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GUÍA NO 1
EXAMEN EN FRESCO, COLORACIÓN DE GRAM, COLORACIONES
ESPECIALES. MÉTODOS DE SIEMBRA. CULTIVOS EN MEDIOS SIMPLES,
ENRIQUECIDOS Y SELECTIVOS; LÍQUIDOS, SEMISÓLIDOS Y SÓLIDOS.
OBJETIVOS:
1. Observar la diversidad de la ecología microbiana oral por medio del empleo de
técnicas como el examen en fresco, coloraciones y siembra en medios de
cultivo.
2. Realizar la técnica de coloración de Gram utilizando diversas cepas
bacterianas.
3. Diferenciar la utilidad de medios de cultivo líquidos, sólidos y semisólidos;
simples, enriquecidos y selectivos; para sembrar diversos microorganismos.
4. Aplicar algunas técnicas de siembra para crecimiento bacteriano.
INTRODUCCIÓN:
Un buen diagnóstico de laboratorio depende principalmente de que, la
muestra clínica se tome en el momento apropiado, del lugar adecuado y de su
envío rápido y en el medio ideal de transporte en caso de requerirlo. Los
exámenes rutinarios que se hacen a una muestra incluyen, examen directo el cual
se puede hacer para analizar la muestra en fresco y/o por coloración y siembras
en diversos medios de cultivo que permiten el reconocimiento del microorganismo.
Según las características de las bacterias y de la muestra se pueden
visualizar diversas estructuras bacterianas. La coloración de Gram es la más
utilizada en Microbiología y permite realizar una gran clasificación de las bacterias.
Estructuras como la cápsula y la endospora pueden observarse gracias a tinciones
especiales como son el Rojo Congo y la tinción de Wayson respectivamente. La
tinción de Ziehl-Neelsen permite visualizar bacterias ácido-alcohol resistentes.
Obtener y observar el crecimiento bacteriano en el laboratorio de
Microbiología es muy importante, ya que permite continuar con pruebas que
conllevan a la identificación del microorganismo. De acuerdo a las necesidades
particulares de las bacterias y de los fines perseguidos para su aislamiento, se
utilizan distintos medios de cultivo. Estos deben proporcionarle a los
microorganismos los nutrientes necesarios y las condiciones óptimas para el
crecimiento microbiano.
MATERIALES Y REACTIVOS:
Muestras de placa dental o mucosas
Cultivos de bacterias Gram positivas y Gram negativas
Escobillones
Láminas portaobjeto
Láminas cubreobjeto
Microscopio
Asa bacteriológica
Colorantes de Gram
Aceite de inmersión
Cajas con Agar Sangre
Tubo con medio SIM
Tubo con Caldo Tripticasa Soya
Tubo con solución salina
PROCEDIMIENTO:
* Examen en Fresco
 Recolecte una muestra de placa dental o mucosas utilizando un escobillón y
emulsiónela en el tubo con solución salina.
 Deposite unas pocas gotas de solución salina en una lámina portaobjeto y
cúbrala con la lámina cubreobjeto ó laminilla.
 Enfoque al microscopio con el objetivo de 10x regulando la luz con el
diafragma y el condensador; y luego con el de 40x aumentando la entrada de
luz al lente.
 Identifique y tome nota de las estructuras observadas.
* Coloración de Gram
 Con el asa redonda previamente esterilizada tome una gota de agua y
colóquela en una lámina portaobjeto debidamente identificada.
 Tome una muestra de la bacteria suministrada en la caja con Agar Tripticasa
Soya y emulsiónela en el agua hasta observar turbidez.
 Deje secar la preparación al aire. Posteriormente fíjela con el calor del
mechero.
 Ponga la lámina sobre la gradilla de coloraciones para realizar la coloración de
Gram de la siguiente manera: Adicione violeta de genciana. Permita que el
colorante actúe durante un minuto.
 Lave la lámina con agua corriente.
 Cubra la lámina con Lugol, déjelo actuar por un minuto.
 Lave la lámina con agua corriente.
 Adicione Alcohol Acetona y déjelo actuar durante 30 segundos.
 Lave con agua corriente.
 Cubra la lámina con Fucsina y déjela actuar por 30 segundos. Lavar con agua
corriente
 Escurrir la lámina al aire y secarla por debajo con una toalla absorbente,
 Obsérvela al microscopio en objetivo de inmersión (100x).
 Identifique lo observado.
* Siembra en medios de cultivo
 Con la ayuda de un escobillón tome una muestra de placa dental o mucosas y
deposite el inóculo en la caja con agar sangre. Asi mismo, con un escobillón
tome una muestra de la superficie indicada por el docente y siémbrela en agar
sangre (agotamiento)
 Utilizando el asa bacteriológica de argolla realice una siembra por agotamiento.
 A partir de la cepa proporcionada en la caja que contiene Agar Tripticasa soya,
tome una porción de una colonia y siémbrela en el caldo Triptona soya.
 Con el asa recta tome una colonia de la caja que contiene Escherichia coli (E.
coli) y siémbrela por picadura o punción con asa recta en el medio semisólido
SIM.
 Marque con sus datos los medios e incúbelos a 37oC durante 48 horas.
GUÍA NO 2
LECTURA E INTERPRETACIÓN DE CULTIVOS BACTERIANOS
OBJETIVOS:
1. Describir el crecimiento obtenido en los medios de Agar Sangre, SIM y Caldo
Tripticasa Soya.
2. Correlacionar la coloración de Gram con las características de las colonias
observadas.
INTRODUCCIÓN:
La observación del crecimiento bacteriano tanto en medios líquidos como sólidos
aporta información importante para la identificación de un microorganismo. En los
medios líquidos, permite recuperar de la muestra bacterias que están en escasa
proporción. Los medios sólidos permiten efectuar un aislamiento de colonias ya
que se da la formación de unidades formadoras de colonias (U.F.C.). La U.F.C es
una población macroscópicamente visible procedente de una sola célula madre.
Las características que se analizan de una colonia son:
 Tamaño: Grandes, medianas, pequeñas y puntiformes.
 Color: Se debe a la producción de pigmentos por parte de las bacterias, o por
la degradación de un sustrato que se evidencia por cambio de pH y viraje de
un indicador.
 Bordes: Entero, lobulado, festoneado, rizado, filamentoso.
 Superficie: Plana, convexa, cóncava, umbilicada.
 Consistencia: Lisa, rugosa, mucoide, pulverulenta.
 Hemólisis: Se debe a la degradación de la hemoglobina en medios con sangre,
si es incompleta, se origina el pigmento biliverdina alrededor de la colonia y se
llama -hemólisis; si se degrada completamente la hemoglobina, alrededor de
la colonia se observa un halo transparente y se denomina -hemólisis. Cuando
no se observa zona clara alrededor de la colonia se le llama -hemólisis.
MATERIALES Y REACTIVOS:
Medios de cultivo sembrados en la práctica anterior
Colorantes de Gram
Aceite de inmersión
Láminas portaobjeto
Asas bacteriológicas
Microscopio
PROCEDIMIENTO:
 Identificar en el medio sólido los diferentes tipos de colonias, teniendo en
cuenta características como: tamaño, color, borde, brillo u opacidad, hemólisis,
entre otras.
 Realizar tinción de Gram de las diferentes colonias obtenidas en Agar Sangre y
del Caldo Tripticasa Soya.
 Observar las características del microorganismo en el medio semisólido SIM
(movilidad, producción de indol, producción de H2S). Fundamento de las
pruebas.
 Relacionar las características de las colonias con la coloración de Gram.
 Analizar los resultados y realizar el informe correspondiente.
CUESTIONARIO:
1. Qué son unidades formadoras de colonias (UFC)?
2. En Microbiología, cómo se realiza la coloración Rojo Congo? Cómo se
observan los microorganismos en esta coloración?
3. Cómo se realiza el control de calidad a la coloración de Gram?
4. Cómo se realiza la coloración de Ziehl-Neelsen y como se observan los
microorganismos?
5. Mediante un dibujo explique las diferencias entre las paredes celulares
Gram positiva y Gram negativa
6. Clasifique por tinción de Gram los siguientes microorganismos:
Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Porphyromonas
endodontalis, Proteus mirabilis, Ancylostoma duodenale, Bacillus anthracis,
Entamoeba gingivalis, Aedes aegypti, Virus de Influenza.
7. Utilidad, composición y fundamento de los medios de cultivo utilizados en
esta práctica