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1. INTRODUCCIÓN
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La propagación de plantas consiste e efectuar su multiplicación por medios tanto
sexuales como asexuales. La reproducción asexual, consiste en la propagación
empleando partes vegetativas de la planta original, es posible porque cada célula de
la planta contiene la información genética necesaria para generar una nueva planta,
esta característica se conoce como totipotencia celular (HARTMANN y KESTER,
1995).
Dentro de los métodos asexuales, se tiene la propagación de cultivos in vitro tales
como cultivo de óvulos, embriones, semillas, polen, esporas, cultivos de ápice, micro
injertos, células y tejidos.
La micropropagación, consiste en producir plantas a partir de porciones muy
pequeñas de ellas, de tejidos o células cultivadas asépticamente en un tubo de
ensayo o en otro recipiente, donde se puedan controlar estrictamente las
condiciones del ambiente y la nutrición (HARTMANN y KESTER, 1995). Estos
sistemas de propagación requieren de instalaciones como laboratorios y personal
adiestrado para la realización de las labores.
Esta técnica se ha convertido en una alternativa importante dentro de los métodos
convencionales de propagación en una amplia gama de especies (HARTMANN y
KESTER, 1995), y se compone de cuatro etapas secuenciales: establecimiento,
proliferación o multiplicación, enraizamiento y aclimatación (BOUTHERIN y BRON,
1994).
Una planta que se ha originado in vitro, difiere en muchos aspectos de las que se
forman in vivo (PIERIK, 1990), ya que sus condiciones tanto ambientales como del
sustrato, la luz, nutrición, son muy diferentes. Además es importante señalar que el
crecimiento in vitro es heterótrofo e in vivo autótrofo.
El ambiente in vitro, con una alta humedad relativa, bajo o nulo intercambio
gaseoso, escasez de CO2 durante casi todo el período, producción de etileno y baja
densidad fotosintética, induce perturbaciones en las plantas desarrolladas bajo esa
condición. Después de transferir las plantas al ambiente ex vitro, las plantas tienen
que corregir todas esas anormalidades para aclimatizarse al nuevo ambiente, ya
sea en invernadero o campo (KADLECEK et al., 2001). Por otra parte, la anatomía
de la hoja es influenciada por la luz y la humedad, diferenciándose anatómicamente
de las originadas in vivo (BRAINERD et al., 1981).
Debido a esto, la aclimatación es un factor importante en la posterior supervivencia
de la planta, ya que es una etapa crítica dentro del proceso, en la que se produce la
mayor pérdida. En ella se debe comenzar reduciendo gradualmente la humedad
relativa, para permitir con esto además del cierre estomático, una mejor formación
de cutícula y disminuir la pérdida de agua. Por otra parte, para tener mejores
resultados en el establecimiento in vivo es necesario el desarrollo radicular in vitro
(PIERIK, 1990).
La disminución de la humedad relativa al interior del tubo de cultivo y con ello el
incremento de la ventilación, parece tener un mayor efecto en vid, reforzando el
funcionamiento estomático y con esto permitir un mejor control de la pérdida de
agua por parte de las hojas (GRIBAUDO, NOVELLO y RESTAGNO, 2001).
Existen varios informes que detallan las etapas in vitro de las vides, pero se ha dado
una escasa atención a la etapa de la aclimatación. Comparado con otras especies
leñosas, la sobrevivencia de las vides micropropagadas es relativamente baja
(THOMAS, 1998).
En cuanto al cerezo, diversos son los estudios realizados a nivel mundial en
búsqueda de nuevas variedades y portainjertos. La propagación in vitro, ha surgido
como una alternativa importante dentro de la multiplicación de patrones. Es por ello
interesante el estudiar el comportamiento de esta especie, durante la etapa más
complicada de la micropropagación, la aclimatación, para generar antecedentes y
facilitar el proceso a futuro.
Es por ello, que en este estudio se propone, mediante la preaclimatación en cámara
de crecimiento, con el uso de sellos en los frascos de cultivo, permitir una mayor
ventilación y la disminución gradual de la humedad relativa, para así disminuir el
estrés hídrico sufrido por las plantas al momento del trasplante, mediante un mejor
funcionamiento estomático y aumentar con esto la sobrevivencia in vivo, permitir
una aclimatación más fácil y hacer más comercial el proceso.
Además, se realizará un estudio histológico de hoja en vid, para analizar la
evolución de los estomas en los estados secuenciales de la propagación in vitro,
para entender desde un punto de vista descriptivo su funcionamiento, y cómo
influyen en la tasa de sobrevivencia durante la aclimatización.
Objetivos:
1.- Evaluar distintos sistemas de sellado en la preaclimatación de plantas de vid y
cerezo Gisela 5 propagadas in vitro, que conduzcan a una adecuada etapa de
aclimatización.
2.- Evaluar la sobrevivencia de las plantas de vid y cerezo Gisela 5 propagadas in
vitro preaclimatadas, en la etapa de aclimatización.
3.- Analizar mediante el uso de fotografías de cortes histológicos, la condición en la
que se presentan los estomas en cada uno de los estados secuenciales de la
propagación in vitro de vid.
2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA.
2.1. Cultivo in vitro:
El término cultivo in vitro se aplica a todo cultivo bajo cristal en medio aséptico, pero
incluye diversas técnicas cuyos métodos y fines son muy diferentes. La técnica
general consiste en tomar un fragmento de tejido vegetal, colocarlo en un medio
nutritivo y provocar (gracias a un equilibrio adecuado de los elementos del medio)
directamente o tras manipulación el desarrollo de una plántula. El conjunto de estas
operaciones se desarrolla en condiciones estériles
y se seguirá por una
aclimatación en medio tradicional (BOUTHERIN y BRON, 1994).
El cultivo in vitro es gracias a una propiedad de las células vegetales llamada
totipotencia celular, que significa que: toda célula vegetal viva con núcleo, capaz,
cual fuere su “especialización” del momento, de reproducir fielmente la planta entera
de la cual proviene. Cada célula posee entonces la totalidad del patrimonio genético
de la planta (BOUTHERIN y BRON, 1994).
HARTMANN y KESTER (1995) señalan una clasificación general de los sistemas
de cultivo in vitro, utilizando sistemas asépticos y este es el siguiente: cultivo de
meristemas, microinjertos, ápices de tallos, cultivo de tejidos o células (callos,
protoplastos, etc), cultivo de anteras, polen, óvulos, embriones, semillas y esporas.
2.2. Micropropagación:
El fin de la micropropagación es el de reproducir en gran cantidad plantas idénticas
al pie madre, y no teniendo la micropropagación influencia sobre la calidad sanitaria
de la planta propagada, es indispensable poseer como punto de partida un material
sano (BOUTHERIN y BRON, 1994).
Dentro de las ventajas señaladas por MARGARA (1988), permite propagar un gran
número de especies difíciles de multiplicar, a menudo por los métodos clásicos
puede realizarse con un nivel de proliferación elevado en un estado precoz de
desarrollo, con frecuencia esta propagación in vitro se une a la lucha fitosanitaria, ya
que las plantas obtenidas, son usualmente libres de virus, bacterias, hongos
parásitos, y constituyen un material de calidad.
Por su parte, BOUTHERIN y BRON (1994), señalan otras ventajas como mejorar la
selección, ya que a partir de un individuo notable, se puede comercializar
rápidamente un clon interesante, garantía de homogeneidad, además limita o
suprime los pies madre y por consiguiente libera superficies de invernadero y
permite la programación de cultivos a lo largo de todo el año, o la producción en
períodos muy precisos, sin que el número de pies madre o su estado por reposo
vegetativo tengan influencia y por último, la formación de un “banco de genes” que
podrán conservar especies o cultivares que ofrezcan un interés agronómico,
hortícola, industrial, ecológico, etc.
THOMAS y SCHIEFELBEIN (2001) destacan la posibilidad de guardar stocks
durante años, sin la pérdida de potencial de multiplicación con una serie de
subcultivos y el retorno de plantas normales al campo con características de adulto.
En cuanto a las desventajas MARGARA (1988) indica que se puede obtener
“variantes” distintas a la planta madre por su morfología o fisiología, la necesidad de
usar determinados tejidos para una especie dada, ya que se debe acudir a los
tejidos aptos para sintetizarlos en forma natural. Por su parte BOUTHERIN y BRON
(1994), mencionan el costo como desventaja ya que en una planta in vitro es más
elevado que el de aquella multiplicada por métodos tradicionales. Sin embargo, este
inconveniente se compensa con frecuencia con una ganancia de productividad, el
riesgo de mutación porque la tasa de variabilidad es más elevada, por último, las
dificultades de éxito, cierto número de vegetales se multiplican fácilmente in vitro,
otros permanecen rebeldes a esta técnica, en especial en las especies leñosas.
2.3. Propagación in vitro:
2.3.1. Establecimiento
La vid es propagada convencionalmente usando estacas de madera dormante (36 a
46 cm de largo) recolectadas durante el invierno. Estas son plantadas durante la
primavera en contenedores, para posteriormente ser trasplantadas a la viña. Este es
un proceso lento y limitado por estacionalidad para la propagación de nuevos
cultivares, y la introducción de nuevas especies exóticas. Por esto, la
micropropagación en vid, ha ofrecido un gran potencial para su multiplicación en
cuanto a rapidez y la posibilidad de guardar stock de cultivos durante años, sin la
pérdida del potencial de multiplicación (THOMAS y SCHIEFELBEIN, 2001).
LEWANDOSKI (1991) señala que las técnicas para la propagación de varias
especies y cultivares de Vitis incluyen organogénesis y la proliferación de brotes
axilares. Por su parte SAFFIE (2002), MESA (2001) y RAVINDRA y THOMAS
(1995), señalan el uso de segmentos nodales para micropropagación.
Este método de segmentos nodales ha producido un éxito apreciable en muchas
plantas diferentes, entre ellas Vitis rupestris (PIERIK, 1990).
