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CÁTEDRA: BIOQUÍMICA
Carreras: Farmacia
Profesorado en Química
Licenciatura en Química
Licenciatura en Alimentos
METABOLISMO DE HIDRATOS DE CARBONO
1) Se incuba glucosa marcada en el 14C1 con las enzimas glucolíticas y los
cofactores necesarios. ¿Cuál es la distribución de 14C en el piruvato? Realice el
mismo seguimiento con glucosa marcada en C2, C3, C4, C5 y C6.
2) En dos tubos diferentes se incubaron extractos celulares de músculo de conejo
(tubo A) y de levaduras (tubo B) con fosfato y glucosa marcada isotópicamente ( 14C)
en forma uniforme en un medio anaeróbico (con NaN3) a pH 5 y 30°C. Las medidas
de radioactividad, en alícuotas iguales de medio, a tiempo cero (antes de agregar las
células) y luego de 1 h de incubación se muestran en la siguiente tabla:
Tiempo (min)
0
60
% Radiact. Tubo A
100
98
% Radiact. Tubo B
100
65
a) ¿Qué explicación encuentra para estos resultados?
b) Construya una tabla con los valores teóricos de % de radioactividad que esperaría
encontrar si el experimento se realizara en idénticas condiciones pero con ( 14C1)
glucosa.
c) Igual que en b pero con (14C3) glucosa.
3) Un experimento de pulso y caza usando fuentes de carbono marcadas
radioactivamente es llevado a cabo en un extracto de levaduras mantenido bajo
estrictas condiciones de anaerobiosis para producir etanol. El experimento consiste
en incubar una pequeña cantidad de sustrato marcado radioactivamente (el pulso)
con el extracto de levaduras el tiempo necesario para que cada intermediario en la
ruta metabólica resulte marcado. La marca es luego “cazada” durante la ruta
metabólica por la adición de un exceso de sustrato no marcado. El propósito de la
“caza” es prevenir el reciclaje de los productos marcados y su ingreso a otras rutas
metabólicas.
a) ¿Cuál es la localización del 14C en el etanol producido si la glucosa usada como
sustrato estaba marcada en C1?
b) ¿Dónde se encontraría inicialmente la marca en la glucosa si todo el 14C se
liberara como CO2?
4) En uno de sus clásicos experimentos Harden y Young, estudiando la fermentación
anaeróbica de glucosa a etanol y CO2 por levaduras, observaron que el fosfato era
esencial para la fermentación, y cuando éste se eliminaba o era consumido, la
fermentación cesaba aún en exceso de glucosa. En estas condiciones se acumulaba
etanol, CO2, y una hexosa bisfosfato. Además, si se agregaba arseniato en estas
condiciones, no se acumulaba la hexosa bifosfato y la fermentación proseguía hasta
terminar la glucosa. Explique.
1
5) Calcule la eficacia de recuperación energética en la glucólisis del eritrocito en
base de los siguientes datos:
Glucosa 2 LactatoG’0 = -47,0 Kcal/mol
ATP + H20  ADP + Pi
G’,0 = -7,3 Kcal/mol
Concentración
intracelular (mM)
5
1
0,14
1,85
2,90
Glucosa
Pi
ADP
ATP
Lactato
7
6) Se prepararon varios tubos de ensayo que contenían 1 ml de levaduras (2.10
células/ml) + 1 ml de una solución reguladora + 3 ml de una solución de glucosa 5
mM. A tiempo 0 se pusieron a incubar a 30°C (la reacción se disparó por el
agregado de la glucosa).
A los 3 min se les hicieron los agregados (1 ml en total) que se detallan en la
columna A de la tabla y se tomó una alícuota de 1 ml de la mezcla, se centrifugó y a
0,5 ml de sobrenadante se lo hizo reaccionar por el método de la glucosa oxidasa,
obteniéndose los valores de concentración de glucosa que se indican en la columna
B de la tabla. A los 30 min. se repitió la operación (los datos obtenidos figuran en la
columna C).
Una con flechas los datos de la columna C a los de la columna B según lo esperado
para el consumo de azúcar en cada condición. Determine en cada caso la velocidad
de consumo de glucosa en µmol/min.
