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(Biología 2º bach. Logse) Clonación de la insulina humana pág 1 /2 CLONACIÓN DEL GEN DE LA INSULINA HUMANA EN BACTERIAS ROTURA POR ÓSMOSIS, CRIOFRACTURACIÓN.. ... (DNA insulina monocatenárico) Ribosomas, enzimas, DNA, RNAm (insulina)...etc ULTRACENTRIFUGACIÓN Y SEPARACIÓN POR Pm Y FORMA Transcriptasa inversa vírica + precursores del DNA RNAm insulina maduro (sin intrones) DNA polimerasa A) Preparación del plásmido bacteriano con “extremos pegajosos” o “ganchos” (DNA insulina humana bicatenárico) Enzima de restricción bacteriano específico (Plásmido cortado con extremos “pegajosos”) (Biología 2º bach. Logse) Clonación de la insulina humana pág 2 /2 B) Preparación del gen a insertar con extremos pegajosos complementarios (adición de eslabones y “corte”) DNA ligasa + (DNA de insulina con extremos “pegajosos”) (El mismo enzima de restricción bacteriano usado para el plásmido) DNA ligasa C) Unión del gen al plásmido por los extremos pegajosos. + Gen insulina con ganchos pegajosos Plásmido abierto con ganchos pegajosos complementarios D) Búsqueda y clonación de la bacteria “transformada”. Sin plásmidos: mueren ante tetraciclina y ampicilina Con plásmidos sin el gen: sobreviven ante tetraciclina y ampicilina Con plásmidos con gen de la insulina insertado: sobreviven ante ampicilina y mueren ante tetraciclina ADICIÓN DE PLÁSMIDOS A CULTIVO BACTERIANO Y “TRANSFORMACIÓN” TECNICA DE “RÉPLICA DE PLACAS” Y USO DE ANTICUERPOS RADIOACTIVOS DE LA INSULINA