Con respecto al cerezo, MUNA et al. (1999), DAL ZOTTO y DOCAMPO (1997),
MILLER et al. (1982) y SNIR (1982), y utilizaron ápices de yemas obteniendo muy
buenos resultados en el establecimiento y las fases sucesivas de la propagación in
vitro de cerezos. Por otro lado DRADI, VITO y STANDARDI (1996) usaron
segmentos nodales que se comportaron satisfactoriamente.
PIERIK (1990) señala que el cultivo de segmentos nodales, consiste en el
aislamiento de una yema, junto con una porción de tallo, para obtener un brote a
partir de una yema. Este es el método más natural de propagación in vitro, ya que
también puede aplicarse in vivo. Cada una de las yemas que se encuentran en las
axilas de las hojas idénticas a las del ápice del tallo, pueden ser aisladas sobre un
medio nutritivo, intentándose así su desarrollo in vitro.
Para el caso de vid, el establecimiento in vitro de los segmentos nodales, se realiza
en un medio de sales de MURASHIGE y SKOOG (1962) con macronutrientes y
micronutrientes reducidos a tres cuartos, ajustado a pH 5,3 (MESA, 2001).
2.3.2. Proliferación
En cuanto a la proliferación en vid, esta se realiza en base a un medio de sales de
MURASHIGE y SKOOG (1962) con la sal NH4NO3, reducida a la mitad y el resto de
las sales reducidas a tres cuartos, adicionando Tiamina (0,4 mg/l), BAP (1,1 mg/l),
NaH2PO4 (170 mg/l), Myoinositol (100 mg/l), Sulfato de adenina (80 mg/l), Sacarosa
al 3%, y ajustado a pH 5,7 (MESA, 2001).
Con respecto a cerezo Gisela 5, la proliferación se realiza en base a un medio de
sales de MURASHIGE y SKOOG (1962), suplementado con 0,5 mg/l de AIB y 1,5
mg/l de BAP (CÁCERES, 2004; VARGAS, 2003).
2.3.3. Enraizamiento
El enraizamiento in vitro de vid se realiza en base a un medio de sales de
MURASHIGE y SKOOG (1962) con la sal NH4NO3, reducida a la mitad y el resto de
las sales reducidas a tres cuartos, adicionado con Tiamina (0,4%), AIA (0,2 mg/l),
NaH2PO4 (150 mg/l), Myoinositol (25 mg/l), sacarosa al 1%, y todo esto ajustado a
pH 5,7 (MESA, 2001).
El enraizamiento en cerezo Gisela 5, también se realiza en base a sales de
MURASHIGE y SKOOG (1962) con una concentración mineral reducida a la mitad
suplementado con 1 mg/l de AIB (CÁCERES, 2004).
PIERIK (1990) indica que un desarrollo pobre del sistema radical hace que el
crecimiento in vivo se haga muy difícil, especialmente cuando hay una elevada
transpiración. Es de vital importancia que las plantas in vitro pierdan la menor
cantidad de agua posible, cuando pasan a condiciones in vivo.
El suministro de agua también podría estar limitado desde que estudios histológicos
han demostrado una anatomía anormal de la raíz en plantas crecidas in vitro (FILA
et al., 1998).
2.4. Aclimatización:
Aclimatación y aclimatización son términos que describen el proceso de adaptación
de un organismo a un cambio ambiental. Aclimatación es el proceso regulado por la
naturaleza y aclimatización el regulado por el hombre (BRAINERD y FUCHIGAMI,
1981).
La aclimatización de plantas in vitro a las condiciones naturales, es un paso crítico
para muchas especies y requiere tiempo e instalaciones caras que restringen la
aplicación comercial de los procesos de micropropagación. Estas plantas muestran
un rápido marchitamiento cuando se transfieren a condiciones de invernadero, por lo
tanto debe mantenerse una humedad relativa alta en el nuevo ambiente, para no
dañar los mecanismos que mantienen el volumen de agua en la planta (FILA et
al.,1998).
Por su parte RAVINDRA y THOMAS (1995) señalan que la aclimatación o
endurecimiento de plantas de cultivos in vitro, es el paso más crítico en la
micropropagación
y
que
la
supervivencia
de
vides
micropropagadas
es
relativamente baja comparada con otras especies leñosas.
Los frascos, tubos de ensayo y matraces necesitan ser cerrados para impedir su
deshidratación e infección, pero por otro lado, tiene que ser posible el intercambio
gaseoso con el exterior, para evitar una falta de oxígeno o el exceso de gases
producidos como el CO2 y el etileno (PIERIK, 1990). ZOBAYED, ARMSTRONG y
ARMSTRONG (2001) explican que la principal característica del ambiente gaseoso
in vitro, en un sistema convencional de cultivo de tejido es la alta humedad relativa,
gran fluctuación diurna de la concentración de CO2 y la acumulación de etileno y de
otras sustancias tóxicas, esto debido al restringido intercambio aéreo entre el tubo
de cultivo y el ambiente.
Tradicionalmente el cultivo de tejidos ha involucrado recipientes cerrados con
plantas creciendo heterotróficamente, en un medio con agar que contiene una
fuente de carbono. Para mejorar la aclimatación de las plantas in vitro debe
proporcionárseles un ambiente que se parezca al in vivo, especialmente durante la
etapa III. Para estimular fotoautotrofía, se reduce la concentración de hidratos de
carbono en el medio, se incrementa la intensidad de luz y se eleva la concentración
de CO2. Además, es importante normalizar el ambiente gaseoso en los vasos de
cultivo cerrados, ya que éstos difieren muy notablemente del ambiente, y puede
provocar cambios significativos en el crecimiento y en la fisiología de la planta. Los
valores de CO2 son del orden de 0 – 12%, es decir menores a 10 ppm y los de la
acumulación de etileno de 3 µl/l, además de una humedad relativa cercana al 100%
(MURPHY et al.,1998), en cambio los valores existentes en la atmósfera de CO2,
bordean los 350 ppm (PUC, 2003).
Las concentraciones de etileno en los tubos de cultivo pueden afectar el crecimiento
in vitro de las plantas (SANTAMARÍA et al., 2000).
Las plantas cultivadas in vitro, tienen generalmente la cutícula escasamente
desarrollada, debido a la alta humedad relativa (90% - 100%). Como consecuencia,
cuando se transfiere la planta al suelo, se produce una transpiración cuticular extra,
ya que la humedad del aire en condiciones in vivo es más baja (PIERIK, 1990).
Por otra parte, PIERIK (1990) señala que las hojas de una planta producida in vitro,
son frecuentemente finas, blandas y fotosintéticamente poco activas, además tienen
las células en empalizada que son las que deben utilizar la luz, más pequeñas y en
menor cantidad. Indica además que los estomas pueden no ser suficientemente
operativos, y permanecer abiertos al trasplantarse al suelo, originando un importante
estrés hídrico en las primeras horas de aclimatación.
Una complicación extensa a la producción comercial en vid, ha sido la pobre
aclimatación y el establecimiento de plantitas en el invernadero (SWART y
LINDSTROM, 1986).
THOMAS (1998) demuestra que la aclimatación de las plantas in vitro es a menudo
difícil porque ellas poseen tallos y hojas suculentas, debido a la alta humedad dentro
del vaso de cultivo, y el agua libre en el medio.
FILA et al. (1998) señalan que la aclimatación puede ser mejorada modificando el
microambiente durante el desarrollo in vitro, por ejemplo reduciendo la humedad
relativa que causa un endurecimiento de la planta, mejorando los resultados durante
el trasplante. También con el aumento de la tasa de CO2 en los tubos de cultivo o
aumentando las intensidades de luz, para producir el establecimiento autotrófico in
vitro.
GRIBAUDO, NOVELLO y RESTAGNO (2001) indican que el costo de la fase de
aclimatación es generalmente considerable. Es por ello que los procedimientos que
lleven a un endurecimiento de la planta en la última etapa de la micropropagación,
con menores costos de labor y equipamiento facilitan este manejo y para esto se
recomienda el uso de tubos con baja humedad relativa.
2.4.1. Anatomía de las plantas cultivadas in vitro y su influencia sobre la
aclimatización
El ambiente in vitro es conocido por inducir modificaciones morfológicas, anatómicas
y fisiológicas en las plantas micropropagadas. Esas plantas son generalmente
susceptibles a la deshidratación rápida cuando se exponen a baja humedad relativa
(GRIBAUDO, NOVELLO y RESTAGNO, 2001).
Por su parte RITCHIE, SHORT y DAVEY (1991) indican que las plantas
micropropagadas son cultivadas bajo altos niveles de humedad relativa, causando
anormalidades morfológicas, particularmente en el estoma y la cutícula, produciendo
un alto porcentaje de mortalidad en la transferencia al invernadero.
BRAINERD
y
FUCHIGAMI
(1981)
señalan
que
las
hojas
de
plantas
micropropagadas pueden tener menos cera epicuticular, células en empalizada más
pequeñas, y más espacios aéreos en el mesófilo.
2.4.1.1. Factores morfológicos que influyen en la aclimatización
BRAINERD et al. (1981) demuestran que la anatomía de la hoja es influenciada por
la luz y la humedad. Las hojas desarrolladas a altas intensidades de luz tienen
células en empalizada en mayor cantidad y más grandes que aquellas en
condiciones de sombra, situación que se asemeja al de las plantas in vitro. Las
hojas desarrolladas en baja humedad relativa tienen espacios intercelulares
pequeños. Las plantas crecidas en alta humedad relativa tienen un pobre desarrollo
de cera epicuticular, y altas tasas de transpiración en aire seco.
Plantas creciendo bajo condiciones heterotróficas in vitro, tienen bajas tasas de
fotosíntesis. Esto es debido a las bajas intensidades de luz, bajas concentraciones
de CO2 (INFANTE, MAGNANINI y RIGHETTI, 1989) y la inhibición de la fotosíntesis
por la alta concentración de azúcar en el medio. No obstante, después de
transferirlas a las condiciones ex vitro, la mayoría de las plantas micropropagadas
desarrollan un aparato fotosintético funcional, aunque el aumento en la intensidad
de la luz no es linealmente traducido en un incremento de la fotosíntesis (KOZAI,
1991).
