Download 2 TBBM homogeneizacion 11-12

Tecnología en Bioquímica y Biología Molecular.
4º Biología. Curso 2011-2012
José María Pérez Freije
Dpto. Bioquímica y Biología Molecular, 4.15
Tel. 985 10 6281
[email protected]
http://degradome.uniovi.es/jmpf/TBBM
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Homogeneización de muestras biológicas
• Obtener biomoléculas en forma soluble
• Disgregar tejidos
• Lisar células
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Homogeneización de muestras biológicas
• Procedimientos mecánicos
• Métodos químicos (detergentes, agentes caotrópicos)
• Métodos enzimáticos
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Homogeneización de muestras biológicas
Elección del método de homogeneización
• Material biológico de partida. Naturaleza y cantidad
• Biomolécula a analizar o purificar. Sensibilidad a
degradación enzimática, oxidación, etc-
• Finalidad. Necesidad o no de preservar la estructura
y/o función de orgánulos o de la propia biomolécula
• Control de la temperatura
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Métodos mecánicos de homogeneización
• Molienda con partículas de vidrio
• Pulverización de tejidos congelados
• Homogeneizadores de émbolo y tubo
• Homogeneizadores rotor/estator
• Presurización/despresurización
• Nebulización
• Ultrasonidos
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Molienda con partículas de vidrio
• Rotura basada en el impacto con bolas (vidrio, acero, cerámica)
• Impacto
• Tensión de cizalla
• Cambios de presión
• Necesidad de controlar la temperatura
• Aplicaciones frecuentes: rotura de microorganismos (bacterias,
levaduras, esporas)
• Formatos:
• agitación del recipiente (manual o automática)
• agitación interna
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Molienda con partículas de vidrio
Trituradores con agitación interna
• Escala preparativa
• Sistemas refrigerados
• Aplicaciones frecuentes:
rotura de microorganismos
(bacterias, levaduras, esporas)
Triturador Dyno-Mill
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Pulverización de muestras congeladas
• La utilización de morteros permite triturar tejidos
congelados hasta pulverizarlos completamente.
• La homogeneización con nitrógeno líquido (-196 ºC)
impide la degradación y desnaturalización de las
biomoléculas
• Muy útil para obtener RNA de tejidos ricos en
nucleasas o difíciles de homogeneizar
• Morteros convencionales de cerámica, morteros
especiales de acero
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Homogeneizadores de émbolo y tubo
• Separación émbolo-pared del tubo calibrada según tamaño de
partícula deseado.
• Los tejidos deben ser previamente picados y se suspenden en un
volumen exceso de medio (4-10 veces).
• Fraccionamiento de tejidos animales frágiles como cerebro e
hígado. No es eficiente en la fragmentación de microorganismos.
• Preferido en preparación de orgánulos subcelulares
• Acciónvsuave. Permite un buen control de la temperatura
generada por la fricción.
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Homogeneizadores de émbolo y tubo
Teflón / vidrio
(Potter Elvehjem)
vidrio / vidrio
(Dounce)
vidrio (hueco) /
vidrio
(Tenbroeck)
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Homogeneizadores de émbolo y tubo
Teflón / vidrio
(Potter Elvehjem)
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Homogeneizadores rotor/estator (“politrón”)
Rotor
Disrupted
cells
Cell
suspension
Stator
• Consisten en un rotor que gira a alta velocidad en el interior de un tubo
perforado que permanece fijo (estator)
• Homogenización rápida (10-60 s) y completa. Mecanismo de turbulencia
ligera. Protección de organelos: menor velocidad y tiempo de exposición.
• Uso: tejidos animales y vegetales. Extracción de RNA.
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Presurización/despresurización
• Inventada por Stacy French
French Press
• Se usa para romper bacterias y levaduras
• La suspensión de microorganismos se introduce en la célula de
presión (cilindro de acero) y se aplica presión mediante un
émbolo y una prensa hidráulica
• Los microorganismos estallan debido al cambio de presión que
experimentan al abrir una válvula
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Sonicación
• Aplica ultrasonidos a suspensiones celulares
• Cavitación.
• Volúmenes variables (0.1 ml – 500 ml)
• Microorganismos, células eucariotas
• Fragmenta ácidos nucleicos, disminuye la viscosidad
• Genera cantidades importantes de calor
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Métodos mecánicos de homogeneización
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Tampones para homogeneización de tejidos y lisis celular
• Tampón
• Sal, sacarosa
• Detergentes
• Agentes desnaturalizantes (urea, guanidinio)
• Inhibidores de proteasas
• Inhibidores de nucleasas
• Inhibidores de fosfatasas
• Agentes reductores
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Detergentes
• Moléculas anfipáticas: Grupos polares y apolares
• Grupos polares: puentes de hidrógeno con agua
• Grupos apolares: agregan por interacciones hidrofóbicas
• Concentración micelar crítica (CMC): concentración a
partir de la cual se forman micelas.
• Detergentes = surfactantes (disminuyen la tensión
superficial del agua
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Detergentes
• Tampón
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Detergentes
• Detergentes iónicos (aniónicos, catiónicos)
• Sales biliares
• Detergentes no iónicos
• Detergentes zwiteriónicos (CHAPS, ZWITTERGENT® 3-X)
partir de la cual se forman micelas.
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SDS: Dodecil sulfato sódico, lauril sulfato sódico
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Detergentes
• Detergentes iónicos (aniónicos, catiónicos)
• Sales biliares
• Detergentes no iónicos
• Detergentes zwiteriónicos (CHAPS, ZWITTERGENT® 3-X)
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Agentes desnaturalizantes
• Ácidos, compuestos alcalinos
• Compuestos caotrópicos
• Urea
• Cloruro de guanidinio
• Solventes orgánicos (etanol, metanol, acetonitrilo, etc.)
• Compuestos reductores (DTT, 2-mercaptoetanol)
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Lisis ezimática
• Bacterias: lisozima (N-acetylmuramide glycanhydrolase)
• Levaduras: Zymolyase (Lyticase)
• Tejidos animales: Proteasas (colagenasa, dispasa, tripsina)
• Enzimas degradativos: proteasas, DNasas, RNasas
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Tampones para homogeneización de tejidos y lisis celular
• Tampón RIPA (“Radio-Immunoprecipitation
Assay”): lisado de cultivos celulares
· Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4
· NP-40: 1%
· Na-deoxycholate: 0.25%
· NaCl: 150 mM
· EDTA: 1 mM
· PMSF: 1 mM
· Aprotinin, leupeptin, pepstatin: 1 µg/ml each
· Na3VO4: 1 mM
· NaF: 1 mM
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Tampones para homogeneización de tejidos y lisis celular
• Tampón GIT (extracción de RNA)
* 4 M Guanidine thiocyanate
* 25 mM Sodium Citrate
* 0.5% Sarkosyl
* 0.1 M Beta-Mercaptoethanol
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Tampones para homogeneización de tejidos y lisis celular
• Tampón “A” (lisis enzimática de bacterias)
50 mM Tris pH 7.9
50 mM Glucosa
1 mM EDTA
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Lisis enzimática de bacterias
1. Centrifugar 10 min a 5000 rpm
2. Tirar el SN, escurrir el tubo boca abajo sobre un papel. Resuspender el pellet
con 50 ml de Buffer A.
3. Centrifugar 10 min a 5000 rpm
4. Tirar el SN, escurrir el tubo boca abajo sobre un papel. Resuspender el pellet
con 10 ml de Buffer A. Pasar 1.5 ml a un tubo eppendorf de 2 ml. Guardar el
resto congelado a -20ºC.
5. Añadir 15 microlitros de lisozima (stock 100 mg/ml). Dejar 15 min a
temperatura ambiente, volteando de vez en cuando.
6. Congelar con hielo seco o Etanol frío a -80 ºC. Descongelar a 75 ºC.
7. Congelar y descongelar de nuevo. Pasar a hielo.
8. Centrifugar 20 minutos a 12.000 rpm a 4 ºC. Recoger el sobrenadante
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