Download RFLP-PCR: Detección de alelo Duarte (mutación N 314 D).

TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
MOLECULAR
Dra. Mariana L. Ferramola
Curso de Técnicas moleculares aplicadas a
bioquímica clínica.
Área de Qca. Biológica
FQByF, UNSL
2014
REACCIÓN DE PCR
Esta reacción permite obtener un gran número de
copias de una secuencia de ácido nucleico
determinada, ya sea ADN o ARN.
RT-PCR
Muestra de partida: ARN.
Pasos de reacción:
1) Transcripción
reversa
para obtención de ADNc.
2) Amplificación
de
la
secuencia
deseada
mediante PCR.
RT-PCR: Detección de virus de Influenza A.
Pachucki y col., JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, June 2004, p. 2796–2798.
Muestra: Hisopado nasal y faríngeo.
Transcripción Reversa: RNA total, usando random primer hexamers.
Identificación del virus de
Influenza A mediante
amplificación por PCR del
gen de matriz de dicho virus
(212bp).
RFLP-PCR
Esta técnica aprovecha la aparición o eliminación de un sitio
de corte para una enzima de restricción, debido a una
mutación puntual.
La técnica consta de dos pasos sucesivos:
1) Amplificación de la secuencia de interés mediante PCR.
2) Restricción de la secuencia amplificada con una enzima
específica.
RFLP-PCR: Acción de las enzimas de restricción.
RFLP-PCR
RFLP-PCR: Detección de alelo Duarte (mutación
N314D).
La variante Duarte, es un alelo polimorfico del gen GALT,
que da como resultado que la enzima presente actividad
disminuída.
La variante se debe a la mutación N314D, en la cual hay una
sustitución (c.940A˃G), que genera un cambio del
aminoácido asparagina (Asn, N) por un ácido aspártico
(Asp, D).
Este polimorfismo genera un cambio de bases que
determina un sitio de corte para la enzima de restricción
AvaII.
RFLP-PCR: Detección de alelo Duarte (mutación
N314D).
RFLP-PCR: Detección de alelo Duarte (mutación
N314D).
Análisis de la mutación N314D en el exón 10 del gen GALT humano. Línea
4: homocigota para el alelo mutado; líneas 1, 2, 5 y 6: heterocigotas y
líneas 3 y 7 al 10: homocigotas para el alelo normal
RFLP-PCR: Detección de virus de Influenza
A resistentes a Amantadina.
Pachucki y col., JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, June 2004, p. 2796–2798.
Primeramente se realiza una
amplificación del gen de la
proteína M2. Luego se
detectan
mutaciones
puntuales que dan resistencia
a amantadina, mediante el
uso
de
enzimas
de
restricción.
GAP-PCR.
Se utiliza para detectar delecciones en el ADN.
Puede usarse un único par de primers que flanqueen la zona
deleccionada, de modo tal que esta sea amplificada en la
reacción de PCR.
Para delecciones pequeñas (menores de 1Kb) el par de
primers utilizados generará dos productos de amplificación, el
fragmento de menor tamaño se producirá a partir del alelo
que presenta la delección.
Cuando la delección es mayor, la distancia entre los primers
en el alelo normal es demasiado grande como para ser
amplificada, y sólo se obtendrá producto a partir del alelo que
presenta la delección (alelo mutado). En estos casos, el alelo
normal es detectado usando un tercer primer, cuya zona de
hibridación se encuentre dentro de la región que se
encuentra delecionada en el alelo mutado
GAP-PCR: Detección de delecciones que
causan α-talasemia..
Alelo normal
Alelo mutado
Long range PCR.
Esta técnica ha sido utilizada para detectar delecciones e
inserciones.
Pueden
obtenerse
amplicones de hasta
30Kb.
El protocolo de PCR es
modificado
por
la
introducción
de
una
polimerasa con actividad
correctora de pruebas (3’5’-exonucleasa) además
de la Taq polimerasa.
Long range PCR: Detección de inserciones
SSCP (Polimorfismos de conformación de
cadena única)..
La técnica de SSCP detecta variaciones en la secuencia del ADN
(mutaciones puntuales y otros cambios pequeños) debido a la
generación de diferencias en la movilidad electroforética.
Bajo condiciones no desnaturalizantes, las moléculas de ssADN
asumen conformaciones únicas que dependen de su secuencia
de nucleótidos.
Los cambios conformacionales producidos por variaciones en la
secuencia de ADN pueden resultar en diferencia de movilidad
detectables.
La mayoría de los experimentos de SSCP son diseñados para
evaluar polimorfismos en un único locus, y comparar los
resultados entre individuos diferentes.
SSCP
1. Un par de primers específicos es
utilizado para amplificar el ADN
blanco.
2. La muestra se enriquece en ssADN
por medio de una PCR asimétrica,
debido a la presencia de uno de
los primers en mayor cantidad que
el otro.
3. Las movilidades de los fragmentos
simple cadena se comparan
mediante electroforesis en un gel
neutro de poliacrilamida.
4. Las bandas son detectadas.
SSCP: esquema de trabajo.
SSCP: ejemplo.
El análisis del ADN por SSCP muestra haplotipos múltiples , o sets de
alelos usualmente heredados como una unidad. Las calles 3 y 4
mostraron haplotipos idénticos de dos individuos diferentes. Las
diferencias de migración de bandas en calles adyacentes está asociada
con la cantidad de nucleótidos diferentes presentes: calles 2-3 (2); calles
3-4 (0); calles 4-5 (3); calles 5-6 (1); calles 6-7 (3); calles 7-8 (1); calles 89 (1); y calles 9-10 (4).
Transferencia Southern
Se utiliza para analizar
fragmentos de DNA
generados por digestión
con enzimas de
restricción.
Transferencia Southern
Transferencia Southern
Se utilizan sondas de gran tamaño, con grados de
actividad variable, dependiendo del uso.
Principales usos:
 Detección
de
secuencias
relacionadas ( ej. familias de genes).
 Detección
de
deleciones
e
inserciones grandes causantes de
enfermedades
(ej.
Distrofia
muscular de Duchenne).
 Identificación
de
individuos
mediante VNTR.
 Detección de RFLP.