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MANIPULACIÓ EMBRIONÀRIA
1.- Fol·liculogènesi
Els oòcits madurs surten de la fol·liculogènesi i de la ovogènesi. La femella, a diferència dels mascles,
quan neixen ja els té tots. Les femelles no presenten menopàusa. Quan entren en pubertad, s’activa l’eix
hipotàla—hipofisiari. La FSH s’encarregarà d’afavorir el creixement del fol·licle (augmenta el volum del
citoplasma i la grandària i apareix la zona pel·lucida.

Fol·licle secundari – Hi ha més cèl·lules de la granulosa que secretaran estrògens---feed-back + en
producció de FSH.

Fol·licle terciari – Hi ha diferenciació en les cèl·lules de la teca interna (receptacle de la LH) i les
cèl·lules de la granulosa (FSH iLH).

Fol·licle de graff o preovulatori – L’oòcit és perifèric i està envoltat per cèl·lules del cumulus oofurus
i cèl·lules de la teca interna i externa.
Des de que apareix l’oocit el nucli està en la mateixa posició mentre canvia el citoplasma. La maduració
de l’oocit són tot el conjunt de canvis que fan que el fol·licle sigui capaç de fecundar-se i iniciar el
programa de desenvolupament embrionari fins casi la implantació (fecundació/ primeres divisions fins
que l’embrió doni senyal). La maduració de l’oocit és provocada pel Eric preovulatori d’LH.
Abarca:
 Maduració nuclear – ovogènesi (CGP: es divideixen per mitosi---oogenies-----divisió per mitosis
(nº determinat de vegades)----meiosis------oòcits.
 Permetent la pèrdua de la meitat del material genètic. L’oòcit entra en meiosi i
s’atura en estadi de dictiotè o estadi de vesícula seminal (profase de la 1ª divisió
meiòtica) = estadi nuclear (tots quan neixen estan així fins la pubertad o morin).
 Quan arriba la LH es reinicia la divisió produïnt una cèl·lula (oòcit) i corpuscle
polar i desprès tornen a aturar-se en metafase de la 2ª divisió meiòtica (a excepció
de la gossa). Serà l’espermatozoide que donarà la senyal per continuar la divisió (si
no arriba no evolucionarà).


Maduració citoplasmàtica – Es basa en:

Síntesi de proteïnes: tubulina, actina, ….., lactat deshidrogenada (80-90%), etc. Se sintetitzen
durant el creixement de l’oòcit. Una vegada trencada la vesícula germinal, la síntesi
disminueix.

Reorganització dels orgànuls citoplasmàtics: mitocòndries, Golgi, REC, formes menys actives,
grànuls corticals i distribució uniforme---perifèrica (evitant poliespèrmia)

Zona pel·lúcida: coberta glicoproteica (no cèl·lules) formada per Zp1 (estructural), Zp2 (fixar
membrana acrosomal per evitar poliespèrmia) i Zp3 (reacció acrosòmica o evitem
poliespèrmia). Zp2 i Zp3 formen cadenes i la Zp3 dona estructura a la cadena. Són proteïnes
amb grups glucídics.
Maduració de les cèl·lules fol·liculars – Quan arriba el pic d'LH, l'FSH fa que les cèl·lules
secretin àcid hialurònic afavorint així la ruptura entre les cèl·lules del cúmulus i oòcit--expansionant el cumulus. Totes les cèl·lules es queden enganxades a una espècie de moc---oòcit
amb augment de superficie contacte i enganxifòs, facilitant l’atuació de les fimbries. També es
produeix la interrupció de l’arrivada a l’oòcit de factors que impedeixen el reinici de la meiosis
(oòcit aïllat i cobert amb la zona pel·lúcida).
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MADURACIÓ IN VITRO DE L’OOCIT: Volem aconseguir al laboratori que l’oòcit segueixi i els mat
………que durant el període de maduració fol·licular previ a la ovulació. (incloem criteris de selecció de
la font i tipus d’oocit i conèixer les condicions necessaries per la maduració).
Les fonts dels oòcits poden procedir de:
 Femelles vives – Busquem l’oòcit a l’ovari de la femella amb la tècnica cnoumpich-up (OPUs).
Amb un ecògraf via vaginal, es veu l’ovari. A l’ecògraf hi ha anexionat una agulla amb una
tècnica d’aspiració. Es fa més en vaques i en comença a fer en fugues. Té un preu elevat, hi ha
pocs oòcits (nomès es fa en femelles d’elevat valor genètic).
 Femelles ovariohisterectomitzades – La femella no repetirà, hi ha pocs oòcits i el preu és elevat
(anirà a escorxador). Pot donar-se tractaments de pre-estimulació---FSH (no adecuada per
escorxador). Coneixem perfectament quina és la situació fisiològica/patològica de la femella.
 Femelles d’escorxador – És la font d’obtenció d’oòcits més utilitzada. La femella no repeteix (no
vida reproductiva ni productiva). Els oòcits són de baix preu i hi ha un nº elevat. El problema és
que no coneixem la situació de la femella.
Cal mantenir la temperatura dels ovaris. Ha d’estar a 37ºC i si es pot en esterilitat. Cal portar un termo
amb solució fisiològica i una mica d’antibiòtic. Si s'escau altres termos que mantinguin la Tº. Quan
arribem al laboratori fem múltiples rentats per esterilitzar-los (no aconseguirem mai l’esterilitat, sinó que
els netegem per eliminar colis, etc.). A partir d’aquí els deixem en calent.
Recollida dels oòcits:
 Dissecció – Aïllar el fol·licle ovàric de la resta del teixit ovàric. Eliminem el teixit al voltant de
l’oòcit. Quan ja tinc el fol·licle adapto l'oòcit a que quedi abaix i a dalt faig la ruptura controlada.
Desprès recollirem l’oòcit. Aquesta tècnica permet: (fotocopies). Es triga molt temps, només
servirà amb experiments amb pocs oòcits o quan vulguem conèixer l’origen dels oòcits).
 Aspiració – Agulla connectada a una xeringa (característic de l’espècie) i desprès es van aspirant
els fol·licles. No es pot estar molta estona perquè es refreda. El contingut es posa en un tub, a on
eliminem el sobrenedant i ens quedem en el pellet (ja que els fol·licles sedimenten). És el mètode
més utilitzat (sobretot a boví). Hi ha un menys rendiment i hi ha una pitjor qualitat dels oòcits
(menys cèl·lules del cumulus oofurus). Tot això és una tècnica que permet rapidesa. Caldrà una
selecció més estricta.
 Slicing – Talls a sobre de l’ovari, tallem els fol·licles amb bisturí a la superfície dels ovaris per
alliberar els oòcits. Es fa sobretot a truja, cabra i ovella. Al boví hem de posar heparina (tenen
massa sang).
Selecció d’oòcits: cal treballar en condicions d’estricta esterilitat i Tª (35ºC, no menys; medis filtrats i Ab:
gentamicina).
(Tª inferiors a 25ºC, els microtúbuls es despolimeritzen. Si augmenta la Tª es repolaritzen de manera
diferent a la inicial i ja no serveix de res.)
 Agafem el pellet, seleccionem els oòcits i ho passem a una placa a 38.5ºC. Els criteris per
seleccionar oòcits són:
 Sempre paràmetres visuals:
 3 o més capes de cèl·lules del cumulus (per afavorir l’intercanvi de metabòlits, senyals entre oòcit
i cèl·lules del cumulus---mad citoplasmàtica)
 Cumulus compacte: no ha d’haver-se iniciat la maduració fol·licular. Els de cumulus expangut són
oòcits inútils que no es.................ni funcionen bé.
 Aparença homogènia del citoplasma---no pot ser heterogènia (sobretot a vedells).
 Test blue ......brillant: test objectiu que es basa en l’activitat de la glucosa-6-deshidrogenasa que
només està al creixement de l’oòcit. Abans de posar-ho a madurar, caldrà saber si ha acabat el
creixement o no (si acaba el creixement els nivells de glucosa-6-deshidrogenasa són baixos). No
és un indicador de maduració sinó de creixement. Les GGPD redueix el BCB (blau) a un
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component indicador. Resultat: oòcit creix si GGFD + BCB: oòcit incolor (no maduració). Si
l’oòcit no creix + BCB= oòcit blau---maduració.
Valoració de maduració:
 Expansió de les cèl·lules del cumulus: encara que no sempre serveix
 Extrusió del primer corpuscle polar: no serveix, el poden haver perdut
 Maduració nuclear: fixació de l’oòcit: etanol, acètic, ....., etc.
 Maduració citoplasmàtica: canvis infraestructurals (poc pràctic) i síntesi de proteïnes
 Capacitat de desenvolupament de l’oòcit un cop fecundat (2 cel) (18h de fecundació): mòrula,
blatocist...
 Naixement d’un animal viu: grups d’embrions seleccionat si hi ha pocs nascuts. El grup
d’embrions que neixen estan seleccionats. No representat en valitat...mostra esbiaixada.
2.- CAPACITACIÓN DEL ESPERMATOZOIDE
Proceso por el cual adquiere la capacidad de sufrir la reacción acrosómica necesaria para la fecundación
del ovocito. Hay un tercer fenómeno relacionado con los 2 anteriores que es un cambio de la motilidad
del espermatozoide---hiperactivación.
Características generales
Es un fenómeno reversible que no es sitio-específico ni especie-específico. In vivo suele producirse en el
tracto genital de una hembra en celo. El tiempo de capacitación es variable :depende del espermatozoide,
estado fisiológico de la hembra y en el caso de que sea in vitro dependerá del medio. A parte hay que
pensar que no todos los espermatozoides se capacitan a la vez. Hay diferencias fisiológicas entre los
espermatozoides de una misma población.
Importancia del segmento inferior del oviducto (istmo)
Los espermatozoides pueden vivir de días a semanas en el tracto genital femenino. Muchos quedan
retenidos en el tracto genital y pocos llegaran al istmo (es el principal sitio para hacer la filtración de
espermatozoides para evitar que haya poliespermia en el ovocito). A partir del istmo es cuando se produce
la capacitación.
El istmo mantiene los espermatozoides almacenados, previene de la poliespermia y gracias al contacto
espermatozoide-mucosa oviductal mantiene la capacidad fecundante del espermatozoide.
Bases moleculares de la capacitación:

