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Cinética
enzimática
Serie Resuelta
1.- Con base en la ecuación de Michaelis-Menten contesta las siguientes preguntas:
a) ¿A qué concentración de sustrato podrá una enzima operar a un cuarto de su
velocidad máxima (1/4 Vmax), si cuenta con una kcat de 30.0 s-1 y una KM de 0.0050
M?
V0= ¼ Vmax
KM= 0.0050 M
Vmax
4
=
[S]=
V0 =
Vmax[S]
Vmax[S]
KM +[S]
0.005 M+[S]=
0.005 M+[S]
4Vmax[S]
Vmax
0.005 M=4[S]−[S]
0.005 M=3[S]
0.005 M
[S]= 1.67 x 10−3 M
3
b) Determine la fracción de Vmax que se obtendría con las siguientes concentraciones
de sustrato [S]: 2 KM y 10 KM.
V0 =
Vmax[S]
KM +[S]
V0 =
Vmax [2KM ]
KM +[2KM ]
V0 =
2Vmax [KM ]
3KM
2
V0 = Vmax
3
V0 =
Vmax [10KM ]
KM +[10KM ]
V0 =
10Vmax [KM ]
11KM
V0 =
10
V
11 max
2.- Una enzima que cataliza la reacción X→Y se aisló de dos especies bacterianas
diferentes. Ambas enzimas tienen la misma Vmax pero diferentes valores de KM para
el sustrato. La enzima A tiene una KM de 2.0 μM, mientras que la enzima B tiene una
KM de 0.5 μM. El gráfico representa las cinéticas de reacción llevadas a cabo con la
misma concentración de cada enzima y con [X]= 1 μM. ¿Qué curva representa a la
enzima A y cuál a la enzima B?
A KM= 2.0 μM
B KM= 0.5 μM
B
A
La enzima A tiene una KM más grande que B , lo que quiere decir que requiere una
[S] mayor para llegar a la mitad de la Vmax y a la saturación.
3.- Se midió la actividad de LDH de 25 mL de un extracto que tiene una
concentración de 4.5 mg/mL. Se utilizaron 10 μL de una dilución 2:350. El medio de
ensayo incluyo piruvato, amortiguador a pH 7.0 y NADH, para un volumen final
con todo y enzima de 800 µL. El coeficiente de absorbitividad molar del NADH es
6220 M-1cm-1. Usando los siguientes datos calcula la actividad específica de la enzima
en Unidades internacionales.
Curva temporal de actividad de LDH
1.2
m (min-1)
0.2177
0.8
Vol Rx (mL)
0.8000
0.6
Vol enzima (mL)
0.0100
Factor de Dilución
175.0000
Act vol (mmol/min/mL)
0.4900
Abs340 nm
1
0.4
y = -0.2177x + 1.2041
R² = 0.9966
0.2
0
0
1
2
3
Tiempo (min)
Act vol
Vol (mL)
(mmol/min/mL)
0.4900
25.0000
4
5
Prot
(mg/mL)
Proteína (mg)
Act total
(mmol/min)
Act específica
(mmol/min/mg)
4.5000
112.5000
12.2500
0.1089
4.- Completa la tabla de purificación.
Paso
EC
SA
CII
FG
(1)
(2)
(3)
(4)
Actividad
Volumen (ml)
Total (U)
500
100
45
50
3,000
2,400
1,440
1,000
Proteína
total (mg)
15,000
4,000
500
125
Actividad Enriquecimi
Veces
específica
ento
purificación
(U/mg)
(%)
0.2
100
1
0.6
80
3
2.88
48
14.4
8
33
40
Pasos: (1) Extracto Crudo; (2) fraccionamiento con sulfato de amonio; (3) Cromatografía de intercambio iónico; (4) Filtración
en gel.
a) ¿Cuál fue el mejor paso de la purificación?
5.- De acuerdo a la siguiente tabla predice cuál es la enzima con la mayor afinidad
por su sustrato.
Enzima
Anhidrasa carbónica
Crotonasa
Triosa fosfato isomerasa
β-Lactamasa
kcat/KM (s-1M-1)
8.3 × 107
2.8 × 108
2.4 × 108
1 × 108
6.- Se determinó la representación de dobles recíprocos para una reacción de un solo
sustrato catalizada por la enzima Succinato deshidrogenasa a tres diferentes
concentraciones de enzima. ¿Cuál de las siguientes familias de curvas se podría
esperar? Explícalo.
La gráfica dos, puesto que el parámetro cinético que depende de la [E] es la Vmax, ya
que por definición Vmax=k2[Et], mientras que la KM no depende de esto.
Por ello, a tres diferentes [E] de una misma enzima, se podrían esperar tres diferentes
Vmax pero la misma KM.
-2
7.- Las prostaglandinas son una clase de eicosanoides, derivados de ácidos grasos con
una gran variedad de acciones extremadamente potentes en los tejidos de
vertebrados. Son responsables de la producción de fiebre, inflamación y dolor. Las
prostaglandinas se derivan del ácido araquidónico a través de una reacción
catalizada por la enzima prostaglandina endoperóxido sintasa. Esta enzima, una
cicloxigenasa, utiliza oxígeno para convertir el ácido araquidónico en PGG2, el
precursor inmediato de muchas prostaglandinas.
Prostaglandina Endoperóxido Sintasa
Sin I
0.07
0.05
y = 0.0116x + 0.0194
R² = 0.9999
0.04
0.03
0.02
0.01
0
-1
1
1
+
[S]
Vmax
y = 0.0203x + 0.0194
R² = 0.9993
0.06
1/V0 (min/mM)
Con I
1
KM
=
V0
Vmax
-0.01
-0.02
0
1
2
1/[S] (mM-1)
3
Sin I
Con I
m (min)
0.0116
0.0203
b (min/mM)
0.0194
0.0194
a (mM-1)
1.6693
0.9552
Vmax (mM/min)
51.6245
51.6325
KM (mM)
0.5991
1.0469
8.- Se midió la cinética de una enzima como función de la concentración de sustrato
en presencia y ausencia del inhibidor (I), a una concentración de 2 mM.
a) ¿Cuáles son los valores de Vmax y KM en ausencia del inhibidor? ¿Y en su presencia?
b) ¿De qué tipo de inhibición se trata?
Sin I
0.3
Con I
1
KM
=
V0
Vmax
1
1
+
[S]
Vmax
1/V0 (min/μM)
0.25
0.2
y = 0.6663x + 0.0222
R² = 1
0.15
0.1
0.05
y = 0.224x + 0.0224
R² = 0.9988
0
-0.2
-0.1
0
-0.05
0.1
0.2
0.3
1/[S] (mM-1)
0.4
Sin I
Con I
m (min)
0.2240
0.6663
b (min/μM)
0.0224
0.0222
a (μM-1)
0.1000
0.0333
Vmax (μM/min)
44.6322
45.1060
KM (μM)
9.9971
30.0560