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BIODIVERSIDAD, BIOTECNOLOGÍA Y GENÓMICA DE Capsicum: EL
TRANSCRIPTOMA DEL CHILE MEXICANO
Resumen ejecutivo
El chile (Capsicum spp.) constituye desde la antigüedad uno de los alimentos
más típicos e importantes de México. Se conocen cerca de 30 especies, que
pueden ser consumidas en fresco (verde) o seco. Aunque nuestro país
presenta la mayor diversidad y distribución tanto de formas cultivadas como de
silvestres de Capsicum annuum, en México se cuenta con muy pocos estudios
a nivel molecular sobre los miembros del género Capsicum. Los avances
tecnológicos recientes de las ciencias genómicas y de la bioinformática han
permitido la generación de bases de datos completas de genes de diversos
organismos, además de su localización y función, acelerando el descubrimiento
de numerosos genes de importancia agronómica.
El presente proyecto tuvo como objetivo obtener, identificar y anotar
funcionalmente una colección representativa de la mayoría de los genes de la
planta de chile durante las distintas etapas de desarrollo en condiciones
controladas de crecimiento. Se eligió como modelo de estudio la variedad de
chile serrano Tampiqueño 74, por ser uno de los tipos de mayor consumo en
México. Para ello, se cultivaron plantas de chile en condiciones controladas de
temperatura y humedad, las cuales se utilizaron para construir siete genotecas
de cDNA provenientes de diferentes tejidos.
Los cDNAs se obtuvieron de RNA mensajeros extraídos de raíz, tallo, hoja, flor
y fruto. Los cDNAs se fraccionaron por tamaño y se clonaron en un vector
adecuado.
Todas
aquellas
genotecas
que
tuvieron
porcentajes
recombinación superiores al 90%, así como títulos mayores de
de
1x10 6
unidades formadoras de colonias, se seleccionaron para su secuenciación. Se
secuenciaron unidireccionalmente por el extremo 5’ un total de 45,446 clonas al
azar. Los electroferogramas resultantes se procesaron automáticamente en la
base de datos Mazorka (http://mazorka.ira.cinvestav.mx:8080/), implementada
en el Cinvestav-Unidad Irapuato. Después de filtrar por calidad y vector, se
obtuvieron 38,767 ESTs con una longitud promedio de 741.2 pares de bases y
una calidad promedio de 41.9. El proceso de BLAST permitió la identificación
de 31,793 (79%) de estas secuencias, quedando por identificar 8,332 ESTs
(21%) que serán analizadas por otros métodos para determinar su identidad.
Las secuencias identificadas correspondieron a 11,647 genes distintos.
La clasificación funcional de las secuencias se realizó de acuerdo a los
términos del proyecto Gene Ontology de TIGR. Los transcritos que tuvieron una
frecuencia relativa mayor para cada órgano correspondieron a enzimas con
actividad de hidrolasa, seguidos de aquellos con actividad de transferasa, todos
relacionados con el metabolismo de proteínas, mientras que los que se
expresaron en menor proporción correspondieron a factores de transcripción y
genes
relacionados con procesos de transducción de señales y del
metabolismo de ácidos nucleicos. Se identificaron genes comunes y genes
únicos para cada uno de los tejidos estudiados. Mediante una estrategia
bioinformática novedosa se determinó el grado de especialización y diversidad
para los transcriptomas de los diferentes tejidos.
Además de las genotecas de cDNA del transcriptoma basal de la planta de
chile, se estableció una genoteca de cDNA de tejidos de pericarpio de frutos
que producían antocianinas para el aislamiento de secuencias relacionadas
con la biosíntesis de esos pigmentos. Por otro lado, se produjeron tres
genotecas sustractivas de tejidos de frutos de chile picantes, tejidos de
pericarpio con antocianinas (pigmentos morados) o con carotenoides
(pigmentos amarillos, anaranjados o rojos) para el aislamiento de secuencias
relacionadas con la biosíntesis de esos tres tipos de compuestos. Asimismo, se
generó una genoteca sustractiva de plantas de chile sometidas a estrés hídrico
para el estudio de genes de expresión diferencial en condiciones de este estrés
abiótico, y otra de plantas tratadas con celulasa para la simulación de un estrés
biótico.
Finalmente, se estudiaron genes de expresión diferencial en plantas de chile
infectadas con un geminivirus (PepGMV) para aislar secuencias relacionadas
con la respuesta de la planta a ese patógeno o aquellas de expresión
diferencial en tejidos con síntomas de remisión. En este caso se utilizó la
pirosecuenciación de cDNAs. Se generaron por esta vía 1,838,567 “reads” de
100 pb (222,558 de hojas sanas, 865,103 de hojas sintomáticas y 750,906 de
hojas con remisión de síntomas).
Todas las secuencias generadas en el presente proyecto están disponibles en
el sistema bioinformático Mazorka.
Demanda o problemática que atiende
Estudiar los genes de importancia biotecnológica de la planta de chile durante
las distintas etapas de desarrollo en condiciones controladas de crecimiento,
para analizar su biodiversidad y las características genómicas que permitan
incrementar el mejoramiento y la producción de chile, especialmente bajo
condiciones de sequía.
Resultados obtenidos y/o descripción. Características de la tecnología
generada
Construcción de genotecas de cDNA de raíz, hoja, tallo, flores y frutos de chile
serrano variedad Tampiqueño 74
Secuenciación y análisis de ESTs del metabolismo basal
Anotación funcional de los ESTs para cuya clasificción se utilizó la colección de
polipéptidos anotados de Arabidopsis thaliana (TIGR), que se encuentra
anotada con los términos del programa Gene Ontology.
Determinación de genes específicos para cada órgano de la planta
Análisis de los genes más expresados en el metabolismo basal
Construcción de genotecas sustractivas de cDNA de chile. Además de las
genotecas de cDNA del transcriptoma basal de plantas de chile serrano
Tampiqueño 74, se establecieron genotecas sustractivas para estudiar genes
que se expresan en algún tejido u órgano particular o como respuesta a algún
factor abiótico o biótico.
Las genotecas son:
Genoteca sustractiva de cDNA de frutos picantes de chile
Genoteca sustractiva de cDNA de tejidos de pericarpio con carotenoides
Genoteca sustractiva de cDNA de tejidos de pericarpio con antocianinas
Genoteca sustractiva de cDNA de plantas de chile sometidas a estrés hídrico
Genoteca sustractiva de cDNA de plantas de chile sometidas a tratamiento con
celulasa.
Impactos
La colección de genes obtenidos e identificados en este proyecto constituye un
valioso recurso para la investigación básica y aplicada del chile en beneficio de
las comunidades productoras de chile del país.
Costos estimados de la aplicación de los resultados y/o tecnología generada
No se puede derivar costos, porque este proyecto constituye un avance
científico.
Ámbito de aplicación
Comunidad científica nacional.
Información adicional o comentario
Este es el primer análisis del transcriptoma basal de chile mexicano a nivel
internacional y el más completo a la fecha y constituye un gran avance en el
proceso de identificación de algunos genes de posible importancia
biotecnológica que podrían ser patentados.
Clave del proyecto: SAGARPA 2005-C01-11806
Sistema Producto y/o línea estratégica de atención: Sistema Producto Chile.
Investigador: doctor NEFTALÍ OCHOA ALEJO
Institución: Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del IPN
(Cinvestav-Unidad Irapuato)