Download técnicas de biología molecular para el análisis masivo de

TÉCNICAS DE BIOLOGÍA
MOLECULAR PARA EL ANÁLISIS
MASIVO DE EXPRESIÓN DE GENES
Y SU APLICACIÓN PARA EL
TRATAMIENTO PERSONALIZADO
DEL PACIENTE
CURSO DE FORMACIÓN CONTINUADA A
DISTANCIA 2010-2011
ACTUALIZACIONES EN EL
LABORATORIO CLÍNICO
Nº 6
I.S.S.N.- 1988-7477
Título: Actualizaciones en el Laboratorio Clínico
Editor: Asociación Española de Biopatología Médica
Maquetación: AEBM
Fecha de Distribución: abril 2011
Técnicas de Biología molecular para el
análisis masivo de expresión de genes y
su aplicación para el tratamiento
personalizado del paciente
Dra. Trinidad Caldés Llopis.- Facultativo Especialista de Área, PhD
Jefe del Laboratorio de Oncología Molecular. Hospital Clínico San Carlos.
Madrid.
1. Introducción
2. Técnicas de análisis masivo de la expresión de genes
2.1 Matrices Tisulares
2.2 SNPs
2.3 Matrices de Hibridación Genómica Comparada (Arrays de CGH)
2.4 Matrices de cDNA y oligonucleótidos
2.5 PCR Cuantitativa
2.6 Detección de proteínas como marcadores séricos
2.7 Detección de fosfo proteínas en células individuales
2.8 Aplicaciones en Farmacogenómica
3. Bibliografia
595
1. INTRODUCCIÓN
Durante los últimos años se ha experimentado un gran avance en el conocimiento de
la Biología y la Medicina poniendo a nuestro alcance gran información que crece de
manera exponencial. Este avance en el conocimiento se ha podido desarrollar gracias
a la aplicación de grandes técnicas de Biología Molecular. Como bien dijo Sydney
Brenner en 1980 “El progreso en la ciencia depende de nuevas técnicas, nuevos
descubrimientos y nuevas ideas” probablemente en este orden (Figura 1).
Figura 1: Sydney Brenner 1980
Merece especial mención la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa
conocida como PCR, descubierta por Kary B Mullis el 8 de septiembre de 1983, y
reconocido su descubrimiento con el Premio Nobel de Química en el año 1993. Esta
técnica ha sido crucial para el conocimiento y secuenciación del genoma (fig 2). Las
nuevas y revolucionarias herramientas, han hecho avanzar la investigación Biomédica
y ahora más que nunca, la innovación terapéutica se presenta como la clave para
conseguir nuevos tratamientos eficaces y seguros.
596
Figura 2: Reacción en cadena de la polimerasa (PCR), hecho histórico.
Entre estas herramientas, podemos hablar de la biotecnología la cual nos permite
mediante manipulación genética la creación de nuevos fármacos, siguiendo un
diseño determinado para mejorar sus propiedades terapéuticas.
La biotecnología cubre hoy muchos campos de la investigación médica como por
ejemplo en el campo del diagnóstico, en el descubrimiento de nuevas dianas
celulares, y en la mejora de tratamientos previos que permiten aumentar su eficacia
y tolerabilidad. Un buen ejemplo ha sido el desarrollo de anticuerpos totalmente
humanizados o pequeñas moléculas que actúan sobre dianas terapéuticas.
Otras herramientas importantes que han hecho avanzar el conocimiento del genoma
humano son las técnicas de análisis masivo de la expresión de genes.
597
Los conocimientos del genoma humano hacen posible la utilización de tecnologías en
genómica y proteómica capaces de analizar la complejidad de cada tipo de cáncer y
están encaminadas al diagnóstico molecular de tumores, identificando genes
relevantes en cáncer esporádico y familiar (1).
Este análisis molecular masivo tiene un interés especial en el estudio de la predicción
de respuesta a los tratamientos, ya que se puede predecir que pacientes van o no a
responder a dichos tratamientos (2-5) evitando por tanto toxicidades innecesarias.
Estos análisis tienen en común que el resultado es diferente según la plataforma
utilizada, el centro donde se han hecho y el especialista (4,6).
