Download indice general - Tesis U. de Chile

INDICE GENERAL
DEDICATORIA
AGRADECIMIENTOS
RESUMEN
SUMMARY
INDICE GENERAL
………………………………………………
i
INDICE DE FIGURAS
........................................................................
v
INDICE DE TABLAS
........................................................................
vi
ANEXOS
.........................................................................
vi
ABREVIATURAS
.......................................................................... vii
1.
INTRODUCCIÓN
……………………………………………….
1
1.1.
Generalidades
…………………………………………….....
1
1.2.
Vibriosis en Chile
…………………………………………….....
2
1.3.
La vibriosis
…………………………………………….....
3
1.3.1.
Epizooetiología
…………………………………………...…..
3
1.3.2.
Signos clínicos
……………………………………………….
3
1.3.3.
Histopatología
……………………………………………….
4
1.4.
Reservorio y transmisión
……………………………………....
4
1.5.
Listonella anguillarum y Vibrio ordalii: ………………………..........
5
1.5.1.
Posición taxonómica
……………………………………....
5
5.1.5.2.
Caracterización bioquímica
………………………………………
6
i
1.5.3.
Caracterización serológica
…………………………….………...
7
1.5.4.
Caracterización genética
………………………………………
9
1.6.
Factores de virulencia
………………………………………
10
1.7
Tratamiento y prevención
………………………………...…….
11
2.
HIPÓTESIS
………………………………….....…..……..
12
3.
OBJETIVO GENERAL
……………………...…………....….
12
3.1
OBJETIVOS ESPECIFICOS
………………………………............
12
4.
MATERIALES
………………………………………..……..
13
4.1.
Aislados incluidos en este estudio.
4.2.
Animales experimentales:
4.3.
…………………………….
13
…………………………………..….
13
Enzimas
………………………………………………………
13
4.4.
Anticuerpos.
………………………………………………………
14
4.5.
Material fungible
……………………………………………....
14
4.5.1.
Reactivos.
……………………………………………………….
14
5.
METODOLOGÍA
………………………………………………
15
5.1.
Procesamiento de los aislados ……………………………………...
15
5.1.1.
Muestreo
…………………………………………………….....
15
5.1.2.
Medios y condiciones de cultivos
………………………….….
15
5.1.3.
Ensayos bioquímicos
……………………………………………...
15
5.1.4.
Extracciones
………………………………………………………
16
5.1.4.1.
Extracción de ADN
………………………………………………
16
5.1.4.2.
Extracción de proteínas totales y membrana externa
……………
16
5.1.4.3.
Extracción de lipopolisacáridos (LPS)
………………………...
17
5.1.4.4.
Extracción de antígeno “O” de bacterias
…..………………….
18
ii
……………………………………
18
………….
18
5.2.
Identificación Molecular
5.2.1.
Análisis filogenético basado en el gen ARNr 16S
5.2.1.1
Amplificación del gen ARNr 16S mediante partidores universales ..
18
5.2.1.2.
Análisis de las secuencias
……………………………………....
19
5.2.2.
Amplificación de la región intergénica (ITS) entre el 16S – 23S ARNr. 19
5.3.
Caracterización Molecular
5.3.1.
Análisis de los aislados mediante electroforesis de campo pulsado…... 20
5.3.2.
Análisis de restricción de los espaciadores intergénicos …………….. 21
5.3.3.
Análisis de secuencias intergénicas repetitivas (PCR–ERIC)................ 22
5.3.4.
Análisis de elementos extragénicos repetitivos (PCR-REP)………….
5.3.5.
Electroforesis en geles de agarosa
5.4.
Caracterización serológica
5.4.1.1.
Obtención de sueros
5.4.1.1.
Formulación del antígeno
………………………………………
24
5.4.1.2.
Inmunización de conejos
………………………………………
24
5.4.1.3.
Inmunización de peces
………………………………………
24
5.4.1.4.
