Download (Bovinos y Caninos) mediante la técnica de Real

DIC1104_REDVET
Título: Utilización de la técnica de Real Time PCR aplicada al estudio de animales
intersexuados (bovinos y caninos).
[Real Time PCR technique applied to the study of intersexed animals (bovines and
canines)]
Palabras Clave: mamíferos, Intersexos, ADN
Resumen:
Las alteraciones reproductivas en animales domésticos, muchas veces se encuentran
asociadas a anomalías cromosómicas. En los últimos años, el estudio del complemento
cromosómico de los intersexos (ej. presencia de cromosoma sexual Y en animales con
aspecto de hembras) se complementó con el desarrollo de técnicas moleculares,
permitiendo la realización de diagnósticos más precisos. El objetivo de este trabajo, fue la
puesta a punto de la técnica de PCR en tiempo real para la detección de secuencias
específicas del cromosoma sexual Y. Para esto, se estudiaron dos bovinos hembras
Freemartin y un caso de intersexo en canino. Se utilizaron muestras de machos y
hembras normales como controles positivos y negativos respectivamente. El ADN fue
extraído a partir de sangre periférica por el metodo convencional de Fenol-Cloroformo.
Las muestras de ADN se analizaron para secuencias del gen SRY (canino) y una
secuencia específica repetida del cromosoma Y bovino (BRY4). La amplificación de las
secuencias en tiempo real se realizó utilizando termociclador Corbett y Kit Biotools
QuantyMix SYG. Se obtuvo una curva de fluorescencia característica para cada
secuencia, consistente con los controles positivos utilizados pudiéndose identificar
secuencias del cromosoma Y en los animales intersexuados (hembras freemartin y
canino). Se presenta una técnica rápida, sencilla y altamente específica para el
diagnóstico de secuencias del cromosoma Y en animales intersexuados.
Key Words: mammals, intersex, DNA
Abstract:
The reproductive disorders in domestic animals often are associated with chromosomal
abnormalities. In recent years, the study of chromosomal complement of intersexed
animals (ie. presence of Y sex chromosome in female-like animals) was supplemented
with the development of molecular techniques, allowing the realization of more precise
analysis. The objective of this work was the development of the technique of real-time
PCR to detect specific sequences of the Y sex chromosome. For this, we studied two
bovine freemartin females and one case of intersex in canine. Some specimens of normal
males and females as negative and positive controls respectively were used. The DNA
was extracted from peripheral blood by conventional phenol-chloroform technique. DNA
samples were analyzed for the SRY gene sequences (canine) and a repeated specific
sequence of the Y chromosome bovine (BRY4). The amplification of the sequences in real
time thermocycler was performed using Biotools QuantyMix Corbett and SYG Kit. A
characteristic fluorescence curve was obtained for each sequence, consistent with the
positive controls used, Y chromosome sequences were identified in intersexed animals
(female freemartin and canine). It is shown a fast, simple and highly specific for the
diagnosis of Y chromosome sequences in intersexed animals.
Introducción:
Las anomalías en el desarrollo sexual de los animales domésticos se conocen desde
hace mucho tiempo, siendo el síndrome de freemartin en bovinos (feto genéticamente
hembra masculinizado en presencia de un gemelo no idéntico macho) una de las
alteraciones del sistema reproductor mejor estudiadas (Meinecke et al. 2006)
Los animales intersexuados se caracterizan por presentar desarrollo genital incompleto o
ambiguo (Short, 1969). Las anomalías genitales varían de una especie a otra y dependen
de la alteración que dio origen al intersexo.
La base de las anomalías del desarrollo sexual, muchas veces responde a alteraciones a
nivel cromosómico, siendo la presencia de líneas celulares portadoras del cromosoma Y o
de secuencias específicas de este (como el gen SRY) una de las causas.
Varios métodos han sido desarrollados para diagnosticar el origen de estas patologías,
siendo el estudio del complemento cromosómico (ej. Identificación del cromosoma Y) el
más frecuente. En los últimos años, el desarrollo de técnicas moleculares como la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la detección de secuencias específicas
de ADN del cromosoma Y (Padula, 2005), ha permitido optimizar los diagnósticos, en un
enfoque muchas veces complementario al análisis citogenético.
Recientemente, la técnica de PCR en tiempo real constituye un valioso recurso aún poco
explorado para el diagnóstico de este tipo de patologías. Meinecke et al. (2004) utiliza la
técnica de real time PCR, en un novedoso protocolo para el diagnóstico en bovino de un
caso 60XX/90XXY, constituyendo hasta la actualidad el primer reporte de esta técnica
para el diagnóstico de intersexos en animales domésticos.
La técnica de PCR en tiempo real se caracteriza por ser altamente sensible y específica,
permitiendo identificar fragmentos de ADN a partir del estudio de curvas de temperatura
de fusión. En general, se utilizan fluorocromos como el SYBR Green de modo que, a
medida que en cada ciclo se va amplificando la secuencia de ADN blanco, la cantidad de
emisión de fluorescencia aumenta. El resultado, es graficado en una curva exponencial,
con una temperatura de melting específica para el producto amplificado.
El objetivo del presente trabajo, es la puesta a punto de la técnica de real time PCR, para
el diagnóstico de secuencias de ADN específicas del cromosoma Y en animales
domésticos intersexuados.
Materiales y Métodos:
Se estudiaron dos hembras bovinas raza Holando sospechosas de freemartinismo y un
caso de intersexo canino en una hembra raza Cimarrón uruguayo. Animales normales
para cada especie (machos y hembras) testeados citogenéticamente, fueron incluidos en
este estudio como controles positivos y negativos respectivamente. El ADN fue extraído a
partir de sangre periférica por el método convencional de fenol cloroformo. La secuencia
repetida BRY4 fue analizada en los individuos freemartin. La elección de primers y las
condiciones de amplificación fueron las descriptas por Peura et al. (1990). El gen SRY fue
analizado para el caso de intersexo en canino, siendo la elección de los primers y las
condiciones de amplificación las descriptas por (Meyers 1999). Las muestras de ADN
fueron amplificadas en tiempo real utilizando termociclador Corbett y Kit Biotools
QuantyMix SYG.
Resultados:
Las curvas de amplificación de las secuencias se muestran en la figura 1 A y B. Se obtuvo
una única señal de amplificación para los controles positivos, no así para los controles
negativos donde no se detecto señal. Las muestras pertenecientes a los intersexos
mostraron amplificación para los marcadores considerados. La temperatura de melting fue
de 86ºC para el gen SRY canino y de 84ºC para la secuencia repetida BRY4 (Fig. 1 C y
D).
Fig. 1: A) Curvas de amplificación para el marcador BRY4; B) Curvas de amplificación
para el gen SRY canino; D) Curvas de melting para BRY4; D) Curvas de melting para el
gen SRY.
A
C
Freemartin 1
Freemartin 2
Blanco
B
D
Hembra
Macho
Intersexo
Discusión:
El análisis de las curvas de temperatura de fusión, reveló la presencia de un único
producto de amplificación para las dos secuencias analizadas. Los individuos freemartin,
así como el intersexo canino, mostraron señales de amplificación consistentes con los
controles positivos (machos normales). Ninguna de las hembras (controles negativos)
mostraron señales de amplificación.
El marcador molecular BRY4, amplificó en todas las muestras en torno al ciclo número 10,
en tanto que el gen SRY canino lo hizo en torno al número 20. Esta diferencia se debe a
la naturaleza de los marcadores analizados, puesto que el BRY4 se trata de una
secuencia repetida en tanto que el gen SRY es de copia única.
Para ambos marcadores se observa heterogeneidad entre las curvas. Esta diferencia se
debe a distintas eficiencias de amplificación entre las muestras, puesto que no fueron
estandarizadas a una misma concentración.
La presencia de un solo producto de amplificación, la temperatura de melting consistente
con la temperatura teórica calculada y la ausencia de amplificación de los controles
negativos, muestran especificidad en la reacción de amplificación para cada marcador.
Conclusiones:
La detección de secuencias específicas del cromosoma Y mediante la técnica de real time
PCR, representa una alternativa novedosa, rápida, sencilla y eficiente, de realizar un
diagnóstico específico y sensible de casos de intersexos en animales domésticos que
involucren al cromosoma Y o parte de él.
Se trata de una técnica plástica fácilmente adaptable a otros propósitos, tales como el
sexado de embriones o la confirmación del semen sexado en bovinos.
Agradecimientos:
Los autores quieren agradecer a la Lic. Paula Nicolini por el asesoramiento permanente, y
a la Dra. Ana Meikle por la utilización de todos los equipos disponibles en el Laboratorio
de técnicas nucleares.
Bibliografía:
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Padula, A.M.; (2005). The freemartin sindrome: an update. Animal reproduction science.
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