En las plántulas in vitro, la respuesta a la fotosíntesis en condiciones de luz, es
similar a la de las plantas de sombra, caracterizadas por tasas fotosintéticas y de
compensación de luz bajas y puntos de saturación también bajos. La anatomía de
las hojas es de acuerdo con las características fisiológicas mencionadas, ya que el
efecto de la luz en el desarrollo del mesófilo, principalmente en el parénquima en
empalizada, es ciertamente el factor determinante anatómicamente. Sin embargo,
las deficiencias en las estructuras de los cloroplastos (desarrollo de grana), el nivel
bioquímico y la baja en la actividad de la Rubisco, también contribuyen a limitar la
actividad fotosintética (AMANCIO, REBORDAO y CHAVES, 1999).
AMANCIO, REBORDAO y CHAVES (1999) además confirman que cuando las
plantas son transferidas a condiciones in vivo, a radiaciones más altas, puede
ocurrir estrés de luz, incluyendo la fotoinhibición, la fotooxidación de la clorofila, lo
último siendo revelado por clorosis y manchas secas que aparecen en la hoja. No
obstante, algunas especies toleran mayores radiaciones que aquellas in vitro, sin
mayor estrés. El control y la optimización de la luz, es entonces esencial para la
aclimatización satisfactoria, aumentar la tasa de sobrevivencia y el desarrollo de
nuevas estructuras. Por otra parte, existe la evidencia que un alto nivel de azúcar en
las células puede inhibir la síntesis de clorofila.
Los factores limitantes para la fotosíntesis de plantas cultivadas in vitro, son la baja
concentración de CO2 en la atmósfera del tubo de cultivo y la baja intensidad de luz.
El aumento simultáneo de estos factores generalmente hace posible mejorar la
actividad de la fotosíntesis in vitro. Sin embargo, las investigaciones de este tipo
para vides, no son muy abundantes. La tasa de fotosíntesis aumenta con la
intensidad de la luz, pero hay variantes entre cultivares, es así como bajo varias
intensidades de luz la fotosíntesis es baja en Riesling italiana, comparada con
Dimiat. (SLAVTCHEVA y DIMITROVA, 2000).
La captación de CO2 neto por parte de las plantas in vitro, es pequeña debido a la
baja tasa de éste dentro del tubo de crecimiento. Es más, los azúcares que se
suplementan al medio de crecimiento pueden causar una inhibición extensa de la
fotosíntesis. Al aumentar la tasa de CO2 y/o las intensidades de iluminación en el
tubo de cultivo, se produce un establecimiento autotrófico en las plantas in vitro. Sin
embargo estas técnicas son de poco uso comercial debido a su alto costo (FILA et
al., 1998).
VAN HUYLENBROECK y DEBERGH (1996), indican que lo importante en las
plantas in vitro, son las reservas de hidratos de carbono para superar el estrés del
trasplante. Con un balance positivo del carbono es posible producir nuevas hojas
funcionales, ya que el trasplante causa un cambio en la asignación de materia seca
entre el tallo y las hojas en vid, se forman más hojas y menos tallo, esto también es
corroborado en manzano por DIAZ-PEREZ, SHACKEL y SUTTER (1995).
Investigaciones recientes han mostrado que el estrés del trasplante es debido
primeramente al estrés hídrico, el cual puede ser combatido exitosamente por
algunas especies de plantas con alta humedad después del trasplante. La pobre
formación de cera epicuticular y cuticular, y el reducido control estomático
comparado con las plantas control aclimatizadas en invernadero, contribuye a la
desecación de las plantas transferidas (DONNELLY y VIDAVER, 1984).
La pérdida de agua en plantas micropropagadas durante la aclimatación, se ha
atribuído principalmente al mal funcionamiento de los estomas y a una reducida
deposición de cera epicuticular (GRIBAUDO, NOVELLO y RESTAGNO, 2001).
2.4.1.2. Cutícula
BRAINERD y FUCHIGAMI (1981) señalan que el estrés hídrico de las plantas
cuando son transferidas a baja humedad relativa, ha sido atribuido al pobre
desarrollo de la cera cuticular y epicuticular.
SUTTER y LANGHANS (1979), determinaron que la estructura de la cera
epicuticular, aumenta en hojas de plantas micropropagadas de clavel durante 2,5
semanas en el invernadero. GROUT y ASTON (1977) observaron que una
considerable y evidente capa de cera epicuticular, en ambas superficies de hojas
de Brassica oleracea, 10 días después de transferirlas desde un cultivo aséptico a
baja HR. Estos desarrollos de cera son parte del proceso de aclimatización. El
desarrollo de cera ocurre a los 10 días o más después de transferirlos, pero no
explica la diferencia en el contenido relativo de agua o el porcentaje de agua perdida
entre un cultivo de manzano cultivado asépticamente y aquellos después de cuatro
o cinco días de exponerlos a 30 a 40% de humedad relativa.
La deposición de la cera epicuticular, es un factor importante en el retardo de la
deshidratación de la hoja, ésta es reforzada al disminuir la humedad relativa
(RITCHIE, SHORT y DAVEY, 1991).
GRIBAUDO, NOVELLO y RESTAGNO (2001) observaron que la cantidad de cera
de la hoja en plantas in vitro era baja, anormalmente estructurada y químicamente
diferente de la cera de las plantas crecidas en invernadero. Además, evaluaron la
presencia de cera epicuticular de la superficie adaxial de la hoja, para determinar si
la pérdida de agua era influenciada por la cantidad de cera o por un problema
estomático, concluyendo que la mayoría del agua se perdió a través de la superficie
adaxial debido a un cierre estomático imperfecto.
La deshidratación de las hojas a través de la cutícula de la superficie adaxial es
relativamente baja. Bajo sus condiciones experimentales una reducción de la HR
parece tener mayor efecto en vid, reforzando el funcionamiento estomático y esto
permite un mejor control de la pérdida de agua de las hojas (SUTTER, 1984).
2.4.1.3. Estomas
BRAINERD y FUCHIGAMI (1981) determinaron que la proporción de pérdida de
agua de plantas micropropagadas de manzano, se relacionó inversamente al
porcentaje de cierre estomático.
BRAINERD et al. (1981) observaron que el agua perdida de hojas de plantas
provenientes de cultivos asépticos de ciruelo cv. Pixy ocurrió desde la superficie
abaxial, donde se encuentran localizados los estomas.
GRIBAUDO, NOVELLO y RESTAGNO (2001) indican que las vides crecidas en el
campo, tienen hojas hipoestomáticas, es decir tienen los estomas confinados
principalmente en la superficie abaxial.
BRAINERD y FUCHIGAMI (1981) observaron que un corto tiempo de aclimatización
con humedad, involucra un cambio en el funcionamiento estomático, y ocurre en
menos de cinco días después de exponerlo a esta baja humedad relativa. Otro
tiempo más largo de aclimatización involucra desarrollo de cera, y reorientación de
los cloroplastos, y esto ocurre después de 10 a 14 días.
BRAINERD y FUCHIGAMI (1981) y SUTTER y LANGHANS (1979) y han sugerido,
sin embargo, que la lenta respuesta estomática puede contribuir también al estrés
hídrico en plantas micropropagadas removidas desde el ambiente de cultivo.
ROMANO, NORONHA y MARTINS-LOUCAO (1992) demuestran que los estomas
de las plántulas in vitro están levantados, alrededor
de las células de guarda
comparados con los normales que son elípticos, y con las células de guarda
hundidas.
RITCHIE, SHORT y DAVEY (1991) señalan que el mal funcionamiento de los
estomas, es debido a la anormal disposición de las células de guarda.
La incapacidad de los estomas de cerrarse completamente, la mínima reducción de
las aperturas de las células de guarda en las hojas de crisantemo, y remolacha
cultivadas bajo humedad relativa reducida es consistente con los resultados
publicados por SHORT y ROBERTS (1987) y WARDLE, DOBBS y SHORT (1983).
2.4.1.4. Raíces
El equilibrio del agua en tejidos de plantas micropropagadas no solo depende de
regular la transpiración, sino de un suministro adecuado de agua a las raíces. Es por
esto que las plantas cultivadas en agar tienen pobres conexiones raíz-tallo, la
estructura de la raíz alterada, la absorción y transporte del agua es negativo. La
captación de agua por parte de las raíces, junto con la pérdida de agua por los
ápices, es de importancia primaria para el mantenimiento del equilibrio del agua
durante la aclimatación de las plantas crecidas in vitro. Además indican que el
suministro de agua podría estar limitado, desde que estudios histológicos han
mostrado una anatomía de raíz anormal en las plantas in vitro (FILA et al., 1998).
VÉGVARI (2001) mostró que las raíces de plantas propagadas in vitro,
generalmente pierden sus pelos radicales durante la aclimatización, pero estas
raíces son todavía importantes porque las nuevas raíces desarrolladas son
totalmente funcionales a partir de ellas.
2.5. Técnicas de preaclimatación:
Las plantas micropropagadas de vid, son generalmente susceptibles a la rápida
deshidratación cuando se exponen a una humedad relativa reducida y requieren un
costoso procedimiento de aclimatación.
Con la ventilación se reduce la humedad relativa dentro del vaso, pero también la
acumulación de gases como CO2 y etileno.
MURPHY et al. (1998) demostraron que con la inclusión de aperturas en los tubos
de cultivo, redujeron la frecuencia estomática y la apertura del estoma en
Delphinium. Se estableció un beneficio positivo de la ventilación en el crecimiento
de esta especie, pero es claramente importante determinar si el factor crítico es el
aumento en el movimiento del agua a través de la planta, o si es la reducción en la
concentración de algún componente gaseoso por debajo de una concentración de
estrés.
El usar aberturas en los tubos durante la fase III, en el enraizamiento, reduce la
densidad y apertura de los estomas, por consiguiente, una probable explicación a la
mejor sobrevivencia en la aclimatización por el mejoramiento en la estructura y
función estomática (SANTAMARÍA et al., 2000).