Cambios en los iones intracelulares del espermatozoide.

Cambios en el metabolismo espermático.

Alteración bioquímica en la membrana plasmática.
OBS: si cogemos un espermatozoide del testículo y otro del eyaculado, el que tendrá más capacidad de
fecundación será el testicular ya que en el epidídimo, el espermatozoide lo que hace es captar factores de
capacitación para dar estabilidad de membrana para evitar la activación prematura. En el caso del
eyaculado habría que eliminar estos factores de capacitación de manera gradual y/o alteración de las
glicoproteínas periféricas. Además se produce reordenación de glicoproteínas integrales, reducción del
colesterol de membrana (baja la estabilidad de la membrana), se producen cambios en la distribución y
composición de los fosfolípidos. También se producirá disminución de la carga Q de la membrana
(cuando se elimina el colesterol, este es recogido por la albumina y el espacio libre del colesterol es
ocupado por otros componentes, como por ejemplo la fosfatidilcolina). Finalmente, la membrana
plasmática se une con la membrana acrosomal externa del espermatozoide, exponiendo la membrana
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acrosomal interna--------reacción acrosómica. Permitiendo que el contenido acrosomal se libere de
manera que el espermatozoide será capaz de penetrar la zona pelúcida u fusionarse con la membrana
plasmàtica del ovocito.
La reacción acrosomal puede darse de forma espontánea o en cualquier parte del tracto genital de la
hembra. Si se produce erróneamente el espermatozoide muere rápidamente y será incapaz de penetrar el
ovocito. Este proceso es especie-específico.
REACCIÓN ACROSOMAL
Características Generales
La reacción acrosomal es un fenómeno irreversible (las membranas no se reconstituyen). Requiere de
manera absoluta la fecundación. Ocurre en la superficie de la zona pelúcida del ovocito antes de
penetrarla.
Bases moleculares de la reacción acrosomal

Cambios en los iones intracelulares (aumenta el calcio), aumenta el pH y AMPc intracelular, actúan
los lípidos fusigénicos (como la fosfatidilcolina-----fusionandose con otros componentes de la
membrana).

Hay agonistas naturales de la reacción acrosómica:1.- Cumulus, fluido folicular y oviductal
2.- Zona pelucida (Zp3)
3.- Progesterona (cumulus y líquido folicular)
Hay receptores específicos a nivel de la membrana del espermatozoide (2 y 3)
Hiperactivación del espermatozoide
Implica un cambio en el modelo de movimiento del espermatozoide como consecuencia de la
capacitación. Se produce: aumento de asimetría, aumento de amplitud de la curvatura flagelar,
disminución de la progresión y aumento del empuje generado por el flagelo.
Istmo: espacio contorneado con líquido oviductal-----gracias a la capacitación se libera del istmo el
espermatozoide permitiendo gracias al cambio de movimiento sortear la tortuosidad del oviducto. Esta
hiperactivación permite el paso a través de las envolturas del oocito.
Mecanismos: no sabemos bien su regulación
Aumento de calcio y AMPc
*OBS: 1 mismo sistema regula los diferentes procesos para permitir la fecundación.
Preparación de los espermatozoides para Fiv (fecundación in vivo?)
1. Lavado de los espermatozoides (cosa que haría la hembra de manera natural)-----sedimentación
por centrifugación o centrifugación a través de solución Ficoll.
La centrifugación causa daño celular, por eso han salido métodos nuevos para evitarlos o
disminuirlos.
2. Técnicas de selección de espermatozoides: técnica del swim-up, gradientes de densidad Peacoll,
filtrado a través de columnas(¿?) y selección según el sexo (citometría)
a. Swim-up: semen en un tubo más el medio adecuado, esperar que los espermatozoides
suban despuñes de una incubación de 1h, a partir de aquí recogemos los espermatozoides
de la superfície del tubo. Mejoramos la calidad pero el nº de espermatozoides baja.
b. Gradiente de densidad percoll: hacemos un gradiente de 45 a 90% y luego centrifugamos.
Las células más densas se quedan en la zona más densa (mejor calidad y viabilidad).
Sistema más eficaz respecto al nº de células, pero la calidad es peor que con el swim-up.
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Sistema de capacitación in vitro
Agentes estimulantes de la motilidad – Puede utilizarse cualquier medio que favorezca el movimiento
(dependientes de la especie). El medio debe ser isotónico y tener fuentes de proteína y energía. Además
en función de la especie pondremos un agente capacitante u otro (permitirá eliminar las .....................
permitiendo la perdida de factores de capacitación). (muchos/ calcio ionóforo-------favorecen la entrada
masiva de calcio--------reacción acrosómica (muy poco fisiológica).
Factores que afectan la capacitación:
Tª, procedencia de los espermatozoides, uso de semen fresco o congelado (pre-capacitación, la causa de
los cambios de congelación----cambia Tª y agentes), variaciones inter/intraespecíficas, presencia del
cumulus, composición del medio de capacitación.
Eficacia del sistema de capacitación:
 Técnicas................... (microscopía)------tinciones
 Técnicas fluorescencia (directas: lecitinas, indirectas)
 Fijación espermatozoide-ovocito
 Pigmentos ovocitos
3.- Fecundació
Penetració d’un oòcit per part d’un espermatozoide capacitat amb la finalitat d’obtenir un zigot viable.
Formació de cèl·lules diploides totipotents a partir de l’oòcit + espermatozoide. La fecundació es divideix
en diferents fases:
Penetració del cumulus oophurus – No totes les especies in vivo. Els remugants perden les cèl·lules del
cumulus. Tot i això, és necessari in vitro per tal de fer una selecció dels espermatozoides per agafar els
capacitats (pre-filtre tot i no ser imprescindibles).