A
AGUA
Pi 50 mM
Pi + NaN3
Pi + NaF
ARSENIATO 50 mM
Pi + ARSENIATO
ARSENIATO + NaN3
SACAROSA + Pi
SACAROSA
B
2.5 mM
C
2,5 mM
2,5 mM
1 mM
2,5 mM
0,32 mM
0,625 mM
1,5 mM
1,5 mM
0,90 mM
7) Un cultivo bacteriano respirando activamente es incubado con glucosa-14C1 y
posteriormente se aislan los intermediarios del ciclo del ácido cítrico, ¿Dónde estará
el 14C en cada una de las sustancias listadas abajo? Considerar sólo la
incorporación inicial de 14C en estos compuestos:
a) Fructosa-1,6-bisP, b) Acetil-SCoA, c) Gliceraldehído-3-P, d) Fosfoenolpiruvato, e)
Citrato, f) alfa-cetoglutarato, y g) Oxalacetato.
8) La respiración celular puede ser estudiada usando preparaciones de
mitocondrias aisladas y midiendo su consumo de O 2 bajo diferentes condiciones. Si
10 mM de malonato de sodio se agrega a mitocondrias que se encuentran
respirando activamente usando piruvato como fuente combustible, se detiene la
respiración rápidamente y se acumula un intermediario metabólico.
2
a) ¿Cuál es la estructura del metabolito acumulado? Explique por qué se acumula.
b) ¿Por qué se detiene el consumo de O2?
9) Las rutas metabólicas de compuestos orgánicos han sido estudiadas utilizando
sustratos marcados radioactivamente.
a) ¿Cómo puede usted determinar si la glucosa agregada a una suspensión de
mitocondrias aisladas es metabolizada a CO2 y agua?
b) Suponga que usted agrega piruvato marcado con 14C en el metilo, después de
una vuelta del ciclo del ácido cítrico, ¿Cuál es la posición del 14C en el oxalacetato, y
en cada uno de los intermediarios?
c) ¿Cuántas vueltas del ciclo son necesarias para que el 14C empiece a
desprenderse como CO2?
10) ¿Es posible obtener síntesis neta de oxalacetato agregando acetil-CoA a un
extracto que contiene las enzimas y cofactores del ciclo del ácido cítrico?
11) Supóngase que se añade acetato marcado con 14C en el grupo metilo a cada
una de las siguientes preparaciones celulares que respiran:
a) Células hepáticas
b) Células hepáticas a las que se ha adicionado malonato
c) Plántulas de arveja
A continuación se aisla ácido succínico de cada una de las preparaciones. ¿Cuáles
serán los átomos de C del ácido succínico que se espera estén marcados?.
Fundamente brevemente.
12) El fluoracetato, preparado comercialmente para el control de roedores, es
también producido naturalmente por una planta de Sudamérica. Después de entrar
en la célula, el fluoracetato es convertido en fluoracetil-SCoA en una reacción
catalizada por la enzima acetato tioquinasa:
F-CH2-COO- + CoA-SH + ATP -----> F-CH2-CO-S-CoA + AMP + PPi
Para estudiar el efecto tóxico del fluoracetato se realizó un experimento sobre
corazón de rata aislado. Después que el corazón fue perfundido con una solución
0,22 mM de fluoracetato, la velocidad de la captura de glucosa y la glucólisis
disminuyó, y se observó acumulación de glucosa-6-P y fructosa-6-P. Un examen de
los intermediarios del ciclo del ácido cítrico indicó que sus concentraciones eran
inferiores a las normales, excepto para el citrato, cuya concentración intracelular, era
10 veces mayor que lo normal.
a) ¿Dónde ocurriría el bloqueo del ciclo del ácido cítrico? ¿Qué causó la
acumulación del citrato y el agotamiento de los otros intermediarios?
b) El fluoracetil-SCoA es enzimáticamente transformado en el ciclo del ácido cítrico.
¿Cuál es la estructura del producto metabólico final del fluoracetato?
c) ¿Por qué la captura de la glucosa y la glucólisis disminuyen al perfundir
fluoracetato? ¿Por qué éste bloquea el ciclo del ácido cítrico? ¿Por qué se acumulan
hexosas monofosfato?
d) ¿Por qué el fluoracetato es un veneno fatal?
13) Se incubaron a 37°C 0,5 ml de un extracto de levaduras libres de mitocondrias
(conteniendo 1 mg/ml de proteína) con 2 ml de una solución de glucosa 0,5 M en un
volumen final de 3 ml. A los 30 minutos se sacaron 2 alícuotas de 0,1 ml cada una,
3
determinándose en una de ellas 13,3 µmoles de glucosa y en la otra 30 µmoles de
etanol. a) Determine la velocidad de consumo de glucosa y de producción de etanol
expresándolas en µmoles/min. mg prot. b) Nombre la/s vía/s involucradas en la
utilización de la glucosa y diga qué porcentaje de glucosa es degradada por cada
una. c) Si se agrega glucosa marcada radioactivamente en el carbono 1, ¿qué
cantidad de 14CO2 se desprende en 10 minutos? d) Si se agrega glucosa marcada
uniformemente, ¿qué cantidad de 14CO2 se desprende en 10 minutos? Suponga que
no se acumula ningún carbohidrato intermediario ni metabolito fosforilado.