Absorción de sueros
………………………………………
25
5.4.2.
Titulación de los sueros por ELISA
5.4.3.
Ensayos de Aglutinación
5.4.4.
Ensayos de dot-blot
………………………………………
20
22
…………………………….... 22
………………………………………. 24
……………………………………………….. 24
……………………………… 25
………………………………………
26
……………………………………………….
26
5.4.5.
Revelado para dot-blot y western-blot ……………………………...
27
5.4.6.
Ensayo de Western-blot
………………………………………. 27
5.5.
Estudios de virulencia
………………………………………. 28
6.
RESULTADOS
……………………………………………….. 29
iii
6.1.
Identificación de los aislados de vibriosis
……………………… 29
6.1.1.
Análisis filogenético del gen ARNr 16S
…………………….
29
6.2.
Caracterización genética
……………………………………...
32
6.2.1.
Amplificación de ITS entre el gen ARNr 16S y el 23S ……………..
32
6.2.2.
RFLP-ITS
……………………………………………………….
33
6.2.3.
Electroforesis de campo pulsado (PFGE)
……………………..
33
6.2.4.
Análisis de elementos extragénicos repetitivos (PCR-REP).................
36
6.2.5.
Análisis de secuencias intergénicas repetitivas (PCR-ERIC)…………
37
6.3.
Caracterización molecular de componentes estructurales ……………
38
6.3.1.
Proteínas totales y externas
6.3.2.
Lipopolisacáridos (LPS) ……………………………………………
6.3.
Estudios serológicos de agentes causales de vibriosis
6.3.1.
Obtención de sueros policlonales en conejos y su titulación por ELISA 41
6.3.2.
Ensayo de aglutinación en porta-objeto
6.3.3.
………………………………………. 38
…………….
40
40
……………………..
42
Ensayos de Dot-blot
………………………………………
43
6.3.4.
Ensayos de Western-blot
………………………………………
46
6.4.
Estudios de virulencia
………………………………………
51
7.
DISCUSIÓN
………………………………………………
52
7.1.
Identificación
…………………………………………..…..
52
7.2
Caracterización genética
……………………………………...
53
7.3.
Caracterización de los componentes de la envoltura celular
……
56
7.4.
Caracterización antigénica
……………………………………...
56
8.
CONCLUSIÓN
………………………………………………
59
9.
REFERENCIAS
………………………………………………
601
iv
INDICE DE FIGURAS
…………….. 7
Figura 1.
Colonias típicas de los aislados chilenos de vibriosis
Figura 2.
Comparación de las secuencias del gen ARNr 16S de aislados chilenos y aquellos disponibles para especies del género Vibrio..……..…..
Figura 3.
30
Árbol filogenético a partir del gen ARNr 16S de aislados chilenos
causales de vibriosis en el sur de Chile .……………………...…..….
31
Figura 4.
Análisis de los aislados mediante la técnica de PCR-ITS ……..…..
32
Figura 5.
Patrón de PFGE y dendograma de aislados de vibriosis en Chile ….
34
Figura 6.
Gel comparativo entre los patrones electroforéticos de PFGE de los
aislados de V. ordalii y L. anguillarum nacionales…………………..
35
Figura 7.
Electroforesis de PCR-REP de los aislados de vibriosis estudiados.…
36
Figura 8.
Perfil electroforético del producto de amplificación PCR-ERIC de
aislados de V. ordalii y L. anguillarum ……………………………..... 37
Figura 9
Electroforesis en SDS-PAGE de proteínas y dendograma para V.
ordalii………………………………………………………………………
Figura 10.
38
Electroforesis en SDS-PAGE de proteínas y dendograma para L.
anguillarum…………………………………………………………..……
39
Figura 11.
Perfiles electroforéticos de LPS de los aislados de vibiosis en Chile.
40
Figura 12.
Gráfica de titulación por ELISA de sueros anti-L. anguillarum……
42
Figura 13.
