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Biología molecular
Talasemias

Estructura molecular de los genes aglobina duplicados
Regiones homologas: X- Y (4,2)-Z (3,7)
Entrecruzamiento
hacia la derecha
Entrecruzamiento
hacia la izquierda
b-talasemia
Clasificación Relación Fenotipo/ Mutación:
• Beta +: La mutación no impide que el gen sintetice
algo de globinas beta.
• Beta 0: La mutación impide totalmente la síntesis de
globinas beta, bien porque no se produce RNAm o bien
porque se produzca pero no sea traducible.
Los genes de las globinas:

Consiste de estructuras exon e intrones. Se
refieren al ADN codificante y no codificante,
respectivamente, del gen.
 INTRONES •Inicia con un sitio dador consenso
(G100U100A62A68G84U63..)
•Tiene un punto de ramificación cercano al
sitio 3’ del intron (no es un sitio consenso
muy conservado UACUAAC)
•Finaliza con un sitio aceptor consenso
(12Py..NC65A100G100)
UACUAAC
AG
TGA
5’
-200-500
-90
-75
Enhancer
Caja
GC
Caja
CAAT
FT
-30
TATA
5’ UTR
GT
AG
GT
3’
3’ UTR
AG
FTII
+
RNA pol II
Transcripción
+1
RNA Transcripto Primario
Señal de clivaje y
poliadenilación20-30nt
UGA
5’ UTR
GU
AG
GU
3’ UTR
AG
AAUAAA
Capping y Poliadenilación
NUCLEO
UGA
CAP 5’ UTR
GU
AG
7-metilguanosina
RNA nuclear
pequeño
(snRNA)
Spliceosoma
GU
Splicing
UGA
GU
GU
CAP 5’ UTR
AG
AG
GU
UACUAAC
3’ UTR AAAAAAAAA
AG
3’ UTR AAAAAAAAA
Lazo o LARIAT
AG
RNA mensajero MADURO
CAP 5’ UTR
3’ UTR AAAAAAAAA
CITOPLASMA
RESUMEN:
Tipos de Mutaciones
MUTACIONES TRANSCRIPCIONALES:
Elementos regulatorios del Promotor
5’UTR
MUT. PROCESAMIENTO RNA
Unión splice IVS cd 1, 2 ó 3
Sitios dadores (fuera del cd 1-3) o puntos
de ramificación
Señal polyA
Region 3’UTR
MUT. TRADUCCION RNA
Codon AUG
Codon stop (ej: Cd 39 exón 2)
Cambio marco lectura
Fenotipo
b+ o b++
b++ o b+
b0
b+ o b++
b+ o b++
b+ o b++
b0
b0
b0
PCR+ ER
87,5%
TECNICAS UTILIZADAS PARA EL
DIAGNOSTICO MOLECULAR DE LAS
TALASEMIAS.
 (REPASAR TEMA 1)

Alfa Talasemias
MUTACIONES
a
+
a
0
a- Talasemias:
Southern Blot y análisis de la
secuencia de ADN
 Gap-PCR
 Otro método es el MLPA
(Amplificación de Sondas dependiente de

Ligamiento Múltiple
TECNICA DE SOUTHERN:
HIBRIDACIÓN
1. NaOH 1N
2. Tris buffer
3. 20xSSC (NaCl 3M,
Citrato Na 0.3M)
PCR Multiplex
Es una variante de PCR en donde dos o
más loci son simultáneamente
amplificados en la misma reacción.
PCR Multiplex
Cuidados especiales:
1-Los primers de 18-24 pb deben tener un
contenido de GC 35-60% de esa forma
tiene una T anneling de 55-58ºC o mayor.
2-Distribuir los amplicones de distintos
tamaños.
3-Diseñar primers con características
similares: sin estructura secundaria ni
interacciones entre ellos.
4-Se debe calcular el Tm (no muy
diferentes entre primers) y analizar las
interacciones primer-primer).
Gap- PCR
Variante de una
PCR-multiplex
Se utiliza gap-PCR para diagnóstico de:
GAP-PCR