14) En un experimento se incubaron 2. 105 eritrocitos en un medio con glucosa
uniformemente marcada con 14C, a pH 7,3 y a 37°C, en un volumen final de 7 ml. A
tiempo 0, se tomó una alícuota, se centrifugó y en el sobrenadante se determinó
glucosa por el método de Glucosa Oxidasa. Para esta determinación se emplearon
200 µl de sobrenadante y se obtuvo 0,65. Este procedimiento se repitió a los 30
minutos y resultó una Abs505 nm = 0,20. Un testigo de glucosa 1 g/l produjo una
Abs505 nm = 0,30 empleando una alícuota de 100 µl. Todas las medidas se realizaron
llevando a 100 % de transmitancia con el blanco. La velocidad media de aparición de
14CO durante ese mismo lapso fue de 5,80 µmoles/min. 10 6 células. Las células no
2
acumulan carbohidratos ni derivados fosforilados. Calcule la velocidad de consumo
de glucosa, la velocidad de aparición de lactato y la velocidad de producción
NADPH.
15) Se incubó glucosa-14C6 con una suspensión de eritrocitos en presencia de un
potente inhibidor de la fosfoglucoisomerasa. Al cabo de un tiempo se detectó la
presencia de piruvato 14C. ¿Mediante qué vía metabólica se llegó a la producción del
piruvato marcado? Detalle la vía e indique qué carbono del piruvato espera
encontrar marcado.
16) Puede utilizarse un experimento con isótopos para determinar qué fracción del
catabolismo de la glucosa procede vía glucólisis vs vía de las pentosas. Las células
se dividen en dos fracciones; una se incuba con glucosa 14C1 y la otra con glucosa
14C . Se comparan las velocidades iniciales por las cuales la marca aparece como
6
CO2. Prediga qué valor puede alcanzar en células hepáticas asumiendo que la
velocidad de degradación de la glucosa es igual por ambas vías.
17) a) Se incubaron 10 µl de un extracto de músculo de conejo (conteniendo 1,4
mg/ml prot) con 0,4 ml de una solución de glucosa 1 g/l, en un volumen final de 4 ml
(PM Glucosa=180). Al cabo de 10 minutos se extrajo una alícuota de 0,5 ml y se
determinó la presencia de 0,10 µmoles glucosa por el método colorimétrico. Exprese
la velocidad de consumo de glucosa en µmoles/min. mg prot.
b) En otra serie de experimentos se incubaron distintos extractos tisulares, en
condiciones tales que el consumo de glucosa fue de 10 µmoles/min.mg prot. Si el 25
% de la misma fue degradada por el shunt de las pentosas, indique los µmoles de
14CO producidos por mg de proteína al cabo de 30 minutos, para cada uno de los
2
siguientes casos. (Tenga en cuenta que no se acumulan carbohidratos
intermediarios ni metabolitos fosforilados).
14C-Gluc
14C -Gluc
1
14C
14
1- C3-Gluc
Extracto de Levaduras libre de
mitocondrias
4
Extracto de Músculo de conejo
libre de mitocondrias
18) Se estudiaron cuatro casos clínicos cuyos exámenes se exponen más abajo.
Para cada caso determine cuál es la enzima que está en defecto y elija un apropiado
tratamiento de la lista. Justifique su elección y resuelva las preguntas contenidas en
cada caso estudiado.
Caso A: El paciente tiene vómitos y diarrea inmediatamente después de ingestión
de leche. Se le hizo una prueba de tolerancia a la lactosa que consiste en que el
paciente ingiera una cantidad estandarizada de lactosa midiendo luego la
concentración de glucosa y galactosa en sangre a tiempos definidos. En un paciente
normal los niveles aumentan hasta un máximo en una hora y luego disminuyen. En
este paciente la concentración de los azúcares no aumentó y permaneció constante.
Explique por qué los niveles de azúcar aumentan y luego disminuyen en individuos
normales. ¿Por qué estos azúcares no aumentaron su concentración sanguínea en
este paciente?
Caso B: Un paciente retardado mental tiene vómitos y diarrea después de la
ingestión de leche. El paciente presenta una baja concentración de glucosa en
sangre, pero uno de los azúcares reductores es superior a lo normal. Se encontró
galactosa en orina. ¿Por qué la concentración de azúcares reductores en sangre es
alta? ¿Por qué la galactosa aparece en la orina?