Ensayo de dot-blot de los aislados chilenos de V. ordalii…………...
45
Figura 14.
Ensayo de dot-blot de los aislados chilenos de L. anguillarum……….
45
Figura 15.
Inmunoblot de proteínas de aislados chilenos de V. ordalii……. …...
47
Figura 16.
Inmunoblot de proteínas de aislados chilenos de L. anguillarum…….
48
Figura 17.
Inmunoblot de lipopolisacáridos de aislados chilenos de V. ordalii….
49
v
Figura 18.
Inmunoblot de lipopolisacáridos de aislados chilenos de L. anguillarum 50
Figura 19.
Mortalidad en los ensayos de virulencia ……………………………… 51
INDICE DE TABLAS
Tabla 1.
Partidores utilizados en los estudios de caracterización genética……... 23
Tabla 2.
Aislados representativos de L. anguillarum y V. ordalii seleccionados
para su caracterización serológica.
Tabla 3.
……………..……………….. 41
Títulos obtenidos a partir de conejos inmunizados con los aislados
seleccionados de V. ordalii y L. anguillarum
Tabla 4.
……………………..
41
Ensayo de aglutinación en portaobjeto usando los antisueros de L.
anguillarum y V. ordalii para los aislados chilenos ..………………… 43
ANEXOS
Anexo 1:
Principales características fenotípicas, fisiológicas y bioquímicas de las
especies L. anguillarum y V. ordalii ……………………………..…
Anexo 2:
68
Aislados bacterianos estudiados en la presente tesis, los cuales fueron asociados
a mortalidades de salmónidos entre octubre 2004 y agosto2005..….
vi
69
ABREVIATURAS
-ME
-mercaptoetanol
ADN
ácido desoxirribonucléico
Ag O
Antígeno O
ARNr:
ARN (ácido ribonucleico) ribosomal
BCIP
5-bromo-4-cloro-3-indol fosfato p-toloudin
BrEt
bromuro de etidio
BSA
seroalbúmina de bovino
CBB
Coomassie Brilliant Blue
DMSO
dimetilsulfóxido
DTT
ditiotreitol
EDTA
ácido etilen-diamino-tetra-acético
ELISA
(Enzyme Linked Inmunoabsorbent Assay ) ensayo inmunoenzimático
ERIC
secuencias consenso repetitivas intragénicas de enterobacterias.
h
hora / horas
HRP
peroxidasa de rábano
IgG
inmunoglobulina tipo G
ITS
(Internal Transcribed Spacer) espaciador entre genes ARNr 16S y 23S
kDa
kilo Dalton
LPS
lipopolisacárido
mA
miliamper
NBT
azul de nitrotetrazolium
NC
nitrocelulosa
nM
nanomolar
OPD
o-fenilendiamina
PAGE
electroforesis en Geles de Poliacrilamida
pb
pares de bases
PBS
tampón fosfato salino
PCR:
(Polymerase Chain Reaction) Reacción en cadena de la polimerasa.
vii
PFGE
electroforesis de campo pulsado
PM
peso molecular
PMSF
fenil-metil-sulfonil-fluoruro
PSA
persulfato de amonio
REP
secuencias palindrómicas repetitivas extragénicas
RFLP
polimorfismo del largo de los fragmentos de restricción
RNA
ácido ribonucleico
rpm
revoluciones por minuto
SDS
dodecil sulfato de sodio
SRS
síndrome rickettsial del salmón.
TA
temperatura ambiente
TAE
tampón tris, acetato, EDTA
TEMED
N, N, N’, N’-tetrametil etilen diamina.
TCBS
agar tiosulfato-citrato-sacarosa con sales biliares
Tris-HCl
clorhidrato de Tris (hidroximetil) Aminometano
TSA
medio de cultivo Agar tripticasa de soya
U
unidades
V.p.
Vibrio parahemolítico
V
volts
viii