Interacció i penetració de la zona pel·lúcida (A):
o Reconeixement espermatozoide – oòcit i fixació o adhesió a la zona pel·lúcida
o Reacció acrosòmica de l’espermatozoide
o Penetració de zona pel·lúcida
Fusió de les gàmetes (B)
Activació de l’oòcit (C)
o Bloqueig de la poliespèrmia
o Canvis nuclears
Formació, desenvolupament i migració dels pronuclis (PN) i primera divisió mitòtica (D)
(A) Interacció i penetració de la zona pel·lúcida: L’espermatozoide quan arriba a l’oòcit veu que hi ha
una barrera proteica que evita la fecundació interespecífica (zona pel·lúcida). Tot i que a vegades
es veuen fecundacions d’individus d’espècies molt properes. Això es fa amb els receptors
glicoproteics específics de material de l’espermatozoide. Perquè es faci el reconeixement entre
zona pel·lúcida i espermatozoide cal que hi hagi hagut prèviament la capacitació (si no no es
podran unir). El procés es divideix en:
a. Primer contacte (aproximació)
b. Etapa de segon contacte (Zp3-espermatozoide) quan l’espermatozoide s’uneix a la zona
proteica de Zp3 i es produeix la reacció acrosòmica hi ha una nova unió coneguda com a
secundària (procés de reconeixement d’algunes molècules de la membrana acrosomal
interna a partir de la Zp2 i s’ha produït la sortida dels enzims acrosomals que permeten
degradar i penetrar la zona pel·lúcida).
La penetració de la zona pel·lúcida per tant, serà selectiva entre espècies i és molt ràpida. Es
produirà per l’acció enzimàtica peroòtambé la mecànica (hipermotilitat).
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(B) Fusió de les gàmetes – És imprescindible perquè es produeixi la fusió de les gàmetes que
l’espermatozoide estigui reaccionat. La penetració per part de l’espermatozoide s’uneix a les
zones on hi ha microvellositats de membrana de l’oòcit (mai anirà a nivell d’on està la zona
metafàsica---en està el nucli femení). La fusió es produeix entre la membrana plasmàtica de
l’espermatozoide i la de l’oòcit. Aquesta segona l’envoltarà. Entrat tot cap i cua però la cua
rapidament es desprèn.
(C) Activació de l’oòcit: implica una activació del metabolisme. Quan es fusiona l’espermatozoide
amb l’oòcit es produeix:
a. Entrada de sodi-------canvi de potencial de membrana-----bloqueig ràpid PS en segons
b. Estimulació tirosin quinasa -----activa fosfolipasa C-------producció IP3----sortida de Ca
del
RELl
intercanvi Na i H-----augmenta pH intracelular
Estimulació de: sintesi proteica, replicacio ADN, moviments citoplasmàtics de material
Morfogenètic
*excositosi GC------bloqueig de la poliespermia
**: GC---- granuls corticals marxen fins a la periferia i deixa anar el contingut dels mateixos
Quan es fusionen les membranes i l’oòcit es polaritza+------primer bloqueig de poliespèrmia. Desprès a
dos nivells:
Bloqueig vitelí----canvis a membrana plasmàtica de l’oòcit
Zona pel·lúcida-----reacció cortical
-----reacció zonal: modificació de la composició de la zona pel·lúcida
Inhibició oligosacàrids Zp3
Trencament Zp2
............de la estructura de la ZP
Gos, ovella i hàmster------reacció zonal principalment
Ratolí i rata----ambdues
Conill: principalment vitelí.
(D) Evolució dels pronuclis:
a. Pronucli femení: metafase II----anafase II-----telofase II----citoquinesi – Oòcit + 2n
corpuscle polar (cromosomes coberts de membrana, sol ser mes petit de mida i no sol tenir
grànuls a diferència del 1r corpuscle polar).
Desprès d’això els cromosomes es descondensaran i s’envoltaran de membrana nuclear----forma de PN.
b. Pronucli masculí: separa cap i cua-----degeneració de membrana nuclear------descondensa
cromatina.
c. Inflament del cap i pèrdua de proteïnes-----regeneració d’ADN i empaquetament al voltant
d’histones femenines.
Desprès els pronuclis migren al centre-----es condensen els cromosomes-----profase----metafase----anafase-----telofase i formaciò de membrana cel·lular----formació d’un material genètic únic------zigot----embrió.
TÈCNIQUES IN VITRO:
1) Fecundació in vitro: senzilla, s’intenta produir la fecundació al laboratori imitant al màxim les
condicions del tracte reproductiu femení.
2) ICSI: injecció intracitoplasmàtica d’un espermatozoide a l’oòcit. Posem espermatozoides a medi
molt dens, amb una pipeta es trenca la part intermitja de la cua i s’absorbeix amb la pipeta. Fixem
l’oòcit per no moure’l col·locant els corpuscles polars a 12 o a les 6 hores (ja que la placa es
metafàsica es propera de la mateixa----evitem problemes) i fem la microinjecció a les 3h
(trenquem cap i cua perquè fem una semiactivació---degradacio de l’oòcit ja que no fa la reacció
normal).
Alguns oòcits (depèn de la especie) s'activen amb la punxada (ex. Truja), però d’altres necessiten ser
activats químicament després de fer la ICSI (ex. Cabra i vaca). Risc de partenogènesi (haploids).
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Avantatges: tractament d’infertilitat masculí
Funciona molt bé amb semen congelat, deshidratat, procedent de testicle, epidídim,
immòbil....
Reproducció d’animals morts (només agafem material genètic)
Evita la poliespèrmia (assegurem que nomès 1 espermatozoide entra).
3) SUZI (Sub-zona-injection): injecció de 3-5 espermatozoides en l’espai perivitelí. Augmenta
poliespèrmia.
4) 4) PZD (dissecció parcial zona): foradem la zona pel·lúcida de dos maneres:
a. Enzimàticament
b. Mecànicament (no injectem res amb agulla) o solució química.
S’utilitza semen amb baixa motilitat o baixa [espermatozoides].
Avaluació de fecundació in vitro (FIV):
1) Presència dels 2 corpuscles polars a l’espai perivitelí. S’han activat. No sabrem si la reacció i el
procés és adequat.
2) Divisió i formació de dos blastòmers d’igual mida i forma, sense fragmentacions
3) Tincions------ens assegurem de una fecundació correcta (veurem pronuclis i cua espermatozoide).
Tot i això ens haurem carregat el zigot. Només serveix per mostreig.
4) Gestació i naixement d’un individu viu. No aplicable perquè és lent.
Anomalies de la fecundació (in vitro): embrions arriben fins a blastòcit.
 Poliespèrmia-----entra més d’1 espermatozoide a l’oòcit. A causa de l’augment de
[espermatozoide] per fecundar els oòcits. O bé els oòcits no són madurs o ho estan massa. (es
produeixen els processos abans fent així que no serveixin a posteriori).
 Poliginia (més d’un pronucli femení)---no s’extrueix el primer o el segon corpuscle polar i
funciona com un nucli més.
 Partenogènesi: desenvolupament d’un oòcit sense actuació dels espermatozoides---haploides.
 Asincronia en el desenvolupament dels pronuclis: retard en el desenvolupament del pronucli
masculí.
 Preactivació del citoplasma: divisió del citoplasma abans de la divisió nuclear.
Factors que afecten l’eficàcia de fecundació in vitro:
A) Semen:
a. Mascle: important font de variació. Pot ser degut a diferències en la composició dels
plasma seminal.
b. Sistema de capacitació dels espermatozoides
c. Quantitat i qualitat dels espermatozoides en el medi de FIV. Suficient per a aconseguir
màximes penetracions i minimitzar la poliespèrmia (2 milions d’espermatozoides).
B) Oòcit:
a. Femella (estat hormonal...)
b. Sistema de maduració , fecundació correcta: oòcit madur nuclear i citoplasmàticament.
c. Oòcits en el medi de FIV
d. Presència de cumulus, ja que es creu que corregeix deficiències en el medi de capacitació,
creant un microambient adequat per l’espermatozoide i evitem l’alliberació prematura de
GC.
C) Condicions del cultiu:
a. Tª: la FIV és un procés Tª depenent (38-39ºC). No menys de 37ºC
b. Llum: formació de radicals superòxid.
c. Atmosfera gasosa: 5% de CO2 en aire o bé 5% de CO2, 5%O2 i 90% de N2.
d. Temps de............de les gàmetes: suficient per completar la reacció acrosòmica i maduració
citoplasmàtica. NO................que els enzims hidrolitics alliberats pels espermatozoides
morts. Generalment 12-24h.
e. pH: 7.2-7.8
MANIPULACIÓ EMBRIONÀRIA
f. Osmolaritat: 280-320 mOsm
g. Medi de FIV: hi ha molts. Cada laboratori utilitza el que més li agrada: tyrode’s, TALP,
TLM, 199 SOF (molt utilitzat per cultiu i fecundació------imita fluid oviductal de ovelles):
h. Sistema FIV: microgotes, pouets, palletes...Els dos primers son els més freqüents.
i. Cèl·lules en el medi (oviductals, granulosa...) en suspensió (no formant monocapes).
Corregeixen deficiències en la capacitació i milloren qualitat de l’embrió en maduració de
factors embriotròfics.
j. Suplements del medi de FIV: heparina, etc...
4.- Desenvolupament embrionari
Funcions de la zona pel·lúcida:
Evitar l’atac immunitari.
Evitar implantacions prematures (ha d’envoltar l’embrió fins que no arribi a matriu).
*les primeres divisions no augmenten la mida sinó que disminueixen la mida de les cèl·lules perquè es
divideixen.
Rellotge biològic regit pel temps, no pel nº de divisions.
Totipotència: cada blastòmer podrà produir un individu complet. Desprès les cèl·lules dels embrions
perden aquesta funció.
L’oòcit té més mitocòndries, proteïnes i ARNm que les cèl·lules somàtiques, Els primers estadis, corren a
càrrec dels gens materns (...........desenvolupament). Més tard es produeix un canvi i corre a càrrec dels
gens embrionaris el desenvolupament de l’embrió (aquí les divisions són més lentes).
L’ADN mitocondrial només és matern i no es replica fins ala implantació.
Si les condicions de cultiu són adverses, es produeix un blocatge del desenvolupament. No totes les
espècies canvien el control del desenvolupament de mare a embrió en el mateix moment: ratolí----2
cèl·lules; humà-----8 cèl·lules; vaca------8-16 cèl·lules.
Podem fer biòpsia d’embrions-----el forat el podem fer amb àcid o amb rajos làser. Desprès de fer el forat,
fem una captació dels blastòmers.
Apareix el fenomen IMPRINTING. Se sap que els gens paterns controlen membranes accessòries i els
gens materns controlen més el desenvolupament de l’embrió. Això s’ha fet amb estudis:
 Androgenat ( 2 pronuclis masculins)
 Ginogenat (2 pronuclis femenins)
 Zigot normal
 Canvis de 1 pronucli masculí per un altre masculí i 1 femení per un altre femení.
En tots els fetus es desenvolupa normal i tot es forma normal. Tot i això en els dos primers casos no hi ha
naixement. En el primer cas no es forma la massa fetal però si placenta, en el segon cas es forma fetus ok
però no correcta formació de placenta.
Formació morula: Polaritzar i compactació
Passem a una massa de cèl·lules incomptables. Als primers estadis (2-4-6 cèl·lules) veiem que no hi ha
simetria de contacte en els blastòmers. Quan augmenta el nº es veuen dos poblacions de cèl·lules: unes
que queden a l’interior (contacte amb altres cèlules per tota la superfície) i unes que queden a l’exterior i
només contacten amb cèl·lules pels costats i per la zona interna (la ovomorulina reorganitza aquestes
cèl·lules).
Les cèl·lules internes----gap-juntions
cèl·lules externes---fright juntions
Les cèl·lules polaritzades agafen una morfologia similar a les cèl·lules basals i s’aplanen, fluxe d’ions de
l’exterior a l’interior, el nucli va ala zona basal 8poden formar sincitis i cèl·lules polinucleades), etc.
La compactació implica la pèrdua de la totipotència.
Quan les cèl·lules s’han diferenciat en polar i apolar, es produeix l’entrada d’aigua i es produeix la
cavitació (que pot entrar de manera externa i de manera metabòlica). La cavitat cada cop es fa més gran.
MANIPULACIÓ EMBRIONÀRIA
De