WARDLE, DOBBS y SHORT (1983) señalan que la reducción en el nivel de
humedad de la atmósfera dentro del tubo de cultivo, puede obviar la necesidad de
un período de aclimatación. Algunas especies de plantas crecidas por métodos in
vitro, pueden ser aclimatadas con niveles reducidos de humedad relativa dentro de
cinco días, esto sería beneficioso en la producción a gran escala de plantas, para
eliminar el tiempo de consumo y la labor intensiva de la fase de aclimatación.
ZIV y HAVELY (1993) y DEBERGH y MAENE (1981) señalan que reducir la
humedad relativa de los frascos de cultivo es un factor clave en la prevención de la
vitrificación, pero también disminuye el crecimiento de las plantas.
THOMAS (1998) utilizó sachet plásticos en la aclimatación, como barrera para el
aire reduciendo así el efecto de la deshidratación, así como la pérdida de agua en la
planta y en el medio. Concluyó que tres semanas con el sachet cerrado y una con el
sachet abierto, era suficiente para completar la aclimatación de plantas de vid in
vitro con una humedad de 68-75%.
FIGUEROA (2003) con cubiertas de polipropileno, consiguió disminuir la humedad
relativa al interior de los tubos de cultivo, teniendo en consideración que, según la
literatura, el papel aluminio mantiene una humedad relativa al interior del tubo de
cultivo cercana al 100%. Al preaclimatar, utilizando cubiertas de polipropileno, se
logró una mejor aclimatación de las plantas in vitro de violeta africana que al utilizar
cubiertas de papel aluminio, ya que se disminuyó la mortalidad obteniendo plantas
terminadas de gran desarrollo.
2.6. Morfología estomática:
La transpiración es la pérdida de agua en la planta en forma de vapor. Aunque una
pequeña cantidad del vapor de agua se puede perder a través de aberturas
pequeñas denominadas lenticelas, en la corteza del tallo y ramas jóvenes, la mayor
proporción (más del 90%) se escapa por las hojas (SÁNCHEZ-DIAZ y
AGUIRREOLEA, 2000).
La atmósfera se encuentra tan alejada de la saturación de agua, que la planta corre
peligro de deshidratación, es por esto que la cutícula sirve como barrera efectiva a
la pérdida de agua (SÁNCHEZ-DIAZ y AGUIRREOLEA, 2000).
Los mismos autores señalan que la cutícula es un depósito céreo dispuesto en
varias capas, que recubren la superficie externa de una hoja típica. Debido a que
estas ceras cuticulares son muy hidrófobas, ofrecen una resistencia muy elevada a
la difusión, tanto de agua líquida como de vapor de agua procedente de las células
subyacentes.
La integridad de la epidermis y de la cutícula que la recubre, es interrumpida por los
estomas.
SÁNCHEZ-DIAZ y AGUIRREOLEA (2000) señalan que los estomas proporcionan a
las
plantas
un
mecanismo
fundamental
para
adaptarse
a
un
ambiente
continuamente cambiante, permitiendo el intercambio físico activo entre las partes
aéreas de la planta y la atmósfera. El papel fundamental de los estomas es la
regulación de la pérdida de agua (transpiración) y la absorción de CO2 (asimilación
fotosintética del carbono). Además explican que los factores más importantes que
afectan la transpiración son: radiación, déficit de presión de vapor del aire,
temperatura, velocidad del viento y suministro de agua, y entre los factores propios
de la planta figuran: área foliar, estructura y exposición foliar, resistencia estomática
y capacidad de absorción del sistema radical.
En cuanto a morfología estomática, WARDLE, DOBBS y SHORT (1983) realizaron
un estudio en crisantemo (Chrysanthemun X moriflorum Ramat.) y coliflor (Brassica
oleracea L.) con remoción de epidermis de la superficie abaxial de las hojas
manifestando que las plantas in vitro tienen los estomas abiertos, debido a la alta
humedad relativa que presenta la condición in vitro.
SANTAMARÍA et al. (2000), indican que normalmente los estomas cierran como
respuesta a altas concentraciones de CO2, pero esto no ocurre in vitro, donde en
tubos sellados, la densidad estomática y la apertura de los estomas son mayores
que en las plantas que crecen bajo condiciones in vivo.
ZOBAYED, ARMSTRONG y ARMSTRONG (2001) observaron que la densidad
estomática en coliflor, era significativamente alta en plantas cultivadas en tubos
herméticos, disminuyendo al aumentar la ventilación en los tubos.
Otros autores como WETZEN y SOMMER (1982)
concuerdan con esto, y se
demostró en Liquidambar que la densidad estomática en hojas micropropagadas,
era significativamente alta con respecto a las de hojas de plantas cultivadas en
campo.
SCIUTTI y MORINI (1993), indicaron que la densidad estomática aumentó
notablemente en hojas de plantas de ciruelo crecidas bajo la condición in vitro, por
el aumento de la humedad relativa en la atmósfera de cultivo.
SANTAMARÍA et al. (2000), explican que la mayor sobrevivencia de las plantas de
Delphinium, en tubos ventilados, es debido a que reduce la densidad y la apertura
de los estomas, mejorando la función estomática.
3. MATERIALES Y MÉTODOS
Los ensayos se realizaron entre agosto del 2003 y agosto del 2004, en el
Laboratorio de Propagación “Profesor Gregorio Rosenberg” de la Facultad de
Agronomía de la Pontificia Universidad Católica de Valparaíso, ubicada en la calle
San Francisco s/n, La Palma, Provincia de Quillota, V región.
3.1. Obtención y cuidado del material:
El material utilizado correspondió a brotes de vid (Vitis vinifera L.), de los que se
extrajo segmentos nodales de la región apical y media obtenidas en febrero del
2004, desarrolladas al aire libre en la Estación Experimental ubicada en La Palma,
Quillota.
Los diámetros de estas secciones nodales fueron de 5 mm para la región apical y 8
mm para la región media (MESA, 2001).
La desinfección de este material, se realizó con Benlate más Captan en una
concentración de 1,8 g/l de cada uno, los cuales se sumergieron en esta solución
durante cinco minutos.
Posteriormente, las plantas se desinfectaron con hipoclorito de sodio al 1,5% más
una solución de ácido ascórbico 500 mg/l y ácido cítrico 500 mg/l, más Tween 20
por 10 minutos en un matraz Erlenmeyer, y se trasladaron a cámara de flujo laminar
donde se les sometió a tres enjuagues con agua bidestilada con antioxidante.
En cuanto al cerezo Gisela 5, las plantas se obtuvieron de un ensayo anterior
(CÁCERES, 2004), las cuales se encontraban desde diciembre del 2003 en un
medio de proliferación.
Los medios de cultivo se prepararon en base a soluciones madre stock, con agua
bidestilada para las diluciones. La formulación mineral está en base a medio de
sales de MURASHIGE y SKOOG (1962) con macronutrientes y micronutrientes
reducidos a tres cuartos.
El pH se ajustó a 5,3 con alícuotas de ácido clorhídrico 0,1 N o hidróxido de Potasio
0,1 N, para bajar o elevar respectivamente el pH.
En cuanto a vid, el medio de proliferación se preparó en base al medio de sales de
MURASHIGE y SKOOG (1962) con la sal NH4NO3, reducida a la mitad y el resto de
las sales reducidas a tres cuartos, ajustado a pH 5,7.
Respecto a cerezo Gisela 5, el medio se preparó en base a un medio de sales de
MURASHIGE y SKOOG (1962), suplementado con 0,5 mg/l de AIB y 1,5 mg/l de
BAP (CÁCERES, 2004).
El medio de enraizamiento en vid se preparó en base al medio de sales de
MURASHIGE y SKOOG (1962) con la sal NH4NO3, reducida a la mitad y el resto de
las sales reducidas a tres cuartos, ajustado a pH 5,7.
Respecto al cerezo Gisela 5, el medio se preparó en base a sales de MURASHIGE
y SKOOG (1962) con una concentración mineral reducida a la mitad suplementado
con 1 mg/l de AIB (CÁCERES, 2004).
3.2. Establecimiento de explantes:
Para la etapa de establecimiento y proliferación de explantes se utilizó tubos de
vidrio de 37 ml, con 10 ml de medio por unidad. El sellado correspondió a un
cuadrado de papel aluminio de 25 cm2, y sobre éste vitafilm. Posteriormente los
tubos fueron esterilizados en un autoclave a 121 ºC por 15 minutos.
Después en cámara de flujo laminar, se procedió a sembrar en cada tubo un
segmento nodal. Los diámetros de estas secciones nodales fueron de 5 mm para la
región apical y 8 mm para la región media, y en cámara de flujo se redujeron a
microestacas de 10 a 15 mm de longitud con un nudo cada una (MESA, 2001).
Después se llevó a cámara de crecimiento con temperatura y luminosidad
controlada.
3.3. Enraizamiento de explantes:
Para el enraizamiento, las microestacas de vid fueron repicadas a frascos de 150
ml, con 40 ml de medio por unidad. Con respecto a cerezo Gisela 5, el repique fue a
frascos de similar volumen (FIGURA 1).
Posterior al enraizamiento, las plantas se preaclimataron. Se esperó un
enraizamiento de 25 días para vid, y de 30 días para cerezo. En cuanto a la
preaclimatación, para el caso de vid, las plantas se mantuvieron sólo cinco días bajo
esa condición debido al severo estrés hídrico que éstas sufrieron. En cuanto a
cerezo, las plantas se mantuvieron 10 días, debido a que comenzaron a presentar
en algunos casos, deshidratación en algunas hojas apicales.
FIGURA 1. Planta micropropagada
enraizamiento.
de cerezo Gisela 5, en
la
etapa
de
3.4. Ensayo 1: Reducción de la humedad relativa con el uso de sellos de
polipropileno y papel filtro en la etapa de preaclimatación.
En este ensayo se evaluaron el uso de tres sellos para el cierre de los frascos de
cultivo, para reducir la humedad relativa al interior de éstos.