2. TÉCNICAS DE ANÁLISIS MASIVO DE LA EXPRESIÓN DE GENES
2.1 Matrices Tisulares
Las matrices de tejidos permiten estudiar un marcador en muchos tumores al mismo
tiempo. Para ello se tiene que construir un nuevo bloque de parafina en el que se
ponen en posiciones definidas tres cilindros de cada uno de los tumores en parafina
ya existentes y en los que se quiere hacer el estudio. En la figura 3 vemos un
esquema de la construcción de una matriz de tejidos. Mediante este sistema se
pueden estudiar uno o varios marcadores en muchas muestras. Esta matriz es
aplicable a técnicas de inmunohistoquímica, de hibridación in situ y de histología
(Figura 3) representa la Inmunohistoquímica de las proteínas reparadoras del ADN
hMLH1, hMSH2, hMSH6 y hPMS2). Estas matrices son también muy útiles para
confirmar los resultados que se obtienen en los estudios de micro-matrices de ADN
complementario. Otras indicaciones de esta técnica son el control de calidad, análisis
de nuevos anticuerpos, estudio molecular de cánceres de tamaño pequeño y
598
establecimiento de modelos predictivos basados en la expresión de proteínas. En
estos estudios, es posible digitalizar y cuantificar la expresión de los marcadores,
abriendo por tanto el uso de estas matrices titulares (7,8).
Figura 3: Construcción de una matriz de tejidos y su utilidad en el estudio de inmunohistoquímica de
hMLH1, hMSH2, hMSH6 y hPMS2
2.2 SNPs
Los polimorfismos son variaciones naturales de la secuencia entre dos copias del
genoma debidas a la sustitución de una base. Hoy en día se conocen más de 3
millones de SNPs y existen en el mercado distintas plataformas para su estudio como
599
la de Illumina, Affimetrix, Applied Byosistems etc. En estas plataformas se pueden
estudiar desde 7000 a 1,8 millones de SNPs. La mayoría de los SNPs se encuentran
en zonas no codificantes ya que sólo se han descrito unos 60.000 en exones. Se
supone que el número de polimorfismos por individuo está en el rango de 10 a 15
millones (9,10).
El análisis de SNPs nos permite hacer estudio de casos controles con el fin de ver si
hay asociación de riesgo para una determinada enfermedad. Otra aplicación es
estudiar genes modificadores de riesgo y para ello se hacen estudios complejos
denominados GWAS (estudios de asociación genómica), estos estudios nos valen
también para localizar nuevos locus implicados en determinadas patologías. Por
último, otra aplicación de estos estudios está en el análisis de resistencia a fármacos
y de sensibilidad/toxicidad a drogas (9,10).
Figura 4: Micromatrices para el estudio de polimorfismos (SNPs)
600
Los estudios de SNPs como hemos dicho antes se pueden hacer en plataformas
(Figura 4), pero también se pueden estudiar cuando se trata de un nº pequeño, de
forma individual y las técnicas que se utilizan son la secuenciación directa del trozo
del genoma donde se encuentra el SNP o bien se pueden estudiar por metodología
TaqMan en equipos de PCR cuantitativa.
2.3 Matrices de Hibridación Genómica Comparada (Arrays de CGH)
Estas matrices se pueden hacer a partir de BACs o de oligonucleótidos. Los BACs son
cromosomas artificiales humanos que contienen secuencias de ADN entre 100 y 200
Kb. Actualmente hay secuencias para todo el genoma. Su uso permite la detección
de deleciones, duplicaciones, inserciones y reordenamientos (11). Para ello se realiza
una hibridación comparativa entre el ADN de un paciente y el ADN de un control
sano. Recientemente, se ha publicado un trabajo de P Lichter (12) con una matriz de
BACs específica para LLC-B (leucemia linfocítica crónica). Existen también
micromatrices comerciales de CGH basadas en oligonucleótidos, con mayor
resolución que los BACs y mayor poder en investigación y diagnóstico (13).
2.4 Matrices de cDNA y oligonucleótidos
Una matriz de ADN es un sistema en miniatura en el que fragmentos de ADN se
inmovilizan en soportes sólidos. Según sea el tamaño del ADN inmovilizado (que
servirá como sonda complementaria), hay dos tipos de micromatrices: las
micromatrices de ADN complementario que presentan sondas de cientos de bases y
micromatrices de oligonucleótidos con sondas de 20¬25 bases o de 50¬80.
601
Figura 5: Micro matrices de ADNc o de oligonucleótidos
Estas micro matrices o chips consisten en un soporte sólido sobre el cual un robot ha
impreso de manera ordenada miles de ADNs complementarios o de oligonucleótidos
representantes de otros tantos genes (fig 5). Un chip puede ser hibridado al mismo
tiempo con dos sondas de ADNc (marcadas con dos fluorocromos diferentes por
ejemplo Cyanina 3 y Cyanina 5) generadas a partir de ARN mensajero de las
muestras a comparar (por ejemplo tejido tumoral y normal), o bien ser marcado por
un único fluorocromo.
