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Universidad Miguel Hernández de Elche
Identificación de mutaciones denticulata
mediante secuenciación masiva
en Arabidopsis
Manuela Boluda Mora
Tutores:
José Luis Micol Molina
María Rosa Ponce Molet
Amani Toumi
Área de Genética
Departamento de Biología aplicada
Grado en Biotecnología
Facultad de Ciencias Experimentales
Curso académico: 2013/2014
JOSÉ LUIS MICOL MOLINA, Catedrático de Genética de la Universidad Miguel Hernández
de Elche,
MARÍA ROSA PONCE MOLET, Catedrática de Genética de la Universidad Miguel
Hernández de Elche, y
AMANI TOUMI, becaria predoctoral del Programa Santiago Grisolía de la Generalitat
Valenciana
HACEMOS CONSTAR:
Que el presente trabajo ha sido realizado bajo nuestra dirección y recoge fielmente la labor
realizada por Manuela Boluda Mora como Trabajo de Fin de Grado en Biotecnología. Las
investigaciones reflejadas en esta memoria se han desarrollado íntegramente en el Instituto
de Bioingeniería de la Universidad Miguel Hernández de Elche.
José Luis Micol Molina
Maria Rosa Ponce Molet
Amani Toumi
Elche, 3 de septiembre de 2014.
Resumen y palabras clave
I.- RESUMEN Y PALABRAS CLAVE
Hemos iniciado la caracterización de tres estirpes de Arabidopsis thaliana que
pertenecen a la colección de mutantes foliares del laboratorio de J.L. Micol, en el que se
está llevando a cabo una disección genética del desarrollo de las hojas de las plantas. Las
hojas de los mutantes denticulata (den) son apuntadas y con margen dentado, rasgos que
les hacen candidatos a estar alterados en algún gen implicado en procesos necesarios
para la proliferación y/o la diferenciación celular.
Como paso preliminar a la caracterización funcional de los genes a estudio, se
determinó antes del inicio de este trabajo su posición de mapa mediante análisis del
ligamiento a marcadores moleculares, estableciéndose intervalos candidatos a contener
cada una de las mutaciones den. Hemos identificado todas las mutaciones presentes en
dichos intervalos mediante secuenciación masiva en un secuenciador Ion Proton de Life
Technologies, eligiendo los tres genes candidatos más verosímiles a ser DEN3, DEN10 y
DEN15; para confirmar que causan el fenotipo de nuestro interés, hemos obtenido alelos
insercionales y de dominio público de estos genes, que han sido genotipados mediante
PCR a fin de seleccionar plantas homocigóticas que se usarán más adelante en pruebas
de complementación.
Palabras clave: Arabidopsis, mutantes foliares, secuenciación masiva, líneas de
ADN-T, clonación posicional, cartografía mediante secuenciación.
In this work, we initiated the genetic characterization of three Arabidopsis thaliana
mutants belonging to the leaf mutant collection of the laboratory of J.L. Micol, where a
genetic dissection of plant leaf development is being carried out. The denticulata mutants
exhibit pointed and dentate leaves, traits that make them candidates to be altered in genes
required for cell proliferation and/or differentiation.
As a preliminary step to the functional characterization of the genes under study,
their map positions were determined by linkage to molecular markers, establishing
candidate intervals for each mutation. We identified all the mutations present in every
candidate interval by sequencing in a Life Technologies Ion Proton massive sequencer, and
selected the most likely candidates for the DEN3, DEN10 and DEN15 genes. To confirm
that these genes cause the mutant phenotypes of interest, T-DNA insertional lines were
obtained and genotyped by PCR in order to select homozygous plants to be used for
complementation tests.
Keywords: Arabidopsis, leaf mutants, massive sequencing, T-DNA lines, positional
cloning, mapping by sequencing.
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Conclusiones y proyección futura
VI.- CONCLUSIONES Y PROYECCIÓN FUTURA
Se sabe relativamente poco acerca de la naturaleza de los genes implicados en la
morfología foliar, a pesar de la importancia para la biosfera en general y la productividad
agraria en particular. En este Trabajo de Fin de Grado se ha intentado identificar los genes
mutados en tres mutantes foliares previamente aislados en el laboratorio de J.L. Micol,
pertenecientes a la clase fenotípica Denticulata, cuyas hojas son apuntadas y dentadas a
diferencia de las de su ancestro silvestre Ler.
Hemos identificado tres candidatos verosímiles a ser DEN3, DEN10 y DEN15
siguiendo un abordaje en el que se ha combinado la cartografía génica mediante el análisis
de ligamiento a marcadores moleculares y la secuenciación masiva. En el mutante den3,
el gen At3g62870 resultó ser portador de una mutación C→T, que genera un codón de
terminación prematuro. Este gen codifica una proteína ribosómica de la familia L7a. El
mutante den10 muestra una mutación G→A en el primer nucleótido del séptimo exón del
gen At5g64580, que podría afectar su splicing. Este gen codifica una proteína localizada
en el cloroplasto, una presunta metaloproteasa dependiente de ATP (AtFtsHi4). Por último,
el mutante den15 presenta una mutación G→A en el gen letal embrionario At3g55620, que
sustituye una valina por metionina en su producto proteico. Este gen codifica un factor de
iniciación de la traducción eucariótico (eIF6).
Este trabajo, como otros anteriores (Mateo-Bonmatí et al., 2014), confirma que el
uso combinado de la cartografía génica mediante el análisis de ligamiento a marcadores
moleculares y la secuenciación masivamente paralela facilita la identificación de genes
causantes de los fenotipos de mutantes de interés.
Se requerirán análisis adicionales de los mutantes den3, den10 y den15 para la
caracterización molecular de los genes identificados mediante el estudio de sus patrones
de expresión espacial y temporal, la localización subcelular de su producto génico, y la
confirmación de su identidad mediante rescate fenotípico y/o pruebas de complementación
con mutantes insercionales de ADN-T. Hemos obtenido líneas de este último tipo, que
permitirán confirmar o descartar que At3g62870, At5g64580 y At3g55620 son DEN3,
DEN10 y DEN15, respectivamente.
El genotipado de las plantas de la línea GABI_817H01 nos ha permitido confirmar
su heterocigosis para un alelo insercional de At3g55620, y en consecuencia, su utilidad
para realizar una prueba de complementación, cruzándolas por el mutante den15. Sin
embargo, las plantas de la línea Salk_017008 no presentaron inserción alguna en
At2g39820, el parálogo más próximo de At3g55620, y por tanto no recibirán más atención.
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