Download Biorremediación de agroquímicos TP2016

BIORREMEDIACIÓN DE
AGROQUÍMICOS
“GLIFOSATO”
Valeria Saade
Carolina Santos Vega
Naiara Klopertanz
¿Qué es el Glifosato?
➔El Glifosato(N-(fosfonometil) glicina) es un compuesto orgánico, soluble en agua.
➔Es utilizado como herbicida no selectivo de amplio espectro.
➔Es muy estable y difícil de degradar.
➔Uno de los herbicidas más utilizados es el Roundup, producido por Monsanto,
aplicado en cultivos transgénicos.
➔La normativa argentina establece un límite máximo de glifosato en aguas de
bebida de 0,3 mg/L.
El Glifosato es nocivo para la salud debido a su efecto gravemente
tóxico sobre las células de los humanos causando alteraciones
genéticas.
Puede generar: autismo, enfermedad inflamatoria del intestino,
diarrea crónica, colitis y enfermedad de Crohn, obesidad,
enfermedad cardiovascular, depresión, Cáncer, Alzheimer,
enfermedad de Parkinson, diabetes, entre otros.
https://www.youtube.com/watch?v=1vMzBOXqMRs
https://www.youtube.com/watch?v=gT0pjKNEHuM
https://www.youtube.com/watch?v=S2h70KGPe7E
La contaminación de aguas subterráneas con glifosato resulta poco
probable, excepto en el caso de un derrame apreciable o de otra
liberación accidental o descontrolada. En aguas superficiales, la
sustancia puede encontrarse cuando se aplica cerca de los cuerpos
de agua, por efecto de la deriva o a través de la escorrentía.
Consumo de glifosato y
del total de productos
fitosanitarios utilizados en
las provincias, según el
tipo de cultivo y actividad.
Argentina, 2007.
¿Qué es la biorremediación?
“Es la utilización de bacterias como medio de solución para la
descontaminación de suelos y aguas.”
Ventajas
➔Técnica segura y económica;
➔Los contaminantes son transformados y algunos llegan a la mineralización
produciendo CO2 y H2O;
➔Se utilizan microorganismos autóctonos y exógenos;
➔El suelo saneado no requiere un confinamiento posterior.
Desventajas:
➔ Los microorganismos pueden inhibirse por la presencia de altas concentraciones de
contaminantes;
➔Requiere de largos períodos de tiempo.
Características generales del grupo de Pseudomonas
➔ Los grupos de las Pseudomonas está constituido por microorganismos Gramnegativos, siempre móviles con flagelación polar.
➔ Se encuentran normalmente en el suelo, aunque pueden ser patógenos oportunistas
en animales (Ps. aeruginosa) y patógenos de plantas (Ps. syringae).
➔ Su metabolismo es siempre respiratorio, o bien aerobio o anaerobio.
➔ Presentan una versatilidad metabólica muy grande que se traduce en su capacidad de
utilizar como fuente de carbono substratos muy variados. Por otra parte, hay algunos
individuos del grupo que son quimiolitotrofos usando H2 o CO como donadores de
electrones.
➔Algunas Pseudomonas (p.ej. Ps. aeruginosa) son capaces de llevar a cabo
procesos de desnitrificación con lo que se empobrecen los suelos de
nitrógeno utilizable desde el punto de vista agrícola.
➔Las bacterias del género Pseudomonas, que actúan como digestores
aerobios de materiales animales y vegetales, lo que contribuye al reciclaje
biológico de materia orgánica.
➔Algunas bacterias de este grupo producen pigmentos fluorescentes de
colores amarillo-verdosos fácilmente solubles en agua.
TOLERANCIA Y DEGRADACIÓN DEL GLIFOSATO POR BACTERIAS
AISLADAS DE SUELOS CON APLICACIONES FRECUENTES DE
ROUNDUP SL®
Esta investigación evaluó la degradación del glifosato, la
resistencia bacteriana a diferentes concentraciones de
este compuesto y la afinidad por compuestos hidrofílicos
o hidrofóbicos de bacterias aisladas de suelos donde se
emplea comúnmente el herbicida Roundup SL®. De estas
bacterias por turbidimetría se escogieron: Pseudomonas
aeruginosa, P. fluorescens, Burkolderia gladioli y
Flavimonas oryzihabitans.
INTRODUCCIÓN
En el suelo, el glifosato es absorbido por los minerales de arcillas y materia orgánica,
compitiendo con el fósforo por sus sitios de unión. Este compuesto es degradado por
microorganismos edáficos en dependencia del tipo de suelo, concentración de
nutrientes, pH, temperatura y humedad.
Los microorganismos, especialmente las bacterias, son capaces de catabolizar
compuestos organofosforados, los cuales utilizan como fuente de carbono, nitrógeno y
fósforo. Las bacterias degradan el glifosato por dos vías, produciendo como
intermediarios glicina o ácido aminometilfosfónico.
MATERIALES Y MÉTODOS
ZONA DE MUESTREO, al norte del Municipio
de Facatativa (Cundinamarca, Colombia), en la
zona San Rafael bajo.
TOMA DE MUESTRAS, recolectaron cinco submuestras cada 200 m2, para un total de 30
muestras compuestas.
CULTIVO, AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN
Medios de cultivo: Para el pre-enriquecimiento se utilizaron tres medios líquidos con glifosato al 1 %, como única
fuente de carbono (G1, G2 y G3). Los tres medios variaron en su fuente de nitrógeno, nitrato de amonio, cloruro de
amonio o extracto de levadura, otros componentes de los tres medios fueron cloruro de sodio, sulfato de
magnesio y fosfato de potasio. Adicionalmente el medio G3 contenía biotina y piridoxina.
Métodos de Cultivo y aislamiento: Las muestras de suelo fueron llevadas a preenriquecimiento en 45 mL de los
medios líquidos G1, G2 y G3 y se incubaron por un periodo de 10 días a una temperatura de 17 º C. Luego se
realizaron repiques a los medios sólidos para aislamiento de los microorganismos. Se sembraron en agar nutritivo,
realizando nuevamente coloración de Gram para asegurar la pureza de los aislamientos.
Identificación: Se utilizaron pruebas bioquímicas convencionales para bacterias Gramnegativas fermentadoras y
no fermentadoras. Los resultados se confirmaron mediante el sistema comercial de identificación microbiana BD
BBL Crystal Enteric/Nonfermenter ID.
MÉTODOS ANALÍTICOS
Prueba turbidimétrica y curva de crecimiento bacteriano: Las cepas puras fueron sembradas en medio líquido G3
a partir de agar nutritivo. El desarrollo bacteriano fue medido por espectrofotómetro a 660 nm escogiendo las
cuatro mejores bacterias en cuanto a crecimiento y se les realizó curvas de crecimiento cada 24 h hasta 264 h.
Antagonismo: Esta prueba se realizó con el fin de evaluar si las cepas escogidas presentaban o no inhibición de
crecimiento.
Toxicidad: A partir de una concentración inicial de glifosato 48 % m/v se realizaron las siguientes concentraciones:
0,25, 0,48, 2, 10, 15, 20, 30 y 40 %. Las bacterias puras y en consorcios, fueron inoculadas en estas concentraciones
por un tiempo de 72 horas, realizando recuentos en placa sobre agar nutritivo.
Medida de hidrofobicidad: Esta prueba utilizó el método de adherencia al poliestireno por tinción con el colorante
violeta de genciana para determinar el grado de afinidad de las bacterias por compuestos hidrofílicos o
hidrofóbicos
Cromatografía: La biodegradación del glifosato por las bacterias escogidas y sus mezclas se analizaron por
cromatografía de papel y como solvente se utilizó agua/metanol 2:3 v/v.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Cultivo, aislamiento e identificación
Se aislaron cinco géneros bacterianos que utilizaron el glifosato como única fuente de
carbono, predominando Pseudomonas spp. con un 42, 9 %: P. cichorii, P. aeruginosa, P.
fluorescens, P. stutzeri y P. vesicularis.
“Se comprobó que el glifosato es mejor fuente de fósforo que de
carbono”.
Métodos analíticos
Prueba turbidimétrica y curva de crecimiento bacteriano: La fase de adaptación al
herbicida fue más larga en F. oryzihabitans y B. gladioli con un promedio de 72 horas;
mientras que en P. aeruginosa y P fluorescens, la duración fue de 48 y 12 h
respectivamente.
Estos resultados sugieren que estas bacterias posiblemente se adaptaron y utilizaron más
fácilmente al glifosato como única fuente de carbono y concuerda con los crecimientos
celulares presentados por P. putida en un medio de cultivo similar con una fase de
adaptación (lag) de aproximadamente 8 horas y P. fluorescens con una fase lag de
aproximadamente 12 horas con 2,5% de glifosato.
Curvas de crecimiento de las bacterias escogidas en medio líquido con glifosato al 1% y extracto de levadura como fuentes de carbono
y nitrógeno.
Antagonismo: Al enfrentar la bacteria P. aeruginosa con B. gladioli se presentó un halo de inhibición de 0,4 cm
y con F. oryzihabitans 0,45 cm. Al mismo tiempo, al enfrentar B. gladioli con P. aeruginosa se observó la presencia
de un halo de 0,3 cm. En el caso de la bacteria F. oryzihabitans al enfrentarse con P. aeruginosa mostró un halo de
inhibición de 0,4 cm. Tomando como referencia estos resultados se pudieron realizar las siguientes mezclas: F.
oryzihabitans + P. fluorescens + B. gladioli y P. fluorescens + P. aeruginosa.
Esta prueba por lo tanto dio lugar a la formación de dos consorcios para realizar las
cromatografías y las pruebas de toxicidad.
Toxicidad: Todas las bacterias arrojaron patrones diferentes de resistencia al compuesto con crecimientos en
los medios que contenían hasta un 10 % de glifosato. Los consorcios mostraron una mejor resistencia con
crecimientos hasta 20 o 30 % del herbicida. La importancia funcional de las asociaciones en consorcios se
demuestra por la capacidad de resistencia a altas dosis de sustancias químicas, donde los microorganismos que
conforman el consorcio actúan benéficamente entre sí para tolerar diferentes concentraciones de los compuestos
y metabolizarlos, lo cual podría ser la explicación de la resistencia de los dos consorcios bacterianos evaluados en
esta investigación.
Medida de hidrofobicidad: Las bacterias estudiadas prefieren compuestos hidrofílicos como lo es el
glifosato.
Cromatografía: Los procedimientos de cromatografía realizados con el revelador ninhidrina, dieron un valor
Rf de 0,63 para el glifosato (el máximo valor de Rf que se puede alcanzar es de 1, lo ideal es entre 0.55 y 0.7).
A las 264 horas se observan diferencias significativas en los porcentajes de degradación, siendo los mejores
tratamientos de acuerdo a la prueba de Rango Múltiple de Duncan P. fluorescens (59,2%), P. aeruginosa + P.
fluorescens (56,7%) y P. fluorescens + Flavimonas oryzihabitans + Burkholderia gladioli (51,9%).
ANÁLISIS
En estudios posteriores de biorremediación de este herbicida a altas
concentraciones, sería aconsejable ensayar los consorcios bacterianos ya que
crecieron con concentraciones de glifosato de 20 y 30 %, mientras que P.
fluorescens sólo tolero un 2 % del compuesto; demostrando la existencia de
sinergismo entre las bacterias para potenciar su acción degradadora. En
biorremediación se busca que el crecimiento bacteriano se obtenga en menor
tiempo y que alcance un porcentaje de degradación alto.
CONCLUSIÓN
El papel de las bacterias edáficas en la degradación, tolerancia y afinidad al
glifosato en suelos con uso frecuente del herbicida Roundup ® SL se comprobó
en esta investigación donde los microorganismos utilizaron el glifosato como
única fuente de carbono y actuaron sinérgicamente para resistir hasta un 30 %
del herbicida resultando promisorio su uso en programas de biorremediación.