Caso C: El paciente presenta fuertes calambres musculares cuando hace ejercicio
violento. Una biopsia muscular indicó que la concentración de glucógeno en el
músculo es muy superior a la de individuos normales. ¿Por qué se acumula
glucógeno?
Caso D: El paciente letárgico, presenta hepatomegalia y una biopsia del hígado
mostró exceso de glucógeno, también presentó baja concentración de glucosa
sanguínea.
Defectos enzimáticos:
1.Fosfofructoquinasa muscular
2.Fosfomanoisomerasa
3.Galactosa-1-P uridil transferasa
4.Fosforilasa hepática
Tratamientos:
i.Correr 3 km por día
iiDieta pobre en grasas
iiiDieta con baja lactosa
5.Triosa quinasa
6.Lactasa en mucosa intestinal
7.Maltasa en mucosa intestinal
iiiiProhibición
de
ejercicios
extenuantes
iiiiiAlimentación frecuente y regular
19) Si en un extracto de hígado de rata que lleva a cabo gluconeogénesis se
adiciona HCO3 marcado (14C), ¿Cuál o cuáles carbonos de la glucosa resultarán
marcados?
-
20) Si en el experimento anterior se suprime el HCO 3 marcado y se adiciona
piruvato marcado uniformemente con 14C, ¿Qué átomos de la glucosa resultarán
marcados?
21) Un homogenado de hígado fue incubado en un medio que contenía 10 mM de
lactato como única fuente de carbono y 20 mM ATP, en un volumen final de 3 ml. Al
5
cabo de 30 minutos, la concentración de lactato fue 0,13 mM. a) ¿Por qué vía
metabólica se obtuvo glucosa a partir de lactato? b) Calcule la velocidad de
consumo de lactato expresándola en µmoles/min. En base a este dato, ¿qué
velocidad de producción de glucosa esperaría encontrar? c) Cuando se procesó por
el mismo método una alícuota de 0,2 ml de la muestra se observó una velocidad de
producción de glucosa de 0,18 µmoles/min. En base a los datos obtenidos ¿qué
destinos metabólicos tuvo el resto del lactato consumido?
22) Se realiza un experimento con el objeto de caracterizar el efecto de 3 sustancias
desconocidas A, B y C, sobre el metabolismo glucolítico hepático. Para ello se
trabajó con homogenados de hígado, incubados en un medio apropiado al cual se
adicionaron las sustancias a probar. Luego de someter distintas muestras a cada
uno de los tratamientos se midieron en cada homogenado las concentraciones de
metabolitos intermediarios de interés, cuyas concentraciones (µM) se encuentran
indicadas más abajo. Asuma que los valores están relacionados directamente con
las concentraciones citosólicas hipotéticas en células intactas.
Metabolito
Control homogenado
sin agregados
A
B
C
Glucosa-6-P
20
19
25
20
Fructosa-6-P
19
9
24
19
Fructosa-1,6-P2
10
16
6
10
Gliceraldehido-3-P +
Dihidroxiacetona-P
1,3 bisPglicerato
8
12
13
8
10
12
8
10
3-P-glicerato
13
13
7
14
2-P-glicerato
13
13
8
12
P-enolpiruvato
12
7
18
12
Piruvato
14
18
5
14
Adicionalmente, cuando se ensayaron sobre hepatocitos intactos, se comprobó que
ni A ni B poseían efecto sobre la concentración de metabolitos citosólicos; C en
cambio, provocó efectos similares en magnitud a los de la sustancia A. Se considera
que existe efecto cuando la concentración de un metabolito varía en más del 10%.
En base a estos datos responda lo siguiente:
a)¿A qué nivel actúan estas sustancias?
b) ¿Con qué sustancias activas in vivo que Ud. conozca podría relacionar a A, B, y
C? Mencione al menos una en cada caso y fundamente su respuesta.
Respuestas
1) C1 – C2 – C3 -------------------------------------------- C4 – C5 – C6
de la glucosa
corresponde a
6
H3C1- C2O – C3OOH
(músculo y hematíe)
H3C1- C2 H2OH +
(levaduras)
HOOC4 – C5O – C6H3
y
C3O2
y
del piruvato
C4O2 + OH H2C5 - H3C6 del etanol y CO2
2) a) En la fermentación alcohólica, el C3 y C4 en el tubo B se liberan como CO2
marcado, disminuyendo la radioactividad final.
b) No hay liberación de CO2 marcado; la radioactividad es igual a 0 y 60min para los
2 tubos.
c) Sólo se libera el C3 como CO2. El tubo B tendría a los 60 min (aprox) 83 % de la
radioactividad.
