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La flora microbiana responsable de la
degradación de la fibra y el efecto de la
levadura viva sobre las poblaciones
fibrolíticas y su actividad
Aurélien Piron
Paula Soler
Lallemand Animal Nutrition
Degradación de la fibra en el rumen:
Interacciones microbianas complejas
Pared celular plantas: celulosa, hemicelulosa, pectinas
Especies hidrolíticas
Azúcares solubles
Especies hidrolíticas y fermentativas
Formiato
Piruvato
Lactato
Succinato
CO2
H2
CO2
Archæa methanogens
CO2
Acetato
Butirato
Propionato
Fuentes de energía para el huésped
CH4
Eructado
Características de la flora fibrolítica del rumen
Bacteria
 Número limitado de especies
Fibrobacter succinogenes:
muy activa
en celulolsa cristalina y xilanos
Ruminococcus albus
Ruminococcus flavefaciens
Activa en celulosa,
xilanos, pectinas
Butyrivibrio fibrisolvens, Prevotella ruminicola: activa en xilanos y
pectinas pero no en celulosa
Recientemente se han descrito nuevas especies en el rumen del
yak Cellulosilyticum ruminicola
 Principalment abundancia de especies fibrolíticas: 109
cél. ml-1 (1-5% del total de bacterias)
Características de la flora fibrolítica del rumen
Bacteria
 Diferentes estrategias de adhesión
fimbria o pili
epitopes carbohidrato de glicocálix bacteriano
 Varios genes de celulasa y xilanasa identificados en
el genoma de las tres principales especies
programa secuencial de genomas (FibRumBa DB)  113 genes
en F. succinogenes implicados en la degradación de la fibra, 29
celulasas, 23 hemicelulasas
Características de la flora fibrolítica del rumen
Protozoos ciliados
 Entodiniomorfos:
Polyplastron, Eudiplodinium, Epidinium
 Abundancia: 104 - 106.g-1 del contenido del rumen
 Digestión de celulosa y xilano en vacuolas digestivas
(modo citótico o permeativo)
 Equipamiento enzimático muy complejo para la rotura
de la pared celular: celulasas, hemicelulasas
Características de la flora fibrolítica del rumen
Hongo
 Grupo funcional muy especializado
Alta actividad de celulasas y hemicelulasas
 Varias esterasas activas en la unión entre compuestos
fenólicos y polisacáridos estructurales
 Debilitación y rotura de la pared celular de la
planta debido a una red rhizoidal
Eficiencia de la degradación de la fibra
depende de varios factores
Fisiología de les poblacions
fibrolítiques
Interacción entre microbios
Parámetros físico-químicos
del ambiente
Estructura físico-química de la
fibra
Factores del animal
Afinidad, preferencias de substrato,
requerimientos de energía…
Sinergía (cross feeding, transferencia
hidrógeno ) vs competencia (péptidos
inhibitorios, predación, sitios de
adhesión…)
pH (acidosis), potencial redox
Contenido de lignina, ceras, cutícula
Masticación, rumia tamaño de
partículas, tiempo de retención
Cuestiones a investigar
¿Los aditivos microbianos (levadura viva) pueden ser
una herramienta para promover o ayudar a la
degradación de la fibra en el rumen?
Degradación Fibra comunidades microbianas
Colonización
crecimiento
Equilibrio microbiano
Actividades
enzimáticas
¿Cúales son los mecanismos de acción?
¿Cómo medir el efecto y el modo de acción de la levadura
viva sobre la degradación de la fibra en el rumen?
Degradación de la MS / FND de las
materias primas o la ración completa
Análisis de la fibracomunidades que actúan
In vitro – Animales fistulados –
Animales no fistulados
Estructura - Abundancia
Dinámica - Actividad
Impacto en resultados
zootécnicos, eficiencia
alimentaria
Modo de acción
Resumen de los resultados in
vitro, in sacco, e in vivo que
muestran los beneficios de la
utilización de Saccharomyces
cerevisiae I-1077 en la digestión
de la fibra
 Levadura viva añadida al alimento
 Cepa seleccionada para promover el funcionamiento del
rumen
 Ha demostrado eficacia limitando la acidosis
 Estudios recientes se centran en la mejora de la digestión de
la fibra incluso en situaciones no acidógenas
Efecto de la levadura viva, Saccharomyces cerevisiae
I-1077, en la degradación de la fibra
Estudios In vitro
39°C, anaerobiosis
4 botes al mismo
tiempo
Vacas fistuladas
Búfer anaerobia
Sacos con
alimento
60
50
40
30
20
10
0
+3.2
Incubaciones Daisy
(%)FND degradada
Analizar fibra
Contenido FND
+9.8
Control
+3.0
SC I-1077
+5.1
+1.8
Ensilado
Maíz
Paja de
trigo
Heno
Alfalfa
Heno
pradera
Ensilado
hierba
[Walker et al., BRI Canada 2008-2010]
Efectos de SC I-1077 en la degradación de la fibra
 Estudios In situ: técnica de sacos de nylon
70
(%) FND degradada
60
+4.6
40
30
+5.6
+4.1
50
+7.8
+5.1
+8.0
+1.7
+2.5
+5.9
+5.1
+5.5
20
10
0
Control
Levucell
SC
SC I-1077
Una mejora constante de la degradación de la FND en sacco con
SC I-1077, con variaciones relacionadas con la naturaleza de la fibra
Guedes et al., 2008 Anim Feed Sci Technol; Walker et al., BRI Canada 2008-2010; Chaucheyras Durand et
al., 2010 Proc Soc Nutr Physiol , J Anim Sci/J Dairy Sci (suppl), Meeske et al., 2010 unpubl.