manera
que
tot
es
reorganitzarà
Trofoectoderm polar
Trofoectoderm mural
Endoderm primitiu
Zona pel·lúcida
Massa cel·lular interna (cèl·lules petites, augmenta índex mitòtic i mobilitat)
Blastocele
i
produirà:
La implantació es produeix per una zona allunyada de MCI. El blastocit augmenta de mida fins que és
excessiu---expansió i exclusió (sortida del blastocit de la zona pelucida----es creu que no nomès depèn del
tamany de la cèlula sinó també d’enzims interns i embrionaris).
Assited hatchig
Si la zona pel·lúcida és massa dura i no pot despendre’s de la mateixa, per tant no podrà implantar-se.
Caldrà ajudar mecànicament a aprimar la zona pel·lúcida o bé es fa un forat. Es pot fer de forma química
(àcids....), mecànica (dissecció parcial de zona pel·lúcida), làser (forats molt nets a zona pel·lúcida).
Disgregació blastomers: (primers estadis del desenvolupament)
El que caldria és fer degradar la zona pel·lúcida i es posar els embrions en medis alterats com:
 Medi sense calci ni magnesi: ovomorulina (proteïna d’adhesió que uneix la membrana amb els
microfilaments dels citoorg.) és calci depenent (cèl·lules separades).
 Medi amb LDP-galactosa: neutralitza la galactoniltransferasa (uneix radicals galactosa de
les...................de membrana de cèl·lules veïnes)------blastòmers separats.
Valoració del desenvolupament i viabilitat embrionaria:
 Gestació i naixement
 Observació morfològica del blastocist (color, fragmentació, alteració d’alguna cèlula)
 Tinció de nuclis------molt bo per recerca(¿?) però no per altres coses perquè matem l’embrió.
 Estudi del mb (¿?) embrionari.
Cultiu in vivo d’embrions:
S’agafa l’embrió, es manipula i es posa en una femella intermitja per desenvolupar una mica l’embrió i
desprès es torna a una femella definitiva. Aquest procés no és espècie-específic. (homòleg o heteròleg).
Solen transferir-se de 5-20 embrions.
La durada del cultiu és màxim 4 dies. Hi ha un bon desenvolupament però cal pensar que cal
infraestructura correcta per fer transferències, hi ha augment de pèrdues i és una tècnica feixuga.
Cultiu in vitro: No moure els embrions de la incubadora durant el temps de formació. No tocar-los.
Hi ha tota una sèrie d’etapes crítiques: -activitat genoma embrionari
- Compactació de la mòrula
- Formació del blastocist.
Caldrà controlar:
 La qualitat de l’aigua: aigua bi o tridestilada.
 pH (7.2-7.4). Factor depenent de l’espècie. Posem tampons, si estan més temps al medi ambient
HcPC-S i es posa en condicions de conservació---HCO3/ CO2.
 Osmolaritat: molt important la quantitat de NaCl del medi. Depèn de l’espècie i etapa del
desenvolupament.
 Llum (radicals superòxid): PABA protegeix embrions.
 Tª: 37-39ºC
 Atmosfera gasosa (depèn del cultiu utilitzat): 5% CO2 aire, 10% CO2 aire i combinació. Si > 20%
O2-----formen peròxids i superòxids----peroxidació lipídica de les membranes cel·lulars,
inactivitat d’enzims i alteració de l’ADN (sobretot a bovins----augmenta quantitat de lípids). Pot
morir l’embrió. Per controlar la formació de radicals d’O2: <O2, antiòxid, radicals lliures ,
quelació de metalls pesats).
 Cocultius amb cèl·lules:
o Beneficis: es produeixen substàncies mitògenes i embriogeneradores.
o Síntesi i alliberament de productes utilitzables per l’embrió.
o Disminució de la concentració de substàncies embriotòxiques acumulades al medi.
o Productes que ajuden a la diferenciació cel·lular.
*molt fàcil les contaminacions
Les cèl·lules somàtiques més utilitzades: cumulus granulosa, cèl·lules oviductals, fibroblast uterins i testis
(mòrules i blastocits----estadis tardans de desenvolupament pre-gestacional), uterines, cèl·lules del sac
amniòtic i vesícules trofoblàstiques (millar en els primers estadis de desenvolupament. Tot i que cal crear
altres embrions per aconseguir-ho).
Els beneficis no són especie específics ni teixit-específics. El que si que és important és l’edat del
cocultiu.
 Sistemes de cultiu: consisteix en cultivar embrions en grup----interacció cooperativa. Amb
microgotes, plaques, o tubs tapats. Un cultiu embrionari pot durar setmanes. Això el que fa és
induir a pensar en si cal o no canviar el medi (factor depenent del laboratori).
 Medis de cultiu, poden ser:
o Simples
o Complexes (bàsic + proteïnes+aa+nucleòtids+etc...)
o Medis definits (conèixer la composició exacta)
o Medis indefinits
o Medis condicionats (exposició prèvia a un cultiu cel·lular). Caldrà filtrar el medi per evitar
contaminacions.
 Suplements medis de cultiu:
o Substàncies energètiques:
 Pir, lact, glucosa
 AAs
 Ac greixosos (acetat) per remugants 8per tal d’imitar la composició de la sang en
remugants a on és molt alta).
o Suplements sèrics (SFB, SFZ, SS, BSA...). Això fa que sigui font de variació, font de
.................., L ...................., proporciona factors de creixement. Efecte trifàsic----inhibeix
les primeres divisions embrionàries (desprès funciona OK):
o Factors de creixement.
Diferències de desenvolupament in vivo i in vitro:
o Els embrions produïts in vitro ......................i desenvolupament endarrerit.
o En in vitro: bloqueig del desenvolupament.
o Blastocist d’aspecte normal però: < nº cèl·lules, <................................, supervivència a la
transferència baixa.
o Ultraestructuralment: augmenta vacuolització citoplasma
 Disminució unions entre cèl·lules
 Augmenta nº..........................
 Disminució de l’espai perivitelí
 Grandàries i formes de blastòcit diferents.
 Blastocits formats per cèl·lules opaques i irregulars.
5.- CRIOCONSERVACIÓ
Manteniment que es dur a terme a -196ºC. Manteniment indefinit en el temps, inactivació total del
metabolisme. Un manteniment en crioconservació permet una conservació indefinida (mantenen la
mateixa viabilitat. Només es podria veure afectat per les radiacions ambientals).
Tener el embrión en un medio líquido con un medio de composición desconocida puede alterar el
desarrollo. No es una adecuada metodología (Ex: síndrome del ternero gigante). Tampoco hace falta
mucho tiempo, simplemente un par de horas en un suero a 37ºC alarga la gestación-----ternero será más
grande.
Los primeros embriones crioconservados que dieron lugar a un nuevo individuo fue en 1972 con ratones.
El primer embrión humano crioconservado que dio lugar a un individuo fue en 1983.
La crioconservación en la especie porcino es un desastre puesto que son muy ricos en lípidos, de manera
que cuando se disminuye la Tª los lípidos se oxidan y matan al embrión. Aún así hay alguno que ha
aparecido.
Por especies:
 Rumiantes: aumenta la resistencia en mórula y blastocisto joven.
 Vaca: en forma de blastocisto joven
 Caballo: hay muchas dudas pq se hace poco y porque la hembra no superovula. De todas maneras,
el embrión de caballo tiene un gran amaño dificultando la crioconservación.
 Cerdo: es un drama debido a la composición lipídica aumentada. Es una especie en la que se
puede seleccionar la linea materna y la paterna. Si se mejorara podríamos sacar mucho partido a la
selección genética.
 Ratón: funciona muy bien
*La mayoría de los embriones que se transfieren son en estadío de mórula, blastocisto joven-----será
necesario que la hembra tenga un cuerpo lúteo de 5-6 días.
El ovocito es la fase embrionaria más sensible a la crioconservación (esto tendrá interés en caso de
especies en peligro de extinción). Como es muy complicado, lo que se intenta es crioconservar parte del
ovario (donde se incluyan folículos primarios). Luego se trasplanta en peritoneo (humana).
Otras fases embrionarias sensibles pero no tanto son los embriones en estadios de 3-4 células (las cuales
son a su vez más sensibles que en el estadío de mórula o blástula). Embriones con menos células------más
sensibles.
Los embriones producidos in vitro no crioconservarán adecuadamente pq los estamos poniendo en
medios con lípidos, causando la muerte por oxidación de lis mismos en crioconservación.
Son tan sensibles los ovocitos en vesícula germinal como los que están en metafase II. En el primer caso
se puede solucionar con una ICsiE. En el segundo caso se altera el huso acromático deshaciéndose,
después de la crioconservación puede volver a generarse pero mal, causando anomalías en el individuo
en cuestión (alteraciones cromosómicas....)
La fase de Tª crítica es el paso de 22ºC a 0ºC ya que es a la Tª a la que se oxidan los lípidos. Sabiendo
esto, se han ideado mecanismos para que el embrión pase el mínimo tiempo posible a estas temperaturas.
La separación entre el tiempo de obtención de los embriones y su transferencia implica para el ganadero:
mejora genética más intensa, transporte internacional aun con menos riesgo, peligros de transmisión de
enfermedades y un abaratamiento de los costes muy marcado. Para que el embrión sea adecuado debe
tener toda la zona pelúcida adecuada y rodeada con enzimas proteolíticos (que eliminen la posible
presencia de bacterias...), permite también un manejo adecuado en la explotación (frente a la transferencia
de embriones en fresco----en este caso, no sabríamos cuantos embriones hay, de manera que podemos de
manera incierta aumentar los costes de la explotación puesto que debemos sacar a las hembras de su
inicio normal y de los programas establecidos).
En cuanto a los conceptos genéticos, sabemos que podemos hacer una mejor selección genética (los
cuales
pueden
evaluarse),
permiten
un
seguro
biológico
y...............................................................................................
En cuanto a los factores negativos: irregularidad de superovulación, el resultado tras transferencia
tampoco lo conocemos. Es importante no aplicar estas técnicas en granjas que ya de por si son un
desastre, ya que el sistema no funcionará bien. Debemos ser muy estrictos con los procedimientos aunque