En el caso de vid, se realizaron tres tratamientos, con distintos sistemas de sellado,
con 20 repeticiones cada uno, estos sellos presentaban diferentes texturas y
porosidades para aumentar el grado de ventilación en el interior de los frascos, y
con ello la disminución de la humedad relativa. Los tratamientos fueron los
siguientes:
T0: Control con papel de aluminio
T1: Sello de polipropileno en tres capas
T2: Sello de papel filtro Whatman 1 o MFS Nº2
Estas cubiertas de polipropileno, se obtuvieron de las mascarillas empleadas en los
pabellones quirúrgicos, y se componen de tres telas de polipropileno de distintos
colores y porosidades, las cuales se dimensionaron en cuadrados de 7 cm2 y se
pesaron en una balanza electrónica marca Precisa, para poder determinar así,
mediante el peso una equivalencia en porosidad (FIGURA 2). La tela superior que
es de color verde pesó 90 mg, la tela intermedia, de color blanco 100 mg, y por
último, la inferior, también de color blanco 130 mg.
En cuanto al papel filtro, este correspondió al denominado Whatman 1 con su
correspondiente equivalencia en MFS Nº2, con un gramaje de 125 g/m2, y una
velocidad de filtración de 80 seg.
La ventaja que presentaron estos sellos, es la posibilidad de ser esterilizados. La
esterilización se realizó en una estufa de calor seco a 105 ºC, por un período de 48
hr.
FIGURA 2. Planta micropropagada de vid, en la etapa de enraizamiento con sello de
polipropileno.
En cuanto al cerezo Gisela 5, también se realizaron tres tratamientos con 30
repeticiones cada una, con los mismos sellos anteriormente descritos.
Las plantas de ambos ensayos, tras pasar 25 y 30 días respectivamente en un
medio de enraizamiento, se procedió en cámara de flujo laminar al cambio de sello,
para el caso de las plantas en tratamiento control, se les renovó el sello con papel
aluminio, para con esto provocar un mínimo intercambio gaseoso durante esta labor.
En cuanto al tratamiento 1 y 2, se retiró el sello de aluminio y se procedió a
cambiarlo por el sello correspondiente. Luego, los frascos fueron sellados por el
borde con vitafilm, con el fin de afirmar los sellos y teniendo la precaución de no de
cubrir la superficie (FIGURA 3).
Posteriormente los frascos se almacenaron en cámara de crecimiento, con
temperatura y luminosidad controlada por un período inicial de 20 días, para
posteriormente ser aclimatadas en sustrato.
Durante los días de enraizamiento, preaclimatación y finalmente en la aclimatación,
se midieron los siguientes parámetros:
Altura de la planta, diámetro de la planta, número de hojas con una lámina superior
a 8 mm, número total de hojas (n), color de hojas, altura del medio de cultivo (mm)
para determinar su agotamiento, vitrificación, y porcentaje de enraizamiento, se
consideró raíz aquella que presentara como mínimo 3 mm de largo.
Para la evaluación del color del explante en vid, se utilizó la tabla Munsell
(MUNSELL, 1998), asignando un número a cada color de explante:
1: 7,5 GY 4/4 (color verde oscuro)
2: 7,5 GY 5/8 (color verde característico de la especie)
3: 5 GY 7/10 (color verde-amarillo)
4: 5 Y 8/6 (color amarillo-café)
FIGURA 3. Plantas micropropagadas de cerezo Gisela 5, con sus distintos sellos, en
la cámara de crecimiento.
Para la evaluación del color del explante en cerezo, también se utilizó la tabla
Munsell (MUNSELL, 1998), asignando un número a cada color de explante:
1: 5 GY 4/8 verde oscuro
2: 5 GY 5/6 verde de la especie
3: 5 GY 6/8 verde claro
4: 5 GY 7/8 verde amarillo
Para evaluar el grado de vitrificación, fue utilizada una escala, asignando una
calificación a cada estado del explante:
1: Explante sin vitrificación
2: Explante con 50% de vitrificación
3: Vitrificación total del explante
El diseño fue conducido con un Diseño completamente al azar (DCA).
En las variables cuantitativas, altura de la planta, diámetro de la planta, número de
hojas con una lámina superior a 8 mm, número total de hojas, altura del medio de
cultivo, y porcentaje de enraizamiento, se realizó un análisis de varianza, para
determinar el efecto de los tratamientos, en caso de existir efecto de éstos, se aplicó
un test de separación de medias de Tukey, con un 95% de confianza.
En cuanto a la variable cualitativa vitrificación, esta se contrastó con un Test de
Tukey, debido a que la escala asignada a cada estado del explante correspondió a
una graduación, en donde cada estado es mejor que el anterior.
En cuanto a la variable cualitativa color, como no cumplió con las características
anteriormente citadas, se contrastó con el Test no paramétrico de Kruskal-Wallis.
3.5. Aclimatización:
Al transcurrir los días de preaclimatación, las plantas fueron retiradas de la
condición in vitro, para ser trasladadas al sustrato, en invernadero.
Las plantas se retiraron de la condición in vitro, y sus raíces se lavaron
cuidadosamente, para retirar restos adheridos de agar, y evitar con esto la
proliferación de patógenos en el sustrato. Posteriormente se sumergieron en una
mezcla de Benlate más Captan, con una concentración de 1,2 g/l respectivamente
por tres minutos.
Para el trasplante se utilizó como contenedores, vasos de plumavit de 230 ml, los
cuales fueron lavados y asperjados con una solución de hipoclorito de sodio a 1%.
En la base de estos contenedores se realizó cuatro perforaciones, para con ello
favorecer el drenaje. Posteriormente, se procedió a llenar los contenedores a dos
tercios de su capacidad con una mezcla de sustrato, previamente esterilizado en
autoclave durante 1 hora con 1,1 bar de presión y 121 ºC. El sustrato correspondió a
40% de tierra de hoja, 14% de tierra y 46% de arena.
Posteriormente, se regó los contenedores y se trasplantó con mucho cuidado la
planta proveniente de la condición in vitro, cuidando de no destruir raíces en caso de
que éstas estuvieran presentes.
A continuación, se cubrieron los contenedores con bolsas de polietileno
transparente de 10 * 15 cm, para mantener una alta humedad relativa, en las cuales
cada cinco días, se realizó un corte en uno de los extremos de la bolsa, para así a
los 20 días retirar completamente la bolsa. Transcurrido este tiempo se realizó la
última medición de las plantas.
En esta medición, se evaluó el porcentaje de sobrevivencia, la altura de las plantas
(mm), el diámetro de las plantas (mm), el número de hojas con una lámina superior
a 8 mm, el número total de hojas y el color (FIGURA 4).
3.6. Seguimiento de estomas en las etapas secuenciales in vitro:
De cada etapa secuencial in vitro, establecimiento, proliferación, enraizamiento,
preaclimatación (con sello de polipropileno y papel filtro) e in vivo, se realizó un
estudio histológico para analizar la evolución estomática.
Se tomó diversas hojas, y se procedió a fijarlas en FAA que consistió en solución de
5 ml de formalina, 5 ml de ácido acético glacial, y 90 ml de alcohol etílico al 70%.
En cuanto a las hojas tomadas en la etapa de preaclimatación, en estas se esperó
tres días, para proceder a fijarlas. Se esperó este tiempo, ya que en condiciones
experimentales, las plantas a los cinco días de preaclimatación, presentaron una
severa deshidratación, y este tipo de muestras deshidratadas completamente no
servían.
Estas muestras fueron analizadas en el laboratorio de Histología, perteneciente a la
Pontificia Universidad Católica de Valparaíso, donde se siguió el siguiente
procedimiento:
1. Fijación en FAA durante 48 hr.
2. Deshidratación en una serie de alcohol etílico en solución acuosa a distintas
concentraciones crecientes, porque la idea es que estos disolventes
intermediaros se mezclen con el fijador pero que no reaccionen con él.
3. Inclusión en parafina sólida en estufa a 56 ºC.
FIGURA 4: Plantas de cerezo Gisela 5, en la etapa de aclimatización.
4. Preparación del bloque de parafina.
5. Corte del bloque en micrótomo de 10 µ.
6. Montaje en un portaobjeto.
7. Tinción con Safranina y verde luz.
8. Observación al microscopio.
4. PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
4.1. Ensayo 1: Reducción de la humedad relativa, con el uso de sellos de
polipropileno y papel filtro en vid y cerezo en la etapa de preaclimatación.
En el análisis de varianza efectuado a los cinco días de enraizamiento in vitro en
vid, con un error del 5%, se determinó que no existió efecto de las cubiertas sobre
las variables medidas, esto puede haberse debido al corto tiempo transcurrido entre
el cambio de sello y la medición. En esta especie, no pudo realizarse mediciones
posteriores, debido a la severa deshidratación que sufrieron las plantas con la
ventilación provocada por los cambios de sellos, y debió cubrirse nuevamente los
frascos para evitar la muerte de las plantas.
El análisis de varianza (P=0,05), permitió determinar que no existió efecto de los
cambios de sellos sobre la altura de las plántulas de vid (CUADRO 1).
Esto concuerda con CASSELS y ROCHE (1994) y JACKSON et al. (1991), ya que
bajo condiciones de ventilación en los tubos de cultivo, no obtuvieron un aumento en
el crecimiento en S. tuberosum, Rosa, Dianthus sp, Gerbera y Ficus. Por su parte
WARDLE, DOBBS y SHORT (1983) señalan que las plantas de Brassica oleracea,
cultivadas en tubos ventilados, mostraron un reducido crecimiento. Además, SHORT
y ROBERTS (1987) indican que al reducir la humedad relativa en tubos ventilados
en plantas micropropagadas de crisantemo, se redujo notoriamente el crecimiento
de las plantas.
Esto no concuerda con lo señalado por COURNAC et al. (1991) y BLAZCOVÁ et al.
(1989), y que demostraron el aumento del crecimiento de las plantas, como
resultado de la mejora de la ventilación dentro de los vasos de cultivo en
Chenopodium rubrum y Solanum tuberosum.
