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Química Biológica 2110. Microbiología y Técnico de Laboratorio. Año 2008.
Trabajo Práctico N° 9: Estudios Cinéticos de Fosfatasa Acida de P. fluorescens C:
Determinación de los parámetros Km y Vmax.
SE DEBE TRAER PAPEL MILIMETRADO
Objetivos:
 Adquirir destreza en la determinación práctica de parámetros cinéticos.
 Adquirir destreza en el manejo de diferentes ecuaciones para determinar dichos parámetros.
Introducción:
La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas. Estos
estudios proporcionan información directa acerca del mecanismo de reacción catalítica, de la
especificidad de la enzima y varios parámetros que caracterizan las propiedades físico-químicas de
la enzima. Las aplicaciones prácticas de la cinética enzimática son muy amplias, pueden emplearse
rutinariamente en los laboratorios clínicos ya que una velocidad enzimática anormal puede dar una
pista sobre una patología determinada. Por otra parte, los ensayos cinéticos permiten estudiar una
ruta metabólica.
Los estudios cinéticos se realizan siempre midiendo velocidades iniciales. Esto es de suma
importancia porque de no ser así, a medida que transcurra la reacción, el sustrato se irá
consumiendo e irá aumentando el producto con lo cual podría variar el pH afectando la estructura
de la enzima, o podrá cobrar mayor importancia la reacción inversa. Es decir que pueden cambiar
con el tiempo las condiciones iniciales de pH, concentración de enzima y sustrato.
Los parámetros que caracterizan las propiedades de una enzima son la constante de afinidad o
constante de Michaelis (Km) y velocidad máxima (Vmax). Km es la concentración de sustrato a la
cual la velocidad alcanzada por la enzima es la mitad de la Vmax y es una medida de la afinidad de
la enzima por un sustrato. De acuerdo a esto, si el Km es pequeño, la afinidad es grande; por el
contrario, si el Km es grande, la afinidad de la enzima por el sustrato es menor. Cuando la
concentración de sustrato es baja, la actividad enzimática crece en forma proporcional a la
concentración de sustrato ([S]). A medida que [S] aumenta, los incrementos de velocidad son cada
vez menores y se llega a una situación en la cual la actividad no aumenta por más que aumente [S],
en este punto se ha llegado a la Vmax de la reacción. Esto se puede expresar por la ecuación de
Michaelis-Menten;
Vmax . [S]
V =
Km + [S]
Si se mide la velocidad de una reacción enzimática variando la concentración de sustrato y
trabajando en condiciones óptimas de pH, temperatura, fuerza iónica y con una concentración
definida de enzima, la velocidad enzimática dependerá sólo de la concentración de sustrato. Así se
podrá determinar experimentalmente la Vmax y Km. Para ello se utilizará la ecuación de
Lineweaber-Burk, derivada de la de Michaelis-Menten, la cual corresponde a una recta.
1
Km
=
V
1
*
Vmax
1
+
S
Vmax
1
Técnica:
En este TP se estudiará la actividad AcPasa presente en el espacio periplásmico de Pseudomonas
fluorescens. Para medir esta actividad se utilizará el sustrato artificial p-nitrofenil fosfato (p-NPP)
incoloro, que es hidrolizado por la enzima a fosfato y p-nitrofenol (p-NP) el cual es amarillo en
medio alcalino. El grado de hidrólisis puede ser determinado por la intensidad del color amarillo
midiendo la DO a 410 nm, tal como se realizó en el T.P. anteriores.
AcPase
+
2+
Mg
p-NPP
(incoloro)
PO43 -
p-NP
(amarillo)
En el T.P se realizará una curva de saturación por sustrato p-NPP, y se determinaran los
parámetros cinéticos Km y Vmax.
El sustrato p-NPP se hidroliza espontáneamente es decir que a medida que transcurra el tiempo, se
genera algo de p-NP y por lo tanto color amarillo, aun en ausencia de la enzima. En el caso de las
curvas de sustrato, donde cada tubo tiene una concentración de sustrato diferente, se debe hacer un
blanco para cada concentración de sustrato. Es decir que si para la curva se harán 7
determinaciones, se deben hacer en paralelo 7 blancos. Por razones de tiempo y costos, estos
blancos no se harán en el T. P., sino que serán dados como dato.
2

Curva de sustrato p-NPP
[p-NPP]
0 mM
0.25mM
0.5 mM
1 mM
2 mM
5 mM
10 mM
Buffer AcH/AcNa
pH 5
250 l
250 l
250 l
250 l
250 l
250 l
250 l
MgCl2 35 mM
30 l
30 l
30 l
30 l
30 l
30 l
30 l
-
200l (1)
200l (2)
200l (3)
200l (4)
200l (5)
200l (6)
Muestra
10 l
10 l
10 l
10 l
10 l
10 l
10 l
H2 O
210 l
10 l
10 l
10 l
10 l
10 l
10 l
0
0.003
0.005
0.01
0.02
0.04
0.08
Solución
p-NPP
DO observada
DO blanco
DO corregida
Soluciones madres de sustrato:
1- p-NPP 0.625 mM
2- p-NPP 1.25 mM
3- p-NPP 2.5 mM
4- p-NPP 5 mM
5- p-NPP 12.5 mM
6- p-NPP 25 mM
Graficar los valores obtenidos según la ecuación de Michaellis-Menten y Lineweaber-Burk (o Hanes o Eadie-Hofstee según prefiera) y determinar Km
y Vmax.