Una gran deleción reune a los primers AC y se
produce la amplificación

Usada en la identificación de deleciones en el
gen de a- globina.
A
B
C
A
C
Normal: A and B da un
producto; A y C están
demasiados apartados
no hay producto PCR
Deleción: A y C ahora dan un
producto, el cual es diferente en
tamaño al producto A y B.
a- Talasemias:
Amplificación de Sondas
dependiente de Ligamiento
Múltiple (MLPA)
Instrumentos



Un termociclador y un sistema de electroforesis tipo de
secuencia son requeridos para MLPA
Los resultados son obtenidos en 24 hs.
Mas de 96 Ms pueden ser procesados en un experimento
Mix-Probes

MLPA probes consiste de 2 oligonucleotidos:
La sonda oligonucleotido izquierda(LPO) (7) y la sonda
oligonucleotido derecha(RPO) (8)
Protocolo típico de MLPA
Cluster α- globina y localizaciones de las probes de MLPA.

Las deleciones Heterocigotas: gris

Las deleciones Homocigotas: en puntos.

Las Duplicaciones. Barras negras.

Los extremos punteados se localizan las regiones breakpoints

Los Asteriscos (*) indicate the real-time PCR primers used in this study.

# indicate nº de muestras analizadas.

MLPA histograms showing dosage
effects in samples #15 (α-thal trait
carrier), 21, 23 (HbH patients), and
25 (thalassemia intermedia patient).
Bibliografía general:



LEHNINGER ALBERT L., COX MICHAEL M., NELSON DAVID L.
“Principios de Bioquímica”. Editorial OMEGA
4º Edición. 2006.
Diapositivas en Power Point (formato ppt) (Manual para docentes)
LEHNINGER ALBERT L., COX MICHAEL M., NELSON DAVID L.
“Principios de Bioquímica”
Web: http://bcs.whfreeman.com/lehninger/
The Journal of Biological Chemistry: Classic Articles
Web: www.jbc.org
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VOET DONALD, VOET JUDITH G.
“Bioquímica”
Editorial MÉDICA PANAMERICANA.
3º Edición, en Español. 2006

WATSON, BAKER, BELL, GANN, LEVINE, LOSICK
“Biología Molecular del Gen”
Editorial MÉDICA PANAMERICANA. 5º Edición, en Español. 2006

STRYER LUBERT, BERG JEREMY M., TYMOCZKO JOHN L.
”Bioquímica”
Editorial REVERTE. Edición 5º Edición, en Español. 2003
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MATHEWS CHRISTOPHER K., AHERN KEVIN G., VAN HOLDE K. E.
”Bioquímica” Editorial PEARSON EDUCACION. 3º Edición en Español. 2003

Diapositivas (formato ppt), Problemas (Manual para docentes) y Casos Clínicos de
Aplicación
VOET DONALD, VOET JUDITH G. and PRATT CHARLOTTE W.
“Fundamentals of Biochemistry”
Second Edition.
Copyright © 2006 by John Wiley & Sons, Inc
Web: www. medicapanamericana.com/voet/
Bibliografía especifica:
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Alvarez SM, Varas SM, Meloni AM, Giménez AI y Giménez
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Argentina. Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana: 35 (1) 7582
Alvarez, Silvina M. (1999). Trabajo Final de Tesina en Biología
Molecular ‘’ Rastreo de pacientes b- talasémicos: estudio
bioquímico y molecular. UNSL. Biblioteca Central.
Weatherall DJ y col. Chapter 93: The hemoglobinopathies.
Book II. The metabolic and molecular basis of inherited disease.
Scriver CR, Beaudet AL, Sly WS & Valle D. 7º Edition. 1995.
New York Mc Graw-Hill.
Fundación Argentina de Talasemia "FUNDATAL"
http://www.fundatal.org.ar
Ronald J A Trent. Diagnosis of the Haemoglobinopathies.
Clin. Biochem. Rev. Vol 27 February 2006
Bibliografía especifica:



Charles R. Scriver, Arthur L. Beaudet, William
S. Sly and David Valle: THE METABOLIC AND
MOLECULAR BASES OF INHERITED DISEASE.
Volume I,II and III. Seventh Edition.Mc
Graw-Hill Editors
Trabajos publicados en revistas de la
especialidad.
BLOG:
http://qbpatologica.wordpress.com/