Después de la hibridación, los chips se lavan para eliminar restos de reactivos, y se
mide con un scanner las intensidades de cada uno de los puntos donde se ha
producido dicha hibridación, siendo el nivel de la señal proporcional al número de
copias de RNA mensajero en la muestra: de modo que el cociente de la intensidad
de fluorescencia (Cy3/Cy5) constituye una medida de la expresión génica diferencial
relativa al ADNc representado en el chip (Figura 6).
Con esta técnica se pueden obtener muchos valores, y la convierte en una
herramienta importante para trabajos de genómica funcional. El gran volumen de
datos obtenidos, hace imprescindible el análisis de los resultados con métodos
bioinformáticos y por personal especializado (14, 15).
602
Figura 6: Agrupación por expresión diferencial de genes en una matriz de ADNc
2.4.1 Análisis de los resultados
Los datos generados mediante esta técnica, como hemos dicho antes, necesitan ser
analizados por un bioinformático que llevará a cabo las diferentes formas de agrupar
los resultados:
 Agrupar muestras o genes expresados de forma sincronizada
 Identificar genes que se asocien a algún hecho específico
 Asignar función biológica a los genes resultado del experimento
603
 Simplificar series de genes al mínimo número de datos posibles
 Asignar riesgos específicos derivados de la expresión de genes concretos
2.4.2 Limitaciones de las micromatrices de ADN
Como todas las técnicas usadas en investigación, las micromatrices tienen
limitaciones, como:
1. Secuencias no verificadas.
Este error no ocurre en las micro matrices
comercializadas pero si en las fabricadas de forma casera.
2. Dificultad de trasladar datos cuantitativos a estados funcionales. Los niveles
altos de expresión de un mensajero, no implican necesariamente una
activación funcional del gen preciso, ya que lo que puede ocurrir y de hecho
es más corriente es una pérdida de la función. Por este hecho todos los
resultados
obtenidos
mediante
matrices,
deben
ser
verificados
experimentalmente
3. Ruido biológico. Se ha comprobado que la variabilidad inter-experimental es
debida al azar o a otras razones de oscilaciones cíclicas no relacionadas con el
objeto del experimento.
4. Falta de estandarización de técnicas de análisis. La mayoría de las plataformas
usadas para análisis genómicos son muy robustas, pero todavía no tienen una
reproductibilidad. Esto se ha visto porque cuando se comparan los resultados
obtenidos por distintas plataformas, estos son distintos entre sí.
2.5 PCR Cuantitativa
La PCR a tiempo real es hoy por hoy una técnica de referencia para el estudio de
expresión de genes. Tiene una gran sensibilidad, especificidad y reproducibilidad.
Existe también la posibilidad de utilizar plataformas para un número determinado de
604
genes aunque este es menor que el utilizado en las matrices, sin embargo es mucho
más sensible y reproducible. Esta metodología tiene además la ventaja que si se
hace un diseño adecuado del tamaño de los amplicones, puede ser utilizada para
muestras de tejido parafinado. A este tipo de tarjetas, se les llama chips de baja
densidad.
La gran reproducibilidad de sus resultados, permite su uso en la clínica y nos sirve
también para verificar los hallazgos encontrados en los chips de alta densidad. Así en
la actualidad hay varios ensayos clínicos que utilizan esta metodología para estudiar
las distintas variables que nos van a ser útiles para predecir la respuesta a una
terapia determinada.
Expresión
gen diana
Expresión
gen endógeno
2.6 Detección de proteínas como marcadores séricos
El objetivo de muchos grupos de investigación es la identificación de marcadores
séricos informativos de riesgo de contraer una determinada enfermedad o que nos
sirvieran para el seguimiento de la enfermedad mínima residual (16). La obtención
del suero es una técnica no invasiva y nos permitiría monitorizar los cambios antes,
durante y después. Los primeros resultados hechos en ovario, páncreas y próstata
usando el SELDI¬TOF¬MS parecían prometedores. Sin embargo estos estudios han
605
demostrado poca reproducibilidad y muchos falsos positivos con lo cual no se pueden
utilizar como técnica de análisis rutinario (17, 18).
2.7 Detección de fosfo proteínas en células individuales
Tanto el mecanismo de acción de drogas como la sensibilidad a las mismas, se
puede ver por el análisis de proteínas inducidas por la acción de estas drogas. Por
ejemplo, agentes que dañan el ADN inducen fosforilación de sensores de daño a
ADN, mientras que agentes cuya diana está constituida por rutas de traducción de
señal inducen cambios en el estado de fosforilación de proteínas críticas en estas
rutas. La disponibilidad de anticuerpos contra los estados funcionales de estas
proteínas permite utilizar la citometría de flujo como técnica de análisis de estos
cambios (19-21).
2.8 Aplicaciones en Farmacogenómica
Las matrices de ADN complementario permiten establecer el perfil geonómico del
fármaco o firma molecular del mismo y establecer firmas moleculares predictivas de
sensibilidad /resistencia. Desde el punto de vista clínico es más útil identificar al
principio aquellos marcadores que van a ser útiles para un determinado tratamiento
es decir nos van a dar la información de si es útil o no ese tratamiento. A pesar de
ser un objetivo difícil debido a la acción múltiple de la mayoría de las drogas, hoy en
día se han conseguido gracias a los estudios de las vías moleculares de actuación de
las
drogas,
algunos
marcadores
predictivos
de
respuesta
a
determinados
tratamientos y que la FDA obliga a su estudio antes de iniciar dicho tratamiento.
Entre estos marcadores tenemos:

El estudio de mutaciones en el codon 12, 13 y 61 del gen K-ras, para el
tratamiento de cáncer colorrectal metastásico en primera y segunda línea con
606
Cetuximab, un anticuerpo monoclonal contra el EGFR. Se ha visto que
aquellos pacientes con mutaciones en K-ras no responden al Cetuximab (22).

El estudio de las mutaciones en el dominio Tirosina Kinasa del gen c-Kit, para
el tratamiento de los tumores de tipo gastrointestinal (GIST) con el Imatinib
un inhibidor del dominio Tirosina Kinasa. Este tratamiento se utiliza también
para la Leucemia Mieloide Crónica (23).

En el adenocarcinoma de pulmón tenemos hoy en día también un marcador
predictivo de respuesta al tratamiento con un inhibidor del dominio tirosina
kinasa del receptor EGFR como el Gefitinib o el Erlotinib. Los pacientes con
mutaciones en EGFR, responden mejor al tratamiento (24).

La sobreexpresión o amplificación génica del receptor HER2 también es factor
predictivo de respuesta al tratamiento de cáncer de mama con Trastuzumab
(25).

Otros marcadores nos sirven para predecir la toxicidad a un fármaco. El gen
de la UGT1A1 tiene un polimorfismo en su zona promotora UGT1(TA)7, a este
alelo normal se le denomina UGT1A1*1, pero puede ocurrir una inserción de
TA con lo cual serían 8 (TA) y al alelo se le denomina UGT1A1*28, esta
inserción produce una pérdida de expresión y menor actividad enzimática y
como
resultado
produce
toxicidad
del
fármaco
Irinotecan
(Egapp
Recomendation Statement) (26). Por último podemos mencionar que la
pérdida de expresión del gen de la Dihidro Pirimidin Dehidrogenasa, enzima
encargada de metabolizar las Fluoropirimidinas como el 5FU, produciría
toxicidad al tratamiento.
607
La investigación llevada a cabo en relación con el diagnóstico y tratamiento tiene
todavía mucho trabajo por delante. Desde los años 1980 al 2000 en los que al
principio
sólo
se
contaba
con
la
Hematoxilina/Eosina,
posteriormente
la
Inmunohistoquímica y el FISH. Estas técnicas, nos valían sólo para la predicción de
genes aislados. A finales del siglo pasado y en este siglo 21, se nos está permitiendo
gracias a las técnicas de genómica y proteómica lograr un avance significativo en el
conocimiento de la carcinogénesis humana. Al mismo tiempo nos ha servido para
diseñar nuevos tratamientos contra dianas moleculares que se localizan en vías de
traducción de señales, proliferación, diferenciación, apoptósis, y reparación del ADN.
Y por último, estas técnicas nos han servido y sirven para localizar nuevos factores
predictivos de respuesta, que son diferentes para cada individuo pudiendo por tanto
personalizar el tratamiento.
608
3. BIBLIOGRAFIA
1. Ponder BA. Cancer genetics. Natura. 2001; 411:336-341.
2. Bittner M, Meltzer P, Chen Y, et al. Molecular classification of cutaneous malignant
melanoma by gene expression profiling. Nature. 2000;406:536-40.
3. Golup TR. Toward a functional taxonomy of cancer. Cancer Cell. 2004;6:107-108.
4. Tracey L, Villuendas R, Doctor AM, et al. Mycosis fungoides shows concurrent
deregulation of multiple genes involved in the TNF signaling pathway: an expression
profile study. Blood. 2003;102:1042-1050.
5. Staunton JE, Slonim DK, Coller HA, et al. Chemosensitivity prediction by
transcriptional profiling. Proc Natl Acad Sci USA. 2001;98:10787-10792.
6. Strausberg RL, Simpson AJ, Old LJ, Riggins GJ. Oncogenomics and the
development of new cancer therapies. Nature. 2004;429:469-474.
7. Garcia JF, Camacho FI, Morente M, et al . Hodgkin and Reed-Sternberg cells
harbor alterations in the major tumor suppressor pathways and cell-cycle
checkpoints: analyses using tissue microarrays. Blood. 2003;101:681-689.
8. Kononen J, Bubendorf L, Kallioniemi A, et al. Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens. Nat Med. 1998;4:844-847.
9. Erichsen HC, Chanock SJ. SNPs in cancer research and treatment. Br J Cancer.
2004;90:747-751.
10. Nebert DW. Pharmacogenetics and pharmacogenomics: why is the relevant to
the clinical geneticist? Clin Genet.1999; 56:247-258.
11. Ishkanian AS, Malloff CA, Watson SK, et al. A tiling resolution DNA microarray
with complete coverage of the human genome. Nat Genet. 2004;36:299-303.
609
12. Schwaenen C, Nessling M, Wessendorf S, et al. Automated array-based genomic
profiling in chronic lymphocytic leukemia: development of a clinical tool and
discovery of recurrent genomic alterations. Proc Natl Acad Sci USA.2004;101:10391044.
13. Barrett MT, Scheffer A, Ben-Dor A, et al. Comparative genomic hybridization
using oligonucleotide
microarrays and total genomic DNA. Proc Natl Acad Sci
USA.2004; 101:17765-17770.
14. Zhang H, Yu CY, Singer B, Xiong M. Recursive partitioning for tumor classification
with gene expression microarray data. Proc Natl Acad Sci USA.2001; 98: 6730-6735.
15. Vaquerizas JM, Conde L, Yankilevich P, et al. GEPAS, an experiment –oriented
pipeline for the analysis of microarray gene expression data. Nucleic Acids Res
2005;33:W616-620.
16. Hanash S. Disease proteomics. Nature 2003;422: 226-232.
17. Ransohoff DF. Lessons from controversy: ovarian cancer screening and serum
proteomics. J Natl Cancer Inst. 2005; 97: 315-319.
18. Baggerly KA, Morris JS, Edmonson SR, Coombes KR. Signal in noise: evaluating
reported reproducibility of serum proteomic tests for ovarian cancer. J Natl Cancer
Inst 2005;97:307-309.
19. Lesinski GB, Kondadasula SV, Crespin T, et al: Multiparametric Flow Cytometric
Analysis of Inter-Patient Variation in STAT1 Phosphorylation Following Interferon Alfa
Immunotherapy. J Natl Cancer Inst. 2004;96:1331-1342.
20. Jacobberger JW, Sramkoski RM, Frisa PS, et al. Immunoreactivity of Stat5
phosphorylated on tyrosine as a cell-based measure of Bcr/Abl kinase activity.
Cytometry A.2003;54:75-88.
610
21. Irish JM, Hovland R, Krutzit PO, et al. Single cell profiling of potentiated
phospho-protein networks in cancer cells.2004;118:217-228.
22. Lievre A, Bachet JB, Boige L,Cayre A et alRAS Mutations As an Independent
Prognostic
Factor
in
Patients
With
Advanced
Colorectal
Cancer
Treated With Cetuximab. J Clin Oncol 2008; 26:374-379.
23. Kindler T, Breitenbuecher F, Marx A, Beck J, Hess G, Weinkauf W et al. Eficacy
and safety of imatinib in adult patients with c-kit–positive acute myeloid leukaemia.
Blood 2004; 103:3644-3654.
24. Lynch TJ, Bell DW, Sordella R, Gurubhagavatula S, Okimoto RA, Brian BS et al.
Activating Mutations in the Epidermal Growth Factor Receptor Underlaying
Responsivenes of Non-Small-Cell Lung Cancer to Gefitinib. N Engl J. Med 2004;350
(21):2129-2139.
25. Cobleigh MA, Vogel CL, Tripathy D et al. Multinational study of the efficacy and
safety of the humanized anti HER2 monoclonal antibody in women who have HER2
overexpressing metastatic breast cancer that has progressed after chemotherapy for
metastatic disease. J Clin Oncol 1999; 17:2639-2648.
26. Inocenti F, Undevia Sd, Lyer L et al. Genetic variants in the UDPglucuronosyltransferase 1A1 gene predict the risk of severe neutropenia of
irinotecan. J Cli Oncol 2004;22:1382-1388.
611
Con la colaboración de: