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Inhibición enzimática
Temario
Inhibición de las reacciones enzimáticas. Inhibición reversible:
modelos competitivo, no competitivo, acompetitivo y mixto. Cinéticas
en presencia de inhibidores. Representaciones gráficas. Inhibición
irreversible. Inhibidores como análogos al estado de transición y al
sustrato.
Bibliografía
“Cálculos de Bioquímica”. Segel
“Biochemistry”, Mathews and Van Holde (2nd, 3rd eds.)
Bibliografía específica
Mechanism in protein chemistry. Jack Kyte. Garland Publishing. Inc.
1995.
Structure and Mechanism in protein science. A guide to enzyme
catalysis and protein folding. Alan Fersht. W. H. Freemand. 1998
Understanding
enzyme
inhibition.
R
Ochs.
Journal
of
Chemical
Education, 77, 11, 1453-1456. 2000.
Thremodynamic and extrathermodynamic requirements of enzyme catálisis.
R Woldfenden. Biophysical Chemistry 105:559-572. 2003.
Preguntas conceptuales
1 Cuales son las principales formas de inhibición enzimática? Describa
cada una de ellas con gráficos y ecuaciones.
2 Que características tendría un inhibidor competitivo? Y uno nocompetitivo?
3 Mencione la importancia biológica del fenómeno de la inhibición
enzimática.
4 Esquematice un protocolo para evaluar a) la presencia de un
inhibidor reversible/irreversible, b) determinar el tipo de inhibición
reversible
Problemas
1. El factor letal que secreta el Bacillus anthracis (LF) muestra una
actividad proteolítica sobre el extremo amino terminal de una proteína
kinasa de células eucarióticas. La actividad enzimática del LF es
proporcional al cuadro citotóxico de los tejidos afectados.
Se ha visto que el LF reconoce aminoácidos hidrofóbicos y positivos en
la proteína kinasa. Un posible sustrato artificial del LF es el
péptido AcRRRRVLRpNA. AL estudiar la actividad de la LF en función de
la
concentración
de
este
péptido
se
encuentra
el
siguiente
comportamiento:
Podría proponer un
actividad de la LF?
modelo
que
explique
el
comportamiento
de
la
2. En un conjunto de serina proteasas (tripsina, quimiotripsina,
elastasa por ejemplo) se ha detectado que existe un estado de
transición donde una serina clave en el mecanismo de reacción (de ahí
el nombre de este grupo de enzimas) forma un estado de transición
tetraédrico. Para desarrollar posibles inhibidores de la acción de
estas enzimas se diseñaron compuestos que tenían cierta semejanza unos
con el sustrato y otros con el estado de transición tetraédrico. Cuál
de los dos tipos de inhibidores esperaría que ejerciera su acción más
eficientemente? Justifique su respuesta.
3. En un experimento en el que se midió la velocidad inicial de
reacción (usando concentración constante de enzima y concentraciones
variables de sustrato), tanto en presencia como en ausencia de un
inhibidor, se obtuvieron los resultados que se muestran en la tabla a
la izquierda.
a. Con estos datos determine kM, vmáx y Ki en ausencia y presencia de
inhibidor.
b. ¿Qué clase de inhibidor se ha utilizado?
Sustrato
(M)
1.0x10-4
1.5x10-4
2.0x10-4
5.0x10-4
7.5x10-4
v0 (µmoles/min)
sin
inhibidor
28
36
43
63
74
con inhibidor
(2.2.10-4M)
18
24
30
51
63
4. Se estudió la respuesta cinética de una enzima a diferentes
concentraciones de sustrato, en presencia y ausencia de un inhibidor I
presente en concentración 2.0x10-3 M. En la tabla a la derecha se
muestran los resultados obtenidos.
a. ¿Cuáles son los valores de vmáx y kM en ausencia y en presencia de
I?.
b. ¿Qué tipo de inhibidor es? ¿Puede asegurarlo?
c. ¿Cuál sería la constante de disociación KI del inhibidor?
v0 (µmoles/min)
Sustrato (M)
-I
0.3x10-5
10.4
0.5x10-5
14.5
1.0x10-5
22.5
-5
3.0x10
33.8
9.0x10-5
40.5
+I
7.4
10.7
16.0
24.0
28.8
5. La glucoquinasa cataliza la siguiente reacción:
glucosa + ATP
glucosa-6-fosfato + ADP
El curso de la reacción se puede seguir colorimétricamente por el
método
de
Somogyi-Nelson
(titulación
de
glucosa
remanente
no
fosforilada, previa precipitación de la glucosa-6-P como sal de
bario). Se midió la actividad de una preparación de glucoquinasa en
una mezcla de reacción de 1 ml que contenía 0.4 ml de glucosa 0.01M,
0.05 mg de enzima, suficiente Mg+2, ATP en exceso, todo en buffer pH
7.0.
a. Si a los 3 minutos quedaron 3.91 µmoles de glucosa por ml de mezcla
de reacción, calculen la velocidad inicial de la reacción expresada en
µmoles de glucosa transformada por minuto.
b. Calcule la vmáx sabiendo que kM = 0.8x10-2 M.
c. Calcule la cantidad total de glucosa fosforilada en los primeros 6
minutos, cuando a la mezcla de reacción se le agregan 0.6 ml de
glucosa 0.01 M y 0.05 mg de enzima.
d. La glucosa-1,6-difosfato tiene una acción inhibitoria sobre este
sistema
enzimático.
Esquematice
un
protocolo
para
determinar
experimentalmente qué tipo de inhibidor es.
6. La enzima glucógeno sintasa cataliza la extensión de moléculas de
glucógeno, según la reacción:
UDP-Glc + (Glc)n
UDP + (Glc)n+1.
Se puede seguir el curso de la reacción mediante la medida de UDP
liberado. Se realizó una serie de mezclas de reacción (10 ml volumen
final) con distintas concentraciones de UDP-Glc, obteniéndose los
siguientes resultados de v0 en cada mezcla:
[UDP-Glc]
0.8
mmol/lt
v0
(µmol/min 0.100
UDP)
1.4
3.3
5.0
0.125
0.220
0.250
Cuando se repitió el experimento en presencia de ATP (2.5 mM), se
obtuvieron los siguientes resultados:
[UDP-Glc]
0.8
1.4
3.3
5.0
mmol/lt
v0
(µmol/min 0.020
0.033
0.067
0.100
UDP)
¿Cuál es el efecto del ATP? ¿Cómo lo expresaría en forma cuantitativa?
Fundamente con un modelo de acción del ATP.