3)a) En el metilo del etanol. B) C3 y C4 de la glucosa.
4) Se acumula 1,6 bisfosfoglucosa, pues no hay fosfato que continue la reacción de
la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa. Al agregarle arseniato a la muestra
continua la fermentación, se regenera el NAD+ y puede ingresar nuevamente a
oxidar al gliceraldehído 3 P por la gliceraldehído 3 P deshidrogenasa.
5) 51 %.
6) Se resuelve 1 sólo caso: tubo B 2,5 mM y tubo C 1,0 mM : 9 moles
consumidos/30 min = 0,3 moles/min.
En A: agua, Pi + NaF y sacarosa ----------en C 2,5 mM
En A: Pi 50mM y sacarosa + Pi--------------en C 1,5 mM
En A: Pi + arseniato-----------------------------en C 1,0 mM
En A: Arseniato 50 mM-------------------------en C 0,9 mM
En A: Pi + NaN3-----------------------------------en C 0,625 mM
En A: Arseniato + NaN3-------------------------en C 0,32 mM
7) a) C1; b) C2; c) C3; d) C3; e) C2; f) C5; g) OAA 50% C2 y 50 % en C3
8) a) Se acumula succinato. El malonato es un inhibidor competitivo de la succinato
deshidrogenasa por su semejanza estructural con el succinato.
b) Se detiene el ciclo de Krebs, no se forma NADH, no se necesita O2.
9) a) Usando glucosa marcada con 14C. Ver si aparece 14CO2 en cantidades
estequiométricas.
b) OAA, MAL y FUM C2-C3; SUCC C2; SUCC CoA C3; Alfa Oxo GLUT C4; CIT e
ISOCIT C4
c) 3
10) No. Porque en el ciclo de Krebs se producen 2 descarboxilaciones previas a la
síntesis de OAA. Sólo en aquellos organismos que posean el ciclo del glioxilato.
11) a) C1,C2,C3; b) C2; c) C1,C2,C3
12) a) El fluorocitrato inhibe a la aconitasa, aumentando la cantidad de citrato.
7
b) –OOC-CHF-COHCOO-CH2-COOc) La acumulación de Glc 6 P y Fru 6 P se debe a que el citrato inhibe a la enzima
fosfofructoquinasa (PFK)
d) Por la citrato sintasa se transforma en un inhibidor de la aconitasa. Es fatal pues
también inhibe la síntesis de ATP a partir de la glucólisis.
13) a) Glc: 40 moles/min mg de prot.; etanol: 60 moles/min mg prot
b) 75 % glucólisis; 25 % ciclo de las pentosas.
c) 50 moles; d) 600 moles.
14) Consumo de glucosa: 4,9 moles/min 106 cél; aparición de lactato: 7,94
moles/min 106 cél; producción de NADPH: 11,6 moles/min 106 cél
15) Ciclo de las pentosas; el C3 del piruvato.
16) C1 el doble que C2.
17)a) 10 moles/min mg prot.
900
450
75
75
375
150
18) Defectos:1C; 3B; 4D; 6 A
Tratamientos: iii A y B; iiii C; iiiii A
19) En ninguno.
20) En los 6.
21) a) Gluconeogénesis; b) 0,987 moles de lactato/min ; 0,4935 moles de
glucosa/min c) Se oxidó.
22) A: Fructosa 2,6 bis fosfato; B ATP- Citrato; C: Insulina.
8
Glucólisis
9
Fermentación homoláctica.
Fermentación alcohólica
Destino de los carbonos de la glucosa
10
Entrada de glucógeno, almidón, disacáridos y hexosas en la glucólisis.
11
…….
Glucólisis y gluconeogénesis. La primer etapa a partir de piruvato (y lactato) se
muestra en la siguiente imagen.
12
Inicio de gluconeogénesis a partir de piruvato y lactato
Gluconeogénesis. Destino del CO2 en la carboxilación del piruvato.
13
Ciclo de Krebs
Esquema del ciclo de las pentosas
14
Fase oxidativa del ciclo de las pentosas. El C1 de la glucosa se pierde como CO2.
15
Fase no oxidativa del ciclo de las pentosas
Ciclo del glioxilato
16
Síntesis del glucógeno ( siempre a partir del extremo no reductor)
Degradación del glucógeno ( siempre a partir del extremo no reductor)
17