CUADRO 1. Efecto de las cubiertas, sobre la altura de las plantas (mm) in vitro de
vid, a los cinco días de enraizamiento in vitro.
Tratamiento
Altura (mm) a los 5 días
T0 Control
15,13 a*
T1 Cubierta con sello de polipropileno
15,61 a
T2 Cubierta con papel filtro
15,11 a
* Promedios con letras iguales, indican que no existe diferencia significativa entre
los tratamientos, según Test de Tukey (P=0,05).
En cuanto a cerezo, el análisis de varianza, realizado en este caso en dos fechas, a
los cinco y a los 10 días de enraizamiento in vitro, se determinó (P=0,05) que no
existió efecto de los tratamientos en la altura de las plantas a los cinco días, con
respecto a los resultados obtenidos a los 10 días, estos siguieron la misma
tendencia estadística, aunque se observó un pequeño aumento en los valores
promedio (CUADRO 2). Esto también puede haberse debido al corto período
transcurrido entre una medición y otra, impidiendo respuesta diferencial por parte de
las plantas.
CUADRO 2. Efecto de las cubiertas, sobre la altura de las plantas (mm) in vitro de
cerezo Gisela 5, a los cinco y 10 días de enraizamiento in vitro.
Altura (mm)
Altura (mm)
a los 5 días
a los 10 días
T0 Control
11,62 a*
11,88 a*
T1 Cubierta con sello de polipropileno
11,75 a
12,03 a
T2 Cubierta con papel filtro
11,23 a
11,52 a
Tratamiento
* Promedios con letras iguales, indican que no existe diferencia significativa entre
los tratamientos, según Test de Tukey (P=0,05).
En cuanto a la variable diámetro para vid, al realizar el análisis de varianza, a los
cinco días de enraizamiento (P=0,05), se determinó que no existió diferencia
significativa con ninguno de los tratamientos aplicados (CUADRO 3).
CUADRO 3. Efecto de las cubiertas, sobre el diámetro (mm) de las plantas in vitro
de vid a los cinco días de enraizamiento in vitro.
Tratamiento
Diámetro (mm) a los 5 días
T0 Control
1,26 a*
T1 Cubierta con sello de polipropileno
1,19 a
T2 Cubierta con papel filtro
1,22 a
* Promedios con letras iguales, indican que no existe diferencia significativa entre
los tratamientos, según Test de Tukey (P=0,05).
En cerezo, al realizar el análisis de varianza a los cinco y 10 días de enraizamiento
(P=0,05), tampoco existió diferencia significativa con ninguno de los tratamientos
aplicados (CUADRO 4). En ambos casos, esto también pudo haberse debido al
corto tiempo transcurrido entre el establecimiento de los sellos y la primera
medición, y en el caso de cerezo además entre una medición y otra.
CUADRO 4. Efecto de las cubiertas, sobre el diámetro (mm) de las plantas in vitro
de cerezo Gisela 5, a los cinco y 10 días de enraizamiento in vitro.
Tratamiento
Diámetro (mm) a
Diámetro (mm) a
los 5 días
los 10 días
T0 Control
2,12 a*
2,14 a*
T1 Cubierta con sello de polipropileno
2,18 a
2,23 a
T2 Cubierta con papel filtro
2,02 a
2,19 a
* Promedios con letras iguales, indican que no existe diferencia significativa entre
los tratamientos, según Test de Tukey (P=0,5).
El análisis de varianza en vid, realizado a los cinco días de enraizamiento para las
variables número de hojas con una lámina superior a 8 mm y número total de hojas,
determinó que no existe diferencia significativa entre los tratamientos (CUADRO 5).
En cuanto a cerezo, para ambas variables, medidas el día cinco y el día 10 de
enraizamiento, al realizar el análisis de varianza, tampoco se determinó diferencia
significativa entre los tratamientos (CUADRO 6), pero a los 10 días de
enraizamiento en el tratamiento con cubierta de papel filtro, se apreció una
disminución en el número de hojas con una lámina superior a 8 mm, debido a la
desfoliación de algunas hojas que sufrieron algunas de las plantas, sin afectar esto
en la diferencia estadística significativa.
Por su parte SANTAMARÍA et al. (2000), señalan que en Delphinium se obtuvo una
menor área foliar en tubos con mayor ventilación. Por el contrario RITCHIE, SHORT
y DAVEY (1991), demostraron que en tubos de cultivo ventilados, se promovió un
incremento en el número de hojas y en la superficie foliar de plantas crecidas in
vitro. Esto coincide con SMITH (1991), quién indicó que al disminuir la humedad
relativa al interior del tubo de cultivo, observó una disminución en la longitud del
tallo, y un aumento en el área de la hoja en crisantemo, rosa y vid.
CUADRO 5. Efecto de las cubiertas, sobre el número de hojas con una lámina
superior a 8 mm, y número total de hojas, en las plantas in vitro de
vid, a los cinco días de enraizamiento in vitro.
Día 5
Tratamiento
N° hojas con lámina
superior a 8 mm
N° total de hojas
T0 Control
2,7 a*
4,4
a*
T1 Cubierta con sello de polipropileno
3,05 a
4,15 a
T2 Cubierta con papel filtro
2,2 a
3,35 a
* Promedios con letras iguales, indican que no existe diferencia significativa entre
los tratamientos, según Test de Tukey (P=0,05).
CUADRO 6. Efecto de las cubiertas, sobre el número de hojas con una lámina
superior a 8 mm, y número total de hojas, en las plantas in vitro de
cerezo Gisela 5, a los cinco y 10 días de enraizamiento in vitro.
Día 5
Día 10
N° hojas con
N° hojas con
Tratamiento
lámina
N° total de
lámina
N° total de
superior a 8
hojas
superior a 8
hojas
mm
mm
T0 Control
T1 Cubierta con sello de
polipropileno
T2 Cubierta con papel filtro
9,17 a*
9,97 a*
9,33 a*
9,97 a*
9,53 a
10,63 a
9,63 a
10,93 a
8,0
9,67 a
7,97 a
9,53 a
a
* Promedios con letras iguales, indican que no existe diferencia significativa entre
los tratamientos, según Test de Tukey (P=0,05).
El test de Tukey (P=0,05), realizado para la variable altura del medio de cultivo, en
vid a los cinco días de enraizamiento, demostró que existen diferencias significativas
entre los tratamientos. En el CUADRO 7, se puede observar que el mayor
agotamiento ocurrió en los tubos con mayor ventilación, en los tratamientos con
cubierta con sello de polipropileno y con cubierta de papel filtro.
CUADRO 7. Efecto de las cubiertas, sobre la altura del medio de cultivo (mm), en
las plantas in vitro de vid, a los cinco días de enraizamiento in vitro.
Tratamiento
Altura del medio de cultivo
(mm) a los 5 días
T0 Control
19,86 a*
T1 Cubierta con sello de polipropileno
17,82
b
T2 Cubierta con papel filtro
17,26
b
* Promedios con letras iguales, indican que no existe diferencia significativa entre
los tratamientos, según Test de Tukey (P=0,05).
Por su parte en el CUADRO 8, en que se evaluó el efecto de las cubiertas sobre la
altura del medio en cerezo, en los días cinco y 10 de enraizamiento, el Test de
Tukey (P=0,05), también demostró que existen diferencias significativas entre los
tratamientos.
CUADRO 8. Efecto de las cubiertas, sobre la altura del medio de cultivo (mm), en
las plantas in vitro de cerezo Gisela 5, en el día cinco y 10 de
enraizamiento in vitro.
Altura del medio
Tratamiento
Altura del medio
de cultivo (mm) a de cultivo (mm) a
los 5 días
los 10 días
T0 Control
16,49 a*
16,17 a*
T1 Cubierta con sello de polipropileno
15,55
b
13,43
b
T2 Cubierta con papel filtro
15,33
b
13,34
b
* Promedios con letras iguales, indican que no existe diferencia significativa entre
los tratamientos, según Test de Tukey (P=0,05).
MURPHY et al. (1998) observaron que la pérdida de peso del medio, se debía a la
ganancia en peso de la planta, y
a la evapotranspiración, pero en tubos más
ventilados, la ganancia en peso por parte de la planta era reducida y la pérdida en
peso del medio era casi cinco veces mayor, que en tubos sellados con papel
aluminio.
La variable vitrificación al ser analizada con el análisis de varianza para el caso de
cerezo (CUADRO 9), no presentó diferencia significativa entre los tratamientos. En
cuanto a vid, estos datos no se analizaron estadísticamente, porque las plantas no
presentaron vitrificación.
SHORT y ROBERTS (1987) indican que el reducir la humedad relativa al interior de
los frascos de cultivo, es un factor clave en la prevención de la vitrificación, pero
también disminuye el crecimiento de las plantas.
CUADRO 9. Efecto de las cubiertas, sobre la vitrificación, en las plantas in vitro de
cerezo Gisela 5, en el día cinco y 10 de enraizamiento in vitro.
Tratamiento
Vitrificación a los Vitrificación a los
5 días
10 días
T0 Control
1,03 a*
1,03 a*
T1 Cubierta con sello de polipropileno
1,07 a
1,07 a
T2 Cubierta con papel filtro
1,07 a
1,07 a
* Letras iguales, indican que no existe diferencia significativa entre los tratamientos,
según Test de Tukey (P=0,05).
La variable color, a los cinco días de enraizamiento en vid, al ser analizada con el
test no paramétrico de Kruskal-Wallis (P=0,05) demostró diferencias estadísticas
significativas. El número asignado a cada color de explante correspondió a 1: 7,5
GY 4/4 (color verde oscuro), 2: 7,5 GY 5/8 (color verde característico de la especie),
3: 5 GY 7/10 (color verde amarillo), y 4: 5 GY 8/6 (color amarillo café). En el
tratamiento control, las plantas presentaron el color verde característico de la
especie (7,5 GY 5/8), según la tabla MUNSELL (1998), representado por el valor
2,45. Los otros tratamientos presentaron un color verde amarillo (5 GY 7/10), muy
cercano al amarillo café (5 Y 8/6), representados por el valor 3,7 en el tratamiento
con cubierta de sello de polipropileno y 3.95 en las plantas con cubierta de papel
filtro, debido a que estas plantas se vieron fuertemente estresadas por el cambio en
la ventilación de los frascos (CUADRO 10).