vayan en contra de lo indicado por el ganadero (valorar las cosas):
Hay que destacar (para conservar a los embriones una vez obtenidos)----principios criobiológicos:
 Propiedades cel-ligativas (¿?) de las soluciones acuosas (presión osmótica, punto de congelación,
punto eutéctico (¿?), etc.) Un embrión contiene > 70% de agua (mucha de la cual no es libre).
 Transporte de calor y agua entre los ambientes intra y extra celular.
 Destino del agua intracelular (necesario que no congele, pero no es suficiente).
El ambiente acuoso intra y extracelular están separados por una membrana. La célula como solución
acuosa tendrá una presión osmótica (cambios de [electrolitos]), punto de congelación (Tª <0ºC puesto que
está asociada con nódulos, la Tª la que toda la solución acuosa congela es en punto eutético----la solución
se va congelando progresivamente desde el punto de congelación hasta el punto eutéctico)---inicia la
congelación.
Si un embrión se somete a frío habrá un transporte de calor/frío entre el medio extracelular e intracelular.
Por definición suele ser desde el líquido extracelular al intracelular (de fuera a dentro).
El embrión tendrá capacidad de respuesta osmótica. Pudiendo equilibrar los procesos intra y extracelular
mediante el transporte de agua.
Gracias a todos estos mecanismos el embrión podrá resistir al proceso de congelación. Es necesario que el
agua que forma parte del embrión no congele formando cristales puesto que el animal morirá. Debemos
cambiar el fluido por otro. Es importante pero no es suficiente. Quitar el agua de la célula----sería el
primer `pensamiento pero no sería el correcto porque se deshidrataría. Para evitar esto, lo que se
promueve es cambiar el agua de la célula por sustancias crioprotectoras que bajen el punto de congelación
y punto eutéctico y además tengan propiedades de estabilización de la membrana (Ex: etilenglicol.
Propilenglicol, glicerina, dimetilsulfoxido, polenglicol-----todos deben no ser tóxicos).
Así si partimos de una célula normal (21ºC), cuando aplicamos:
 5ºC: la parte que está cerca del recipiente antes bajar la Tª hasta llegar al medio. Cristaliza el
medio extracelular inicialmente haciendo así que se convierta en un medio higrosmótico de
manera que la célula responderá extrayendo el agua intracelular. Los cristales se formaran por
nucleación (los cristales de hielo crecerán alrededor del embrión).
 Si continuamos el proceso de manera lenta obtendremos unos cristales extracelulares grandes y la
célula estará seca.
 Si hacemos un proceso rápido no damos tiempo a la célula a que pierda el agua (es más rápida la
entrada de frío), de manera que algo de agua queda en el interior------Tª eutéctico formará cristales
muy grandes.
 Si es ultrarrápido el embrión acabará muriendo por culpa de la cristalización del agua.
*Una tasa óptima de enfriamiento es lenta 0.2-0.8ºC/minuto. Esto es en el caso del embrión (puesto que la
tasa de enfriamiento óptima será mayor en función del tipo celular).
Los efectos lesivos que pueden matar al embrión: deshidratación excesiva, planos de fractura de cristales
de hielo o la formación de hielo intracelular (principal causa de muerte embrionaria).
Fases comunes:
 Recuperación embrionaria
 Añadir crioprotectores (a Tª ambiente o si son tóxicos añadir alrededor de 4ºC). Los agentes
crioprotectores sustituirán a parte del agua intracelular. Deben añadirse antes de congelar y
pueden clasificarse como permeables o impermeables. Los primeros entraran en la célula
(glicerina, etilenglicol, propanodid-----formaran un medio hiperosmótico que permitirá la salida
de agua). Los segundos (sacarosa, albumina, PVP) crearán un medio hiperosmótico pero no
entraran a la célula. Así la célula responderá disminuyendo el volumen-----perdiendo agua y
recogiendo agentes permeables anticongelantes. Para congelarlo hay que introducirlo en
recipientes de congelación que son las pajuelas de inseminación siendo el recipiente ideal (poco
volumen y aumento de superficie)---transmisión de calor homogénea.
 Congelamiento o inducción del huso extracelular (seeding): Este paso de bajar la Tª puede hacerse
rápido. Cuando llegamos a Tª de -5ºC hay que ir más lento para evitar problemas. Por lo tanto, hay
que hacer un enfriamiento lento (0.-0.8ºC/min) hasta -40/-80ºC.
o Como no sabemos cuando va a empezar la congelación del embrión, lo que hacemos es
promover la congelación y cristalización extracelular con la técnica de Seeding (siembra
de cristales de hielo). Con una superficie a Tª de nitrógeno líquido se toca la superficie y se
crean cristales de hielo que van creciendo o bien se meten en máquinas automáticas de
congelación (programándolas). Una vez hecho esto, lo que se hace es ir bajando poco a
poco la Tª (0.2-0.8ºC/min) hasta llegar a -40/-80ºC. Teniendo una curva de enfriamiento
que puede ser parada cuando queramos. Si paro a -40ºC todavía queda mucho agua
intracelular, mientras que a -80ºC ya habremos bajado bastante la cantidad de agua
intracelular.
 Después de llegar a -80ºC podemos almacenarlo a nitrógeno líquido -196ºC (el paso de -80ºC a 196ºC no afecta porque ya habremos llegado al punto eutéctico)
 Cuando el embrión se quiere transferir debemos descongelarlo. Hay que aplicar una
descongelación lenta que permita que el embrión vuelva a captar toda el agua (lo contrario que
pasaria con una tasa de descongelación rápido----podría acabar reventando la célula).
o Una descongelación lenta implicaría sacara la pajuela de -196ºC a un congelador de -20ºC,
luego a una de 4ºC y por último a Tª ambiente.
o Si en vez de -20ºC pasamos a -40ºC, todavía queda agua dentro del embrión, problema no
incompatible con la vida del embrión, siempre y cuando la descongelación sea ràpida
puesto que si la hacemos lenta favoreceríamos al crecimiento de los mismos, pq actuaran
como núcleo------tasa de congelación dependiente de la Tª a la que paramos el proceso.
 El último paso antes de transferirlo implicará rehidratarlo y sacar los crioprotectores del interior.
 Transferencia a hembras receptoras
 Nacimiento
*Eficacia: 1 a 2 embriones da lugar a un nacimiento, el el caso de la transmisión en fresco es del 5560% (un poco más alta que a Tª ambiente?). Ideal que si hay vacas receptoras hagamos la
transferencia en fresco y congelar los sobrantes.
*Un embrión congelado vendrá a -196ºC (generalmente parado a -40ºC). En granja deberemos
descongelar rápidamente (introducir agua caliente), una vez lo está movemos la pajuela para mezclar
los contenidos (ya que llevan sustancias que sacan los crioprotectores) y se transferirá como un
proceso de inseminación normal.
Rehidratación:
o Con crioprotectores no permeables
o En varios pasos
o Con etilenglicol no sería tan necesario
o Dilución en 1 paso.
Hay toda una serie de estadios que han permitido un desbancamiento a la técnica de equilibrio. Hay
diferencias:
o Vitrificación: una solución pasa a estado sólido formando una estructura amorfa sin
cristalización de características físicas similares al vidrio (transparente-----moléculas no
organizadas como un cristal-----son transparentes, no opacos ni translúcidos). Procedimiento
muy válido en células muy sensibles al frío (embrión de cerdo, ovocitos, ovocitos alterados,
etc.). Esta técnica consiste en someter al embrión a soluciones con [] de agenetes permeables y
no permeables muy muy muy elevadas, consiguiendo que a Tª ambiente o un poco más bajas
el embrión perdiese agua y se produjese la entrada de mucho agente crioprotector (un 40% de
agua se perderá y se perderá un 30% de volumen). El problema está en que las soluciones que
aplicamos son tan concentradas que pueden llegar a ser tóxicas (el tiempo de exposición ha de
reducirse muchísimo-----segundos). Después se mete en nitrógeno líquido. El proceso total
dura 1 minuto como mucho siendo un proceso rapidísimo. No hacen falta procedimientos
sofisticados, será barato y permitirá mejoras con respecto a las células sensibles l frío.
6.- Sexaje de embriones y espermatzoides:
Si sexamos un espermatzoide podremos predeterminar el sexo del embrión. Si sexamos un embrión es
un diagnóstico del sexo, la única forma de manipular el embrión sexado sería eliminándolo o
transfiriéndolo. Así pues, lo mejor es predeterminar. No será aplicable el sexaje hasta que no
dominemos la técnica de transferencia para buscar aplicaciones rutinarias que led en un alto valor
comercial. La transferencia de embriones será de provecho cuando consigamos hacer bien el sexaje.
El sexaje ya adopta importancia a nivel del siglo V a.C.
*se ha demostrado que en humana, que madres estan sometidas a un gran estrés tienen mayores
posibilidades de engendrar una niña.
Las
características
que
deben
cumplir
 Rápida
 Exacta
 Eficaz
 Sensible
 Mantenga viabilidad
*en cuanto a exactitud hablamos de un 90% de exactitud.
las
técnicas
de
sexaje
son:
Diagnóstico del sexo: se puede hacer con células preimplantacionales aunque también puede hacerse en
embriones implantados (muy frecuente hacer amniocentesis en humanos de más de 40 años para analizar
las células que permitan saber si sexaje y alteraciones cromosómicas).
Si es embrión preimplantacional, se sexa el animal mediante biopsia------importante cualificación técnica.
A partir de esta podemos aplicar:
 Cariotipado( vemos todo el mapa cromosómico incluyendo los cromosomas sexuales). Tarda
mucho (1 semana+/-), no será efectivo. Las células tendrán que estar obligatoriamente en mitosis
(pocas células estarán en esta fase). Nadie lo suele hacer a no ser que se busquen anormalidades
cromosómicas. A pesar de ello es técnica muy exacta (poco eficaz).
 Detección del antígeno H-Y. Método no invasivo (Dx sin hacer biopsias sobre el embrión
completo. Se busca mediante inmunología las moléculas correctas).


Detección de enzimas ligadas a cromosoma X: hay un período de tiempo (hasta mórula), hay
doble manifestación de cromosoma X siendo más alto que en machos (antes de que 1 de los 2 se
inactive). Es un poco peligroso por la adición de antígenos sobre el embrión.
Hidratación in situ (FISH): son fluorescentes y muy aplicativas en humana. Se hace un FISH a
células biopsiadas del embrión o resultantes de amniocentesis. E hace en todos los embriones
producidos in vitro. Esta permite detectar cromosomas específicos aplicando diferentes
fluorocromos (algunos autosómicos para valorar las anomalías cromosómicas y las sexuales).
También permite valorar alteraciones en el nº. Se usan sondas compatibles del cromosoma
específico anexionadas con una sustancia conocida como fluorocromo.
*En veterinaria los embriones pueden comprarse sexados, mediante FISH i hits de amplificación de DNA
para hacer PCR. Aplicándolo en células embrionarias o de amniocentesis. Ambas son rápidas, exactas,
eficaces y en el caso de PCR muy sensibles. Incluso podemos valorar marcadores de fertilidad o
productividad-----aumenta el precio del embrión.
Predicción del sexo:
Hay diferentes técnicas que pueden reducirse a 1 como la más importante siendo la técnica de citometría
de flujo con separación de células (puede resultar muy caro el aparato teniendo una marcada limitación).
Lo que se ha hecho es modificar los citómetros convencionales con detectores de fluorescencia------diferente el espermatzoide con dotación X o Y. La detección de DNS en espermatozoide con X o con Y
hay una leve diferencia de 3.8% de total del DNA (un cromosoma X tiene un 3.8% + de DNA que un
cromosoma Y). Si marcamos con fluorescente el cromosoma, solo aquel que tenga X tendrña más
fluorescencia. Principalmente se aplica en la especie bovina (la más importante).
Un semen sexado costarà muchísimo más, el factor a favor es que el beneficio será altísimo
*la tinción fluorescente irá hacia DNA, las células más pesadas se cargan +. Al final del detector se
creará como una pila para separar los + de los -. Generalmente los espermatozoides X se cargaran +.
Aún hay que valorar: el proceso es muy lento, necesitamos muchos espermatozoides para inseminar,
baja la viabilidad-------limitaciones para aplicarlo (era bien para fecundar in vitro IPSY, también irá
bien en inseminaciones profundas----lo más cercanas al oviducto).
En humana esto se prohibe en muchos países. Aunque en USA es factible hacerlo.
Ética en la selección del sexo:
En veterinaria no hay mucha, queda muy obsoleta y marcan las pautas mínimas. Por contra, en humana
esto es prácticamente imposible porque las leyes se renuevan continuamente. La idea es evitar que la
ciencia sobrepase lo necesario para estudios.
TRANSGÉNICOS, CLÓNICOS:
Un animal transgénico es un animal que tiene una molécula de ADN recombinante producida en el
laboratorio que se incluye en su material genético. En animales transgénicos nos interesa que las proteínas
transgénicas tengan un promotor de glándula mamaria para aumentar la cantidad de leche.
Son animales que tienen un gen o varios genes extras o bien aquellos a los que se les inhibe la expresión
de un gen knock-otu (para conocer el funcionamiento de una hormona u otras sustancias que estén en
supresión).
El primer animal transgénico de animales de producción es en el 1982 en el que aparece el ratón
transgénico de hormona de crecimiento. En 1985 se hacen los primeros transgénicos en ovejas y cerdos
mediante microinyección del gen en el zigoto (pronucleo masculino). En el 1987 clonación (utilización de
blastomeros para repetir el genoma----animales identicos), 1997 oveja clonada (Dolly), 1998 se producen
las transferencias de información con virus, incluso se transmitían partes de cromosomas enteros
(acoplando genes sueltos). Actualmente se baraja la posibilidad de crear un individuo que tendrá todo su
material genético creado artificialmente.
Para hacer animales transgénicos es necesario que la ciencia de la creación de genoma y los de la
manipulación embrionaria vayan conjuntamente.
Los animales transgénicos se hacen con el objetivo de:





Aumentar la productividad: animales que sean más grandes y produzcan más carne------se probó en
ratones pero en animales de producción no era efectivo.
Resistencia a las enfermedades: sobretodo para los de producción intensiva----para evitar tener que
matar muchos animales en el caso de la aparición de las mismas. Es un proceso que simularía el
nacimiento de los animales ya con anticuerpos. Como esto es complejo, lo que se hace es favorecer
que salga a través de la leche y los lechones vayan poco a poco inmunizándose. Actualmente, en las
vacas lecheras muy productivas se intenta evitar la manifestación de las mamitis.
Modelo para las enfermedades humanas: el ratón es un animal muy alejado del ser
humano,actualmente se intenta buscar especies más cercanas al hombre ( no se han hecho ejemplares
de simio ya enfermos---motivos éticos.
Bioreactores: intentando producir proteínas de alto valor. Las cabras son el mejor modelo ya que son
los que producen mucha leche, sin problemas de mantenimiento. Muy interesante para producir
productos farmacéuticos en forma de proteína.
Utilizar a los animales para la donación de órganos (xenotransplantes). El más cercano es el cerdo.
Los objeticos son corazones y riñones. Es un punto de salida puesto que hay mucha demanda y poca
oferta. A pesar de todo, se ha frenado para encaminarse más hacia la medicina regeneratica (con la
utilización de células madre) puesto que hay menos riesgo de producir enfermedades.
Metodología de los transgénicos:
*hay que coger el gen transgénico e introducirlo para que luego se exprese en todas las células--introducción zigoto.
1.- Se debe hacer una microinyección del gen en un pronucleo del zigoto (se hace en el masculino pq es
más grande y visible. Sistema más rápido)
2.- Utilización de virus como vector de un gen: cuando el virus va a nivel intracelular inyecta todos los
genes en la célula. Da un poco de miedo, actualmente, sólo el pollo debe llevar a cabo esta metodología
para poder obtener un pollo transgénico (para que el virus inyecte el máximo de células germinales
60.000. como no todas las células se acabaran viendo inyectadas obtendremos animales quiméricos----luego se mezclan los animales quiméricos para obtener animales puros).
3.-Utilización de los espermatozoides como vectores: investigadores italianos pusieron virus a nivel de un
eyaculado de ratón que después se utilizó para hacer una fecundación in vitro. El problema era que los
genes extras que queríamos añadir y estaban en el medio quedaban en la superfície de la cabeza, no
entrando hasta el nucleo. Puesto que los espermatozoides no habrían hecho la reacción acrosomal.
Actualmente, podemos conocer cuales son los espermatozoides que captan la información y luego
favorecer una fecundación in vitro.
4.- Transferencia de nucleos: de una cèlula diferenciada mediante mecanismos in vitro se desprograma y
se dirige para que actúe como celulas totipotentes. Si a estas células somáticas, les introducimos los
genes---transgénicos. Si este nucleo lo cogemos y lo transmitimos a oocitos a los que previamente les
quitamos el nucleo, podemos obtener animales transgénicos----embriones transgénicos.


como no se sabía el grado de expresión del genoma, lo que se hacia era colocar grandes cantidades
de los mismos. Esto podia inducir: una sobreexpresión, efecto posicional (inhibiendo genes
necesarios y funcionales para el hombre). Inactivación insercional, aparición de mosaicos (el gen
no va a todas las cellas pq la meiosis no se ha hecho adecuadamente )---`problemas de la
microinyección que hace que sean menos efectivos.
* ratones, conejo...tienen citoplasma muy claro permitiendo la visualización del pronúcleo
adecuadamente. Cuando lo pinchamos veremos que se van inflando.
Por contra, en otras especies que presentan más lípidos es muy complicado saber donde se pinchan (EJ:
cerdo). Lo que se hace es centrifugar los zigotos a elevadas revoluciones por minuto, apartando todo el
citplasma y visualizando así el pronucleo del zigoto-----muy poca viabilidad ya que el zigoto sufre un
mayor estrés.
La microinyección en el zigoto se añaden 5000....../1-2 picolitros, son poco efectivas (1-5%) y muy
costosos en animales de producción (debemos.........al animal que habrá superovulado, hacemos lavados
de oviducto, recogemos zigotos en diferentes estadíos de evolución o incluso no fecundados, etc)..----muy complejo.
Los zigotos obtenidos in vitro, son mucho más sensibles pero más baratos y numerosos.
 la mayoría de los transgénicos se han obtenido por microinyección.
 Si microinyectamos y obtenemos una hembra-----sacamos piel para ver si tiene el gen
(transgénico). Para ver si el gen se expresa en la leche ha de madurar, ser cubierta, producir leche
y que la proteina se transmita a la descendencia (la hija de este primer animal debe llevar el gen)---- debemos esperar hasta F2 para ver los resultados. Los hermanos transgénicos se usan para
cruzarse entre ellos para fijar el gen. Es un proceso largo, hay que seleccionar bien a la especie de
uso para reducir costes.
Transferencia nuclear: ovocito en metafase 2 se saca todo el material genético obteniendo un citoplasto.
Por otro lado tenemos celulas somáticas desprogramadas y transgénicas. De todas estas solo algunas
tendran el genoma transgenico de manera que tendremos que buscarlas y conocerlas (habrá que colocar
marcadores que nos permitan identificarlas----fluorescencia , resistencia a Tª, resistencia a Ab, etc). Una
vez identificada las células transgénicas se coge toda la célula y se mete en el citoplasma enucleado.
Finalmente obtendremos el embrión transgénico (tenemos el conocimiento). Sabemos que ha habido una
mejor integración del material genético.
* es necesario valorar que la proteína está activa. Los animales hacen las modificaciones iguales a los
humanos para que la proteína sea activa. En cambio, las plantas no.