Beneficios In vivo de SC I-1077
distribución diaria
(%) degradación FND
50
44,1
45
39,3
Total tract digestibilidad
Bovino engorde
35
Ensilado maíz
+2.5-3 kg concentrado (60% trigo 40% harina de soja) /día
30
[Schwartz et al., 2001, Proc Soc Nutr Phys]
40
Control
SC I-1077
(%) degradación FND
50
45
48,1
Vacas lecheras
Ensilado maíz 43.9%, copos maíz 14.4%, Pellet pulpa
cítricos 16.9%, harina de soja 21.7%, heno 2%
43,2
[Bitencourt et al., 2008, J Anim Sci/J Dairy Sci suppl]
40
Control
SC I-1077
Según Oba y Allen (1999)
1 unidad de dFND (in vitro o in situ)=
+0.17kg/d MSI = + 0.25kg/d de 4%FCM
Modo de acción de SC I-1077
en las especies fibrolíticas
Establecimiento de las especies fibrolíticas
en los animales recién nacidos
0
7
14
Bacterias
anaerobias
estrictas
21
60
Edad (d)
Bacteria celulolítica
Archaea methanogens
Hongos
fibrolíticos
 Secuencia de la
colonización de
microorganismos
después del nacimiento
Protozoos ciliados
 Estudios gnotobióticos:
El establecimiento de las
especies fibrolíticas depende
mucho de la complejidad
microbiota
Efectos de SC I-1077
Corderos gnotobióticos
Microflora simplificada
3 especies de bacteria
Inoculadas como
únicos organismos
celulolíticos
Levadura suministrada
diariamente
Corderos convencionales
Condiciones normales
Levadura suministrada
diarimente
 Colonización más
rápida por bacterias
celulolíticas,
 Aumento de la
densidad de la
población,
 Aceleración de la
madurez del rumen
(protozoos)
 Aumento de la
dMS de la paja de
trigo in sacco y
mayor actividad
enzimática
[Chaucheyras Durand and Fonty, 2001 Reprod Nutr Dev; 2002 Microb Ecol Health Dis]
Efectos de SC I-1077
Análisis « fingerprint » del ADN para valorar la diversidad
bacteriana en el rumen de los terneros
2 x 8 terneros
2 muestras rumen / ternero obtenidas en 2 periodos (L=
consumo leche vs AS=introducción del alimento sólido)
Extracción ADN y ampliación PCR de 16s regiones genes rADN
Comparación por PCR de los perfiles de los productos
9.5
0.95
9
0.9
8.5
0.85
8
0.8
7.5
control, M
control, SF
SC, M
SC, SF
mean nb of bands
Índice diversidad
Shannon
M=sólo leche
0.75
SF=int. alimento sólido
Confirma observaciones previas: efecto positivo de SC- I 1077 en la madurez del rumen
[Chaucheyras Durand et al., 2011 unpubl.]
Efectos sobre las bacteria fibrolíticas
Sacos de nylon con heno de alfalfa, salvado de trigo, cascarilla de soja o silo de trigo
Incubación durante 2, 6, 12, y 24h en el rumen de vacas fistuladas alimentadas con 0 o
1010 UFC/d de SC I-1077 (ración base: heno y ensilado de hierba)
Cuantificación de las poblaciones adheridas por qPCR
Fibrobacter
succinogenes
Aumenta el tamaño de la población en la cascarilla de soja
(P<0.05) y en el salvado de trigo (P<0.0001)
No hay efecto de SC en heno de alfalfa y silo de trigo
Ruminococcus
flavefaciens
Aumenta el tamaño de la población en el heno de alfalfa y el
silo de trigo (P<0.05)
No hay efecto en cascarilla de soja y salvado de trigo
Butyrivibrio
fibrisolvens
Aumenta el tamaño de la población en todas las fuentes de
fibras en presencia de SC-I 1077 (P<0.001)
 SC I-1077 promueve la colonización de la fibra por las bacterias del rumen
 Los efectos dependen de la naturaleza del sustrato y de la especies de las
bacterias
[Chaucheyras Durand et al. 2010 Proc Soc Nutr Physiol; J Anim Sci/J Dairy Sci suppl]
Efecto sobre los hongos del rumen
Degradación de la celulosa por Neocallimastix
frontalis in vitro
SC también promueve
germinación zoospora
Crecimiento
N.frontalis
en celulosa de
papel de filtro
(6 d; 39°C)
Cuantificación total hongos in vivo por qPCR
SC I-1077 estimula la colonización
de hongos en paja de trigo
(P<0.05)
Aumenta numéricamente la
población de hongos en la
cascarilla de soja, salvado de trigo
y heno alfalfa
[Chaucheyras et al .,1995; Chaucheyras Durand et al. ,2010 Proc Soc Nutr Physiol; J Anim Sci/J Dairy Sci suppl]
 Los efectos de SC-1077 sobre la degradación de
los tejidos lignosos son importantes tanto para las
bacterias como los hongos
SC I-1077
Deg FND
0,45
0,40
0,35
0,30
0,25
0,20
0,15
0,10
0,05
0
+4,3%
+24%
control
+ SC I-1077
LowLFD
digestibility
Ensilado
con baja
fibre
degradabilidad
(NDFdeg:0,2-0,3)
(NDFdeg:0,2-0,3)
HighHFD
digestibility
Ensilado
con alta
fibre
degradabilidad
(NDFdeg:0,35-0,45)
(NDFdeg:0,35-0,45)
[Guedes et al., 2008 Anim Feed Sci Technol]
También se observan efectos positivos sobre
microorganismos fibrolíticos en condiciones de acidosis
Ovejas canuladas
Ovejas canuladas
Ración: 50% heno 50% concentrado
Control
0% cebada
Control
66% cebada
SC-1077
66% cebada
PCR Cuantitativo
Actividad Enzimática
[Michalet Doreau et al., 1997 Reprod Nutr Dev]
[Mosoni et al., 2007 J Appl Microbiol]
SC I-1077 estabiliza pH del rumen, que ayuda a
mantener el potencial fibrolítico
Mecanismos de acción SC I-1077 en la flora
fibrolítica
Promueve el
crecimiento,
colonización del
rumen y la fibra
Aporte de
nutrientes a los
microrganismos
Estimulación de las
funciones
hidrolíticas
… con levaduras vivas viables
… y cepas selececionadas
Mantiene el ambiente
anaerobio
Capacidad de consumir
oxígeno de las
levaduras vivas
Estabilización del pH
en caso de acidosis
Interacción con
productores
/utilizadores de
lactato y protozoos
Chaucheyras-Durand, Walker and Bach, 2008, AFST
Levadura viva CNCM I-1077:… puede optimizar la
eficiencia alimentaria
Meta-análisis del efecto de la levadura viva CNCM I-1077 en producción y
componentes de la leche y eficiencia alimentaria.
M.B. de Ondarza, C.J. Sniffen – ADSA 2009
• 14 ensayos con 1.600 vacas de leche,
• Una dosis y Una cepa de Levadura Viva:
•1010 UFC/vacas de leche/d
•CNCM I-1077
• aumento de la producción de 1 kg de
leche/d
• sin alterar la MSI,
**
P<0.001
0
 Mejora significativamente la eficiencia
alimentaria
(1.70 vs. 1.75 ; P< 0.01 )
 Gran efecto en vacas de alta producción
(:38 kg) leche/d (1.78 vs. 1.85 ; P<0.05).
*
P<0.05
*
P<0. 05
*
P<0. 001
23
INFORMACIÓN A RETENER
 Saccharomyces cerevisiae CNCM I-1077 utilizado como aditivo
alimentario es una herramienta importante para promover y mantener
la degradación de la fibra en el rumen
 Levaduras vivas específicas para el rumen pueden interactuar
directamente sobre los microorganismos fibrolíticos e indirectamente
modificando el ambiente del rumen
 Interacciones son complejas y dependen de la naturaleza del sustrato y
de las especies de microorganismos
 Herramientas como los microarrays ADN deberían ayudar a comprender
mejor la acción de estos aditivos dentro de un ecosistema complicado, y
ayudar a seleccionar nuevas generaciones de productos
 La levadura viva Saccharomyces cerevisiae CNCM I-1077 demuestra una
gran incidencia en la eficiencia alimentaria de las vacas de leche
NRC Biotechnology
Research Institute
Unit of Microbiology
Gracias por su atención!