En cuanto a cerezo, el número asignado a cada color de explante correspondió a 1:
5 GY 4/8 (color verde oscuro), 2: 5 GY 5/6 (color verde de la especie), 3: 5 GY 6/8
(color verde claro) y 4: 5 GY 7/8 (color verde amarillo). En este ensayo no hubo
diferencia estadística significativa entre los tratamientos a los cinco y 10 días de
enraizamiento, a los cinco días se mantuvo el color de las plantas en los tres
tratamientos, representado por el número 2,4 que corresponde al color verde
característico de la especie 5 GY 5/6 MUNSELL (1998), a los 10 días de
enraizamiento el color se mantuvo, representado por los valores 2,4 en el
tratamiento control y en el con cubierta de papel filtro, y 2,53 en el tratamiento con
sello de polipropileno (CUADRO 11).
CUADRO 10. Efecto de las cubiertas sobre el color, en las plantas in vitro de vid, en
el día cinco de enraizamiento in vitro.
Tratamiento
Color a los 5 días
T0 Control
2,45
b*
T1 Cubierta con sello de polipropileno
3,7
T2 Cubierta con papel filtro
3,95 a
a
* Letras iguales, indican que no existe diferencia significativa entre los tratamientos,
según Test de Kruskal-Wallis (P=0,05).
CUADRO 11. Efecto de las cubiertas sobre el color, en las plantas in vitro de cerezo
Gisela 5, en el día cinco y 10 de enraizamiento in vitro.
Tratamiento
Color a los 5 días
Color a los 10 días
T0 Control
2,4 a*
2,4
a*
T1 Cubierta con sello de polipropileno
2,4 a
2,53 a
T2 Cubierta con papel filtro
2,4 a
2,4
a
* Letras iguales, indican que no existe diferencia significativa entre los tratamientos,
según Test de Kruskal-Wallis (P=0,05).
Para evaluar el enraizamiento se aplicó un test de comparación de proporciones
(P=0,05), en cuanto a vid, existe diferencia significativa entre tratamientos,
obteniéndose un menor porcentaje de enraizamiento en los tratamientos con frascos
ventilados. En cuanto a la sobrevivencia, no se determinó diferencia estadística
significativa (CUADRO 12).
La presencia de raíces in vitro, es una condición muy importante, ya que estas
influyen en la sobrevivencia posterior de las plantas, aunque hay controversias al
respecto, por un lado DEBERGH y MAENE (1981), señalan que las raíces
producidas in vitro, morían después del trasplante a condiciones de invernadero, y
eran completamente reemplazadas por nuevas raíces ex vitro, a diferencia de lo
dicho por APTER, DAVIES y MC WILLIAMS (1993), quienes señalan que en
microestacas de Trachelospermun asiaticum enraizadas in vitro, sus raíces no eran
reemplazadas, sino que sobrevivían al trasplante y a la aclimatización, y al comparar
morfológicamente las conexiones xilemáticas entre la raíz y tallo, de raíces in vitro y
ex vitro, descubrieron que estaban igualmente desarrolladas. Esto también es
corroborado por MIRANDA (1996), al comparar morfológicamente raíces in vitro e in
vivo, en dos portainjertos de cítricos, ya que observó una conexión xilemática
continua entre la raíz neoformada in vitro y el tallo.
CUADRO 12. Efecto de las cubiertas sobre el porcentaje de enraizamiento a los
cinco días, en las plantas de vid in vitro, y la sobrevivencia, a los 21
días después de la aclimatización en sustrato.
Tratamiento
Sobrevivencia (%)
Enraizamiento (%)
a los 5 días
(21 días después de
aclimatización en sustrato)
T0 Control
45 a*
25 a*
T1 Cubierta con sello de polipropileno
15
b
10 a
T2 Cubierta con papel filtro
15
b
30 a
* Letras iguales indican que no existe diferencia significativa entre los tratamientos,
según Test de Comparación de Proporciones (P=0,05).
En cerezo no se determinó diferencia estadística significativa en el porcentaje de
enraizamiento entre los tratamientos, y tampoco en la sobrevivencia (CUADRO 13).
Se puede inferir de manera preliminar, que una planta enraizada in vitro, tendría un
mayor éxito ex vitro, ya que el mayor porcentaje de enraizamiento en cerezo influyó
positivamente en la mayor sobrevivencia de las plantas después de ser
trasplantadas a sustrato, a diferencia de vid, en que un bajo porcentaje de
enraizamiento, significó una baja sobrevivencia de las plantas.
CUADRO 13. Efecto de las cubiertas sobre el porcentaje de enraizamiento a los
cinco y 10 días, en las plantas de cerezo Gisela 5 in vitro, y la
sobrevivencia, a los 21 días después de la aclimatización en sustrato.
Enraizamiento Enraizamiento
Tratamiento
T0 Control
T1
Cubierta
con
sello
de
Sobrevivencia (%)
(21 días después
a los 5 días
a los 10 días
(%)
(%)
63,3 a*
66,6 a*
60
a*
70,0 a
73,3 a
60
a
66,6 a
73,3 a
56,7 a
de aclimatización
en sustrato)
polipropileno
T2 Cubierta con papel filtro
* Letras iguales indican que no existe diferencia significativa entre los tratamientos,
según Test de Comparación de Proporciones (P=0,05).
En cerezo y en vid, no hubo relación entre la ventilación de los tubos y la
sobrevivencia, a diferencia de lo reportado por MURPHY et al. (1998), en
Delphinium, donde la sobrevivencia de plantas micropropagadas mejoró en los
tratamientos con tubos ventilados, pero si concuerdan con este mismo autor en la
especie Hosta, en que no hubo efecto de la ventilación en la sobrevivencia.
Por su parte, FAULKS y MUDGE (1996) y THOMAS (1998) señalan que la
sobrevivencia de las vides micropropagadas, comparada con otras especies
leñosas, es relativamente baja.
Al analizar el efecto de los tratamientos sobre la altura de la planta en cerezo
(CUADRO 14), no se encuentra diferencia estadística significativa, esto se mantiene
con respecto a las mediciones anteriores en esta variable.
En cuanto al efecto de los tratamientos en el diámetro (mm), estos tampoco
presentan diferencia estadística significativa, esto también se mantiene con respecto
a la medición anterior en esta variable (CUADRO 15).
CUADRO 14. Efecto de los tratamientos en la altura (mm) de plantas
micropropagadas de cerezo Gisela 5, a los 21 días de
aclimatización en sustrato.
Tratamiento
Altura de las plantas (mm) a los 21
días de aclimatización
T0 Control
12,1
a*
T1 Cubierta con sello de polipropileno
12,05 a
T2 Cubierta con papel filtro
11,53 a
* Promedios con letras iguales, indican que no existe diferencia significativa entre
los tratamientos, según Test de Tukey (P=0.05).
CUADRO 15. Efecto de los tratamientos en el diámetro (mm) de las plantas
micropropagadas de cerezo Gisela 5, a los 21 días de aclimatización
en sustrato.
Tratamiento
Diámetro de las plantas (mm) a
los 21 días de aclimatización
T0 Control
2,4 a*
T1 Cubierta con sello de polipropileno
2,52 a
T2 Cubierta con papel filtro
2,37 a
* Promedios con letras iguales, indican que no existe diferencia significativa entre
los tratamientos, según Test de Tukey (P=0,05).
Con respecto al número de hojas con una lámina mayor a 8 mm, y el número total
de hojas en plantas micropropagadas de cerezo, no se determinó diferencia
estadística significativa entre los tratamientos (CUADRO 16).
En cuanto a la variable color, esta tampoco presentó diferencia estadística
significativa entre tratamientos, representada por el valor promedio 3,3 en el
tratamiento control, 3,4 en el tratamiento con sello de polipropileno y 3,23 en el
tratamiento con papel filtro, que corresponde al número tres asignado al color 5 GY
6/8, MUNSELL (1998) que es el color cercano al verde claro (CUADRO 17).
CUADRO 16. Efecto de los tratamientos en el número de hojas con una lámina
superior a 8 mm, y el número total de hojas, en plantas
micropropagadas de cerezo Gisela 5, a los 21 días de aclimatización
en sustrato.
N° hojas con lámina
N° total de hojas a los
mayor a 8 mm a los 21
21 días de
días de aclimatización
aclimatización
T0 Control
6,59 a*
6,64 a*
T1 Cubierta con sello de polipropileno
8,09 a
8,27 a
T2 Cubierta con papel filtro
6,23 a
6,73 a
Tratamiento
* Promedios con letras iguales, indican que no existe diferencia significativa entre
los tratamientos, según Test de Tukey (P=0,05).
CUADRO 17. Efecto de los tratamientos en el color de cerezo Gisela 5, a los 21 días
de aclimatización en sustrato.
Tratamiento
Color a los 21 días de
aclimatización en sustrato
T0 Control
3,3 a*
T1 Cubierta con sello de polipropileno
3,4 a
T2 Cubierta con papel filtro
3,23 a
* Letras iguales, indican que no existe diferencia significativa entre los tratamientos,
según Test de Kruskal-Wallis (P=0,05).
4.2. Análisis de cortes histológicos, en las distintas etapas secuenciales in
vitro, e in vivo de vid, mediante el uso de fotografías:
4.2.1. Etapa de establecimiento
En los cortes histológicos obtenidos del material vegetal colectado y fijado en esta
condición, se pudo observar estomas abiertos, completamente desarrollados, pero
también se apreció una gran cantidad de estomas más pequeños y cerrados
(FIGURA 5). Esto pareciera contraponerse a lo propuesto por diversos autores, que
menciona que en la condición in vitro, los estomas de las hojas permanecen
abiertos, pero es claro que el estoma pasa por un período de formación o
maduración que finaliza con un estoma completamente desarrollado. Son WARDLE,
DOBBS y SHORT (1983) quienes proponen una categorización de estas etapas en:
a) aparición de la célula madre de las de guarda, b) célula madre dividida pero sin
poro evidente, c) formación evidente del poro y d) estoma completamente
desarrollado.
Siendo ésta la primera etapa de la propagación in vitro, era muy probable encontrar
estomas inmaduros en los cortes histológicos, siendo éstos los que se observaron
de menor tamaño y cerrados. Estos posteriormente se desarrollan y se mantienen
durante las etapas siguientes de la propagación.
4.2.2. Etapa de proliferación
En esta etapa más avanzada de la micropropagación, los estomas pertenecientes a
las hojas formadas en la condición in vitro ya se encuentran completamente
maduros, encontrándose todos en la etapa de estoma completamente desarrollado,
con poro claramente visible, de acuerdo a la clasificación definida por WARDLE,
DOBBS y SHORT (1983). Debido a la condición de alta humedad relativa (cercana
al 100%) los estomas desarrollados en la condición in vitro son ineficientes en su
capacidad de cerrar
el poro, concordando con lo observado por GRIBAUDO,
NOVELLO y RESTAGNO (2001). Es por esta condición, que todos los estomas
observados mostraban sus estomas completamente abiertos. (FIGURA 5).
4.2.3. Etapa de enraizamiento
Los estomas observados en los cortes histológicos, en las plantas de vid, en esta
etapa, muestran la misma condición que presentaba en proliferación, dado que se
encuentran en las mismas condiciones anteriormente descritas, es decir, estomas
completamente maduros y abiertos (FIGURA 5).
4.2.4. Etapa de preaclimatación
Transcurridos los tres días de preaclimatación y al observar los cortes histológicos
obtenidos a partir del material vegetal fijado proveniente de esta condición se pudo
apreciar que un porcentaje bajo de estomas se mostraba alargado, no totalmente
turgente. GRIBAUDO, NOVELLO y RESTAGNO (2001) mencionan que los estomas
desarrollados en una condición de baja humedad relativa o en una condición ex vitro
son más alargados, pero debido a que este no es el caso, ya que son estomas
formados en una condición in vitro y expuestos a una menor humedad relativa
ambiental, el aparente alargamiento sería por una pérdida del agua contenida en las
células de guarda provocada por la alta demanda ambiental, debido a su bajo
potencial hídrico atmosférico (FIGURA 5).
4.2.5. Etapa in vivo
En estos cortes histológicos, se observó estomas en los distintos estados de
madurez, lo que es normal para una planta mantenida en la condición ex vitro,
además de estomas cerrados y abiertos (FIGURA 5).
Existen varias condiciones que dificultan el aprovechamiento de la tecnología de
análisis de imágenes en el seguimiento de la condición estomática durante las
distintas etapas de la propagación in vitro. La primera deriva de la flexibilidad natural
que tienen las hojas de la vid, que dificultan, en gran medida, la obtención de cortes
longitudinales con el micrótomo por lo que la mayoría de los cortes analizados
fueron hechos de manera transversal. La segunda condición está relacionada con la
anterior y corresponde a la característica mencionada por GRIBAUDO, NOVELLO y
RESTAGNO (2001) acerca de las hojas de la vid que presentan una condición
hipoestomática (estomas sólo en el enves). En conjunto estas dos situaciones
impiden realizar una adecuada determinación de la densidad estomática en un área
conocida debido a que los estomas se encuentran concentrados en una parte de la
imagen (enves), siendo el resto un espacio vacío y no repartidos en una zona
amplia, que corresponda en un 100% a la superficie de la hoja, como la que se
observaría en un corte longitudinal. Esto es alterado también por los objetivos
instalados en el microscopio óptico, ya que el objetivo de 10X entrega una imagen
muy general en la que es difícil distinguir claramente la morfología de la hoja y el de
40X entrega un campo de visión reducido. Un objetivo intermedio permitiría un mejor
análisis de las imágenes.
Por último, si bien es cierto que los programas de análisis de imágenes permiten,
luego de un ajuste de la escala realizar mediciones muy precisas, pudiendo
fácilmente entregar mediciones en micrones (µm), la gran variación entre los
tamaños y formas de los estomas, hacen que la precisión no sea útil para efectos de
análisis de una muestra fijada, sino que sería necesario hacer un seguimiento de
cómo van madurando y desarrollándose individualmente los estomas en el tiempo.
Esto es corroborado por FILA et al. (1998) en observaciones microscópicas de
impresiones epidermales de hojas in vitro, que demostraron una alta heterogeneidad
en las dimensiones de los estomas, y esto podría asociarse con la funcionalidad
también heterogénea.
A
B
C
D
E
F
FIGURA 5. Plantas micropropagadas de vid en las etapas de A) establecimiento, se
observan estomas de menor tamaño cerrados y estomas de mayor
tamaño abiertos; B) proliferación, se observan totalmente abiertos; C)
enraizamiento, se observan completamente maduros y abiertos; D)
preaclimatación con sellos de mascarilla, se observan completamente
desarrollados y abiertos; E) preaclimatación con sellos de papel filtro,
acá también se observaron estomas abiertos y algunos de forma
alargada y F) Estomas de plantas in vivo, se observan distintos estados
de madurez.
5. CONCLUSIONES
Las pruebas estadísticas no mostraron diferencias significativas entre los distintos
sistemas de sellado en la etapa de preaclimatación aplicados a plantas de vid y
cerezo Gisela 5.
Debido a lo anterior, no habría necesidad de aplicar métodos de preaclimatación a
ninguna de estas especies.
Al preaclimatar, no se logró aumentar la sobrevivencia de las plantas de vid y cerezo
micropropagadas.
Al analizar, mediante el uso de fotografías de cortes histológicos, la condición en la
que se presentaban los estomas en cada una de las etapas secuenciales, se
determinó que en todas las etapas in vitro, los estomas se encontraron abiertos, y
en la etapa in vivo, se apreció una alta heterogeneidad entre estomas cerrados y
abiertos.
6. RESUMEN
En el Laboratorio de Propagación “Profesor Gregorio Rosenberg”, de la Facultad de
Agronomía de la Pontificia Universidad Católica de Valparaíso, ubicada en la calle
San Francisco s/n, la Palma, Provincia de Quillota, V Región, se evaluó distintos
sistemas de sellado en la etapa de preaclimatación de plantas de vid (Vitis vinifera
L.) y cerezo (Prunus cerasus x Prunus canescens) Gisela 5 propagadas in vitro, y
posteriormente se evaluó la sobrevivencia de estas plantas en la etapa de
aclimatización.
Como explante, en la etapa de establecimiento, se utilizó segmentos nodales, los
que posteriormente fueron repicados en las etapas de la micropropagación. Los
ensayos de preaclimatación se realizaron durante la etapa de enraizamiento in vitro.
Como medio de enraizamiento para vid se trabajó con un MS (MURASHIGE y
SKOOG, 1962), con la sal NH4NO3, reducida a la mitad y el resto de las sales
reducidas a tres cuartos, adicionado con tiamina (0,4%), AIA (0,2 mg/l), NaH2PO4
(150 mg/l), Myoinositol (25 mg/l), sacarosa al 1%, y todo esto ajustado a pH 5,7
(MESA, 2001). En cuanto a cerezo, el medio de enraizamiento también se realizó en
base a sales de MURASHIGE y SKOOG (1962) con una concentración mineral
reducida a la mitad suplementado con 1 mg/l de AIB (CÁCERES, 2004).
En el ensayo para ambas especies por igual, se realizó tres tratamientos, el primero
correspondiente al control con papel de aluminio, el segundo con sellos de
polipropileno en tres capas y el tercero con un sello de papel filtro Whatman 1 o
MFS N°2, posteriormente los frascos se sellaron por la parte lateral con vitafilm,
para afirmar las cubiertas.
Para ambos casos, no hubo diferencia estadística significativa en la sobrevivencia
de las plantas al aplicar los tratamientos.
Al analizar, mediante fotografías los cortes histológicos en vid, en las distintas
etapas secuenciales, se observó en todas las etapas in vitro, los estomas abiertos, y
en la etapa in vivo, una alta heterogeneidad entre estomas abiertos y cerrados.
7. ABSTRACT
In the Professor Gregorio Rosenberg Propagation Laboratory, at the Agronomy
Faculty of the Pontificia Universidad Católica de Valparaíso, La Palma, province of
Quillota, V region, different seal systems for the pre-acclimation stage of grapevine
(Vitis vinifera L.) and Gisela 5 cherry (Prunus cerasus x Prunus canescens) in vitro
propagated plants were evaluated and later, the survival of these plants, in the
acclimatization stage, was analyzed.
As an explant, in the establishment stage, nodal segments were used, which were
later divided in the micropropagation stages. The preacclimation tests were carried
out during the in vitro rooting stage. As a rooting medium for the grapevine, an MS
(MURASHIGE and SKOOG, 1962) was used, with the salt NH4NO3 reduced to one
half strength and the rest of the salts reduced to three quarters of their original
strength, additional thyamine (0,4%), IAA (0,2 mg/l), NaH2PO4 (150 mg/l),
Myoinositol (25 mg/l), and sacarose (1%), all adjusted to a pH of 5,7 (MESA, 2001).
For cherry, the rooting medium was also made based on the MURASHIGE and
SKOOG (1962) salts, with a mineral concentration reduced by half and adding 1 mg/l
of IBA (CÁCERES, 2004).
For experiments on both species, there were 3 treatments: the first was a control,
with aluminium foil, the second used polypropylene seals, and the third one used
Whatman 1 or MFS Nº2 filter paper seals. Later on the jars were sealed, on the side,
with vitafilm, in order to secure the covers.
In both cases, there was no significant statistical difference on the plant survival after
application of the treatments.
When analyzing, by photograph, the histological cuts of the grapevines, in the
different sequential stages, it was seen that, during all of the in vitro stages, stomata
were open and that during the in vivo stages, there was a high heterogeneity
between open and closed stomata.
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