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CURSO BÁSICO DE CITOMETRÍA DE FLUJO
GRUPO RIOPLATENSE DE CITOMETRIA DE FLUJO (GRCF)
22 al 26 de Septiembre, 2014
CITOMETRíA DE FLUJO
Aplicaciones en investigación
Dra. Carolina JANCIC
Laboratorio de Inmunidad Innata
IMEX - CONICET, Academia Nacional de Medicina
Buenos Aires
Citometría de Flujo en Investigación
• Fenotipo y detección de antígenos celulares: de superficie y citosólicos.
• Ensayos de viabilidad celular: apoptosis y necrosis.
• Monitoreo del ciclo celular