Download metabolismo, nutrición y crecimiento bacteriano

METABOLISMO, NUTRICIÓN Y
CRECIMIENTO BACTERIANO
B.C. Rogelio D. González.
Introducción
• ¿Qué utilidad tiene conocer las condiciones que
un microorganismos requiere para crecer?
# Obtenerlo en el laboratorio
# Combatirlo o
evitar su proliferación
Cultivo
Introducción
• 80 % de agua
• 20 % de peso seco:
▫
▫
▫
▫
▫
▫
Proteínas
Ácidos Nucleicos
Polisacáridos
Lípidos
Peptidoglucano
Otros compuestos de peso molecular mas bajo
• Indudablemente es necesario que el ambiente en
el que se encuentren las células sea natural o
artificial, pueda brindarles esas sustancias y la
energía necesarias para que se produzcan las
reacciones.
Introducción
Biosíntesis: Ingreso de substancias para transformarse
en compuestos estructurales
FISIOLOGÍA BACTERIANA
• cómo los diferentes componentes
químicos y estructuras bacterianas se
interrelacionan tanto entre sí como con
el medio que las rodea para poder
sobrevivir y desarrollarse.
• La replicación de una bacteria implica:
metabolismo bacteriano
regulación y coordinación de los
procesos metabólicos
la división celular
Nutrientes
• Substancias necesarias para
asegurar supervivencia.
• Proveen energía y elementos
necesarios para síntesis de
estructuras celulares.
• Ingreso por absorción.
• Viabilidad: capacidad de
reproducción.
Nutrientes esenciales o Básicos
• Asimilables por simple difusión o por transporte
activo
• Agua
• Fuentes de Carbono
• Compuestos de nitrógeno
• Fósforo (fosfatos inorgánicos)
Factores:
• Factores de crecimientos o Factores
orgánicos: sustancias que las células no
pueden sintetizar y comprenden
vitaminas y algunos AA. Ej: vitaminas del
complejo B.
• Factor X (hemina) y Factor V (NAD) son
indispensables para H. influenzae
• Factores estimulantes: son los que
influyen en el proceso de crecimiento de
las bacterias, aunque no imprescindibles,
pero el proceso es más rápido y mejor en
presencia de ellos.
Otros nutrientes
• Iones potasio
• Iones Magnesio
• Factores de Crecimiento u orgánicos
▫ Vitaminas
▫ Aminoácidos
• Oligoelementos
▫ Hierro
▫ Cobre
▫ Cobalto
Factores Estimulantes
• Influyen en el proceso de crecimiento.
• No son imprescindibles.
• En presencia de factores estimulantes crecen
mas rápido y mejor.
Metabolismo bacteriano:
es la suma de todas las
reacciones químicas que tienen lugar en la célula, pueden
dividirse en catabolismo y anabolismo
• En el catabolismo se reduce la
complejidad de las moléculas y se libera
energía libre.
• En el anabolismo se requiere el uso de
energía libre para aumentar la
complejidad de las moléculas (son
reacciones de biosíntesis)
▫ Las bacterias, llevan a cabo todos los procesos
metabólicos gracias a las enzimas.
Reacciones anabólicas y catabólicas
Enzimas
Catalizadores orgánicos que aceleran las
reacciones químicas por su presencia,
controlados genéticamente
Actúan sobre un sustrato
Reciben su nombre por el sustrato sobre el que
actúan (Lipasa = actúa sobre lípidos)
Enzimas de la respiración : deshidrogenasas y
oxidasas
Proteínas de gran tamaño
Proteínas mas fracción no proteica (cofactor)
Enzimas :
son catalizadores orgánicos que
actúan por presencia
y aceleran la reacción.
• Son específicas dadas que actúan sobre un
sustrato, reciben el nombre de ese sustrato más
terminación ASA.
Enzima
• Holoenzima: proteína (apoenzima) mas cofactor
• Coenzima : el cofactor es ion metalico o
molecula orgánica compleja
• Grupo prostetico: cofactor unido fuertemente a
apoenzima
• Constitutivas: preformadas en la célula
• Inducibles o adaptativas: se forma en
condiciones ambientales especiales o en
presencia de sustratos apropiados
Enzimas
• Endoenzimas: biosintesis para formar
macromoléculas (Anabolismo)
• Mecanismos de Represión
• Vías anfibólicas: los productos generados en la
degradación de un elemento se aprovechan en la
síntesis de otros
Enzimas
• Exoenzimas de tipo hidrolítico: unión de agua a
macromoléculas, unidades pequeñas (bloques
estructurales.
• Facilitan penetración pasiva, facilitada o activa
a través de pared y membrana
• Para ingreso activo: actividad de permeasas
Enzimas
Transporte de nutrientes:
Estos ingresan en las células por absorción, no por
ingestión.
• Los nutrientes deben ser
transportados dentro de la célula en
una forma soluble.
• La velocidad del transporte sigue la
cinética descripta por MichaelisMenten (ecuación para las reacciones
enzimáticas).
•
Las bacterias pueden usar 4 tipos
diferentes de transporte de los
sustratos:
1. difusión facilitada
1. transporte activo
2. translocación de sustratos
3. difusión pasiva
Categorías nutritivas:
• Según la fuente de Carbono son
autótrofas o litótrofas (CO2) y en el otro
grupo heterótrofas u organótrofas (C
orgánico).
• De acuerdo con el origen de la Energía
son fotótrofas (captan la luz o Energía
radiante) y quimiótrofas (obtienen
energía a partir de reacciones químicas,
del ATP)
Combinando estas dos situaciones, fuente de C y de
Energía se pueden categorizar según sus
requerimientos nutritivos en:
• FOTOAUTÓTROFOS: requieren luz para su energía
(fotosintéticos) y CO2.
• FOTOHETERÓTROFOS: Energía lumínica, pero
incorporan C orgánico (alcoholes, ácidos grasos e
hidratos de C)
• QUIMIOAUTÓTROFOS: Energía de reacciones
químicas, pero incorporan C a partir del CO2.
• QUIMIOHETERÓTROFOS: Casi todos los
microorganismos patógenos para el ser humano.
Energía por reacciones químicas, el C proviene de
compuestos orgánicos (glucosa es el más utilizado)
Categorías Nutritivas
Producción de energía
• La glucosa es una molécula reducida; que
durante la oxidación celular se libera energía.
• La energía liberada puede ser captada para
formar ATP.
• Las vías metabólicas de producción de energía
son una serie de reacciones químicas catalizadas
por enzimas que permiten el almacenamiento de
energía en moléculas orgánicas y la liberación de
energía desde estas moléculas
Vías metabólicas mas conocidas
• Glucólisis
Como consecuencia del metabolismo hay producción de toxinas,
vitaminas, antibióticos, compuestos de interés industrial
(alcoholes)
Catabolismo de hidratos de carbono
• La mayor parte de la energía de una célula
deriva de la oxidación de los hidratos de
carbono.
• Los dos tipos principales son la respiración
celular y la fermentación.
Respiración celular aerobia y
anaerobia
• En los procariontes aeróbicos la oxidación
completa de una molécula de glucosa mediante
la glucólisis, el ciclo de Krebs y la cadena
transportadora de electrones.
• En la respiración anaerobia los aceptores finales
comprenden NO3- SO4-2 Y CO3-2
FERMENTACIÓN
• Libera energía a partir de azúcares u otras
moléculas orgánicas por oxidación.
• No necesita O2
• Se forma ácido láctico o etanol
Vías metabólicas mas conocidas
Catabolismo de lípidos y proteínas
• Las lipasas hidrolizan lípidos para formar
glicerol y ácidos grasos
• Para poder ser catabolizados los aminoácidos se
deben convertir en distintos compuestos que
ingresen en el cíclo de Krebs.
Pruebas de bioquímicas de
identificación
• Se utilizan con frecuencia para la identificar
bacterias y levaduras porque las diferentes
especies producen distintas enzimas.
• Ej Enzimas catalizadoras de aminoácidos,
pruebas de fermentación
Requerimientos para el crecimiento
• Requerimientos físicos
Temperatura
pH
Presión osmótica
Requerimientos químicos
Nutrientes
Factores de crecimiento
Efecto de la Temperatura
• Temperatura mínima de crecimiento
• Temperatura óptima de crecimiento
• Temperatura máxima de crecimiento
Sicrófilos
•
•
•
•
Requieren bajas temperaturas
15 – 20 ºC
La mínima puede ser muy baja
Bacterias en el fondo del mar y en los polos
Mesófilos
• Rango de temperaturas: 25 – 40 ºC
• Temperatura óptima: 37 ºC ± 1 ºC
• Agentes que afectan al hombre y los animales
Termófilos
• Toleran altas temperaturas
• Temperatura óptima: 55 ºC
• Temperatura máxima: 80 ºC o mas.
Condiciones de pH
•
•
•
•
pH : Potencial Hidrógeno. Va desde 0 a 14.
pH < 6,5 ácido
pH > 7,5 básico o alcalino
pH 6,5 – 7,5 neutro Mas adecuado para
crecimiento bacteriano
• Bacterias que crecen hasta pH 4 Acidófilas (Por
ejemplo: Lactobacillus)
• Vibrio cholerae : medio alcalino
Presión Osmótica
Los solutos (sales y azúcares) disueltos se
desplazan a zonas de menor concentración. El
agua se desplaza a zonas de mayor
concentración de solutos
Una presión osmótica alta causa pérdida de
agua y plasmólisis de la célula
Halófilas: bacterias que toleran altas
concentraciones salinas
Halófilas facultativas : toleran hasta un 2 % de
sales
Condiciones atmósféricas
• Potencial de óxido-reducción o Redox (Eh)
• Respiración bacteriana : reacciones de óxidoreducción, en cadena
• El aceptor final de electrones o hidrogeniones es
variable
Aerobios
• Requieren oxígeno, aceptor final de hidrógeno
• Formación de H2O y CO2
• Producción de enzima Catalasa :
desdoblamiento del Peróxido de hidrógeno
(H2O2) en H2O y oxígeno
• Prueba de Catalasa para diferenciar
microroganismos (Staphylococcus de
Streptococcus)
Anaerobios
• Viven en ausencia de oxígeno atmosférico
• Aceptor final : compuesto inorgánico (NO3 o
SO4)
• Fermentación: la fuente de carbono provee
energía, el donador de hidrógeno y el aceptor
final (un compuesto orgánico como ácidos o
alcoholes)
• Muy frecuente en microorganismos orales
Anaerobios
• Anaerobios obligados: no utilizan O2
• Anaerobios moderados: toleran de un 2 a un 8
% de O2
• Anaerobios aerotolerantes: sobreviven un
tiempo en presencia de O2
• Anaerobios facultativos: aceptan
indistintintamente una situación u otra
Microaerófilos
Requieren bajas concentraciones de O2 para
crecer
Utilizan el O2 como fuente de energía pero a
concentraciones < 15 %
Susceptibles a radicales superóxido
Enzima Superóxido Dismutasa (SOD) :
transforma radicales superóxido en H2O2
Capnofilas: desarrollan mejor con
concentraciones de CO2 elevadas
Medios de Cultivo
Substancias nutritivas que permiten el desarrollo de
microorganismos en el laboratorio
Cultivo: brindar condiciones óptimas de crecimiento
Fáciles de preparar
Baratos
Permitir el desarrollo de gran variedad de gérmenes
Aportar nutrientes adecuados (aminoacidos,
nucleótidos, factores de crecimiento, glucosa, iones
inorganicos)
Medios de Cultivo
•
•
•
•
Optimo contenido de H2O y correcto pH
Requerimientos de O2
Estéril, evitar contaminaciones
Incubación: temperatura óptima en estufas
Medios de cultivo químicamente
definidos
• Es uno de los cuales se conoce la composición
química exacta.
• Suelen reservarse para el trabajo experimental o
para el crecimiento de bacterias autótrofas
Medios complejos
• Se cultivan de modo sistemático a las bacterias
heterótrofas y los hongos en los medios de
cultivo complejos
• Agar nutritivo
• Caldo nutritivo
Clasificación de los medios de cultivo
Naturales: solo usados para enriquecer
medios (leche, suero, papa)
Artificiales se preparan en el laboratorio
Líquidos: caldos
Sólidos: caldos adicionados de
substancias capaces de solidificar (Agaragar)
Medios Complejos: extractos de carne,
levadura, peptonas.
Medios Enriquecidos: agregado de suero
o sangre
Clasificación de los medios de cultivo
• Medios selectivos: permiten crecer un solo tipo de
microorganismo (substancias inhibidoras)
• Medios diferenciales o indicadores: evidencia
alguna actividad metabólica por cambio de estado o
color propia de un tipo determinado de
microorganismo
• Medios de Transporte: traslado de muestras
biológicas manteniendo las bacterias viables
• Medios de enriquecimiento: proporciona nutrientes
y condiciones ambientales para favorecer el
desarrollo de un microbio particular pero no el de
otros.
Crecimiento Bacteriano
Aumento de número (no
de tamaño)
Multiplicación bacteriana:
fisión simple o binaria
Elongación
Auto duplicación de ADN
cromosómico
Tabicado central
Invaginación membrana
celular
Síntesis de pared
Tiempo de generación
•
•
•
•
Tiempo necesario para la duplicación celular
Distintiva de cada especie
Puede influirse por factores estimulantes
Varían de 20 minutos (Escherichia coli) hasta
24 horas
Curva de Crecimiento Bacteriano
•Bacteria en medio adecuado
•Gráfico de coordenadas:
número de bacterias
(logaritmo) versus lapso de
tiempo.
•Distinta para cada bacteria
•En todas se identifican
cuatro etapas
Fase de Latencia
•
•
•
•
El número de microorganismos no varía
Adaptación al medio, producción de enzimas
Tiempo variable: entre una hora a días.
Tamaño relativo aumentado por división
Fase exponencial o de crecimiento
logarítmico
• Relación casi lineal entre el
tiempo y el número de elementos.
• Actividad metabólica
incrementada
• Depende del tiempo de
generación de cada bacteria
• Los antimicrobianos son mas
activos
• Puede haber variaciones entre el
crecimiento in vitro e in vivo.
Fase Estacionaria
En determinado punto el crecimiento disminuye
La población no aumenta
Células nuevas reemplazan a las células muertas
Actividad metabólica mas lenta
Células en animación suspendida
Producción de metabolitos secundarios
Antibioticos
Toxinas
Fase de Esporogenesis
para las especies productoras
de esporas
Fase de declinación o muerte
• Recuento de células disminuye sensiblemente
• El numero de células muertas supera al número
de células vivas
• Acumulación de productos tóxicos
• Disminución de nutrientes
• Aparición rápida : autolimitar diseminación
infecciones
Técnicas para determinar el número y
viabilidad de las células
• Contar al microscopio el
número de células en un
volumen conocido
• Establecer el número de
células por turbidimetria
• Recuento de elementos
viables por cultivo (Unidad
Formadora de Colonias o
UFC)
Recuento en placa
Diluciones seriadas
Placa vertida
Diseminación en placas
CONTEO DE CÉLULAS
VIABLES
MÉTODO DE EXTENDIDO EN PLACA
• Es el método de elección para anaerobios facultativos y
cultivo de microaerófilos.
CONTEO DE CÉLULAS
VIABLES
MÉTODO DE VERTIDO EN PLACA.
• Esta técnica se usa generalmente para bacterias aerobias
obligatorias.
CONTEO DE CÉLULAS VIABLES
• Útil para la técnica de
vertido
en
placa
o
extensión en placa.
• Se siembran volúmenes
conocidos de cada dilución
• Luego se incuba a 35 – 37
0C
durante 24 – 48 horas.
Otros métodos Directos
• Filtración
• Método del número más probable
• Recuento microscópico directo
Métodos indirectos
• Turbidimetría
• Actividad metabólica
• Peso seco
Gracias…………………