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TRANSFECCION
Transferencia de material genético
• Métodos no virales (Mecanismos físicos).
– Técnicas no virales con aplicaciones “in vitro” e “in vivo”
– Vectores no virales limitados a aplicaciones “in vitro”
• Métodos virales.
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Técnicas no virales limitadas a aplicaciones “in vitro”
•
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Transfección con compuestos químicos: fosfato cálcico,
DEAE-dextrano
Microinyección
Electroporación
Técnicas no virales con aplicaciones “in vitro” e “in vivo”
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•
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Liposomas
Inyección de ADN desnudo
Inyección balística de ADN
Inmunización basada en ADN
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Técnicas no virales limitadas a aplicaciones “in vitro”
Transfección con fosfato cálcico.
Eficiencia de transfección mayores del 10% en alguna línea celular.
En muchos casos menor del 1%. Toxicidad mínima. Mecanismo:
endocitosis.
Transfección con DEAE-dextrano.
Más reproducible. Mecanismo desconocido. Sólo funciona en un
número reducido de líneas.
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Técnicas no virales limitadas a aplicaciones “in vitro”
Microinyección.
Se evita la degradación lisosomal y citoplasmática del material.
Técnica laboriosa que requiere células bien aisladas. La modificación de la
línea germinal permite en mamíferos la producción de transgénicos.
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Técnicas no virales limitadas a aplicaciones “in vitro”
Electroporación.
Aplicación de alto voltaje a una mezcla de ADN y células en
suspensión. La eficiencia de la transferencia depende del pulso eléctrico,
distancia entre electrodos, fuerza iónica del tampón de suspensión celular y
de la naturaleza de las células. Muchas células de mamíferos no sobreviven al
pulso eléctrico.
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Técnicas no virales con aplicaciones “in vitro” e “in vivo”
Liposomas
Liposomas catiónicos. Forman complejos con el ADN. Están formados por un
lípido positivamente cargado y un colípido (“lípidos ayudantes”: DOPE,
DOPC). Un lípido catiónico ampliamente utilizado es la lipofectina (1987.
Mezcla de cloruro de N-[1-(2,3-dioleyiloxy))propil]-N-N-N-trimetil amonio –
DOTMA- y DOPE). ADN y lipofectina interaccionan espontáneamente
formando complejos con una eficiencia del 100%. Inmediatamente después
de la administración intravenosa de estos complejos tanto pulmón como
hígado muestran una afinidad marcada por su incorporación y la expresión
del transgen.
Liposomas sensible a pH (liposomas negativamente cargados). No forman
complejos. ADN queda atrapado en la fase acuosa interior del liposoma.
Aplicaciones: 1.- Pueden transferir moléculas negativa- o positivamente
cargadas. 2.- Ofrecen un grado de protección al ADN de procesos
degradativos. 3.- Pueden llevar trozos grandes de ADN. 4.- Pueden ser
dirigidos específicamente a tejidos u órganos.
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Transfección por
Lípidos catiónicos
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Técnicas no virales con aplicaciones “in vitro” e “in
vivo”
Inyección de ADN plasmídico desnudo
Fácil de realizar.
Los tejidos que muestran expresión del transgen después de inyección de
ADN plasmídico incluyen timo, piel, músculo cardíaco y esquelético.
El ADN plasmídico no sufre cambios en el patrón de metilación sugiriendo
que no se ha replicado después de la inyección y tampoco se integra en el
genoma.
La preinyección de soluciones de sacarosa en el músculo incrementa algo
los niveles de expresión del transgen.
El músculo de primates parece ser menos eficiente en la incorporación del
ADN que el músculo de roedores. Tamaño del ADN: 2-19 kilobases.
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Técnicas no virales con aplicaciones “in vitro” e “in
vivo”
Inyección balística de ADN
Bombardeo de partículas, transferencia génica por microproyectiles o
“gene-gun”. El ADN plasmídico del gen recubre micropartículas de oro o
tungsteno de 1-3 micras de diámetro. Estas se colocan en una lámina
soporte y se descargan sobre el blanco. Libera dosis controladas de ADN.
Produce daño en la célula.
Inmunización basada en ADN. Inmunización contra HIV, hepatitis B y
C, papiloma, Helicobacter pylori, malaria, etc.
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Vectores virales
Retrovirus
• Son virus ARN que tienen capacidad para integrar genes terapéuticos
relativamente grandes (un máximo de 8 Kb). Necesitan de células
empaquetadoras para su obtención. Se transfiere el DNA del virus
mediante la técnica del fosfato de calcio a las células empaquetadoras.
Posteriormente se realiza una segunda transducción en la cual
introducimos la construcción génica de interés.
• Los virus inyectados en el huésped integran su DNA en el genoma del
huésped expresando así el gen que le hemos añadido. Como las proteínas
del virus no son expresadas por el huésped, no tenemos una respuesta
inmunitaria. Tienen una alta eficacia de transducción y también de
expresión, siendo un sistema bien estudiado.
• Sin embargo, únicamente sirven para infectar células del huésped que se
encuentran en división. Además los títulos de virus obtenidos hasta ahora
son bajos y la integración en el genoma es al azar.
• Existen también vectores basados en el virus del SIDA (HIV), cuyo genoma
es más complejo pero con un funcionamiento similar al que hemos visto.
Son los denominados lentivirus.
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Vectores virales
Adenovirus
• Son una familia de virus ADN que causan infecciones en el tracto
respiratorio humano. Se pueden llegar a insertar en ellos hasta 7.5
Kb. de DNA exógeno. Normalmente en terapia génica se utiliza el
serotipo 5, aunque existen hasta 42 serotipos diferentes que
infectan a humanos.
• En este caso no se necesita la integración del material hereditario
del virus en el del huésped para su replicación, por lo tanto
tampoco el transgén será introducido en el genoma de la célula. Y
por tanto tampoco necesitan que las células infectadas estén
dividiéndose para su replicación.
• La gran ventaja de usar un adenovirus como vector es la alta
eficacia de transducción, al igual que la expresión de la
construcción génica introducida, sin embargo ésta es transitoria
(pocas semanas). Esto último obligaría a tratamientos periódicos lo
cual es un inconveniente ya que los adenovirus producen respuesta
inmune celular e inflamatoria.
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Vectores virales
Virus adenoasociados (VAA)
• Son parvovirus, contienen ADN como material genético, y
requieren la coinfección con un adenovirus para multiplicarse. Son
vectores que combinan las ventajas de los retrovirales y los
adenovirales. Su capacidad de integrar DNA exógeno es pequeña,
sólo de 5 Kb.
• Las principales ventajas son que los virus adenoasociados integran
su ADN en la célula durante la replicación, por lo que la
transducción (la cual es altamente eficaz) es estable en la célula
diana. Además pueden infectar tanto a células en división como a
las que no lo están (de gran importancia para la terapia génica "in
vivo"). Los vectores AAV no están implicados en ningún tipo de
enfermedad humana. Además el riesgo de una respuesta inmune
está minimizado ya que no produce proteínas víricas.
• Sin embargo existen también una serie de inconvenientes como
que este tipo de vectores todavía no ha sido tan bien estudiado
como los retrovirus y los adenovirus.
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Vectores virales
Herpesvirus
• Son virus DNA cuyas células diana son las neuronas. Su
complejidad y lo poco que todavía conocemos de esta familia de
virus dificulta su utilización.
• La gran ventaja es el gran tamaño de su ADN, que les permite
aceptar varios genes terapéuticos, incluso podrían ir con sus
propias regiones reguladoras.
• Uno de los inconvenientes es que habría que eliminar las
secuencias que codifican para las proteínas líticas del virus que
causan la muerte de las células a las que infectan.
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Nivel de intervención
Gen mutante
Estrategia de tratamiento
Modificación del genotipo somático
(trasplante: terapia por transferencia génica)
mRNA mutante
Modulación farmacológica de la
expresión génica
Proteína mutante
Reemplazo de la proteína. Estimulación
de la función residual de la proteína
Disfunción metabólica
o bioquímica
Compensación en la dieta o farmacológica
en pacientes seleccionados
Fenotipo clínico
Intervención médica o quirúrgica
Familia
Consejo genético; “screening”;diagnóstico
presintomático
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Tratamiento por manipulación metabólica
Intervención metabólica
Sustancia o técnica
Ejemplo Bioquímico
Anulación
Fármacos antimalaria
Restricción dieta
Fenilalanina, Galactosa
PKU, Galactosemia
Reemplazo
Tiroxina, Biotina
Desvío
Benzoato sódico
Hipotiroidismo,
Deficiencia biotinasa
Desórdenes ciclo de la urea
Inhibición
Lovastatina
Agotamiento
Deficiencia G6PD
Hipercolesterolemia familiar
Terapia de cambio de plasma Hipercolesterolemia familiar
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Tratamiento al nivel de la proteína mutante
Estrategia
Ejemplo
.
Incremento de la función proteína mutante
Administración cofactor para
incrementar la actividad del enzima
Homocistinuria con respuesta a
piridoxina
Incremento de la función proteína mutante
Reemplazo de una proteína extracelular
Factor VIII en hemofilia A
Deficiencia en alfa-1-antitripsina
Reemplazo extracelular de una
proteína intracelular
Deficiencia en adenosina deaminasa
(ADA modificada con PEG)
Reemplazo de una proteína intracelular
por “cell targeting”
Glucocerebrosidasa modificada
en la enfermedad de Gaucher
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Modificación del genoma o su expresión
Tipo de modificación
Modificación farmacológica
Ejemplo
.
Hidroxiurea para estimular la síntesis
de Hb F (anemias y talasemias)
INF-γ (enfermedad granulomatosa)
Modificación del genotipo somático
Por transplante
Trasplante de médula ósea
(Talasemias y enfermedades lisosomales)
Trasplante de hígado
(deficiencia en alfa-1-antitripsina)
Por transferencia de ADN
Adenosina deaminasa (deficiencia ADA)
Factor de crecimiento endotelial vascular
(isquemia de miocardio)
p53 (cáncer de pulmón)
BRCA1 (cáncer de ovario)
E1A (cáncer de ovario)
CFTR (Fibrosis quística)
Bcl-2 antisentido (linfoma non-Hodgkin)
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Tres categorías de terapias de terapia génica de células somáticas:
1. Ex vivo – Las células son retiradas del cuerpo, incubadas con el
vector y las células portadoras del gen vuelven al organismo.
2. In situ – El vector se coloca directamente en los tejidos afectados.
3. In vivo – El vector se inyecta directamente en el torrente
circulatorio.
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