fluorescencia, actividad
enzimática, etc
Ac-AntiSO2/3H
Ac-AntiNO2Y
Randall et al.
3. Otros
Sondas fluorescentes
Se “pre-tiñen” las proteínas con una sonda fluorescente
Gran sensibilidad
Puede ocasionar cambios en la migración en el gel pues reaccionan con grupos amino
Para observar las bandas se expone el gel a luz UV
Autorradiografía
Si el material a analizar es radiactivo, el gel se pone en contacto con un film
fotográfico
También puede visualizarse en forma directa con el equipamiento adecuado
Detección de glicoproteínas
Se detectan en forma específica usando reactivos que reaccionan con los polisacáridos
(dansil hidrazina)
Detección de fosfoproteínas
Marcado (in vivo) con 32P, revelado por autorradiografía
Liberación del grupo fosfato y atrapado en el gel de fosfato de calcio (derivado
insoluble)
ELECTROFORESIS DE ÁCIDOS NUCLEICOS (ADN, ARN)
Presenta carga negativa debido a los grupos
pirofosfato, por lo que el número de cargas
negativas es proporcional al tamaño de la
molécula
Si se encuentran en conformación
lineal migrarán según su tamaño
Generalmente se utilizan geles de agarosa
Su capacidad de resolución depende del porcentaje de agarosa
0.7 % (5 – 10 kb)
2% (0.2 – 1 kb)
Para moléculas pequeñas: agarosa 3% o poliacrilamida
Para moléculas muy grandes: electroforesis de campo pulsado.
Permite analizar moléculas de ADN de hasta 10000 Kpb (cromosoma
de levadura)
Visualización de las bandas
1. Moléculas fluorescentes e intercalantes: bromuro de etidio
¡¡Como agente intercalante puede ser carcinogénico,
mutagénico y teratogénico!!
Otras alternativas: SYBR Green, Goldview (agentes intercalantes)
2. Southern (ADN) y Northern (ARN) blot
Requiere transferir desde el gel hacia una
membrana
Se hibrida con una sonda marcada
capaz de hibridizar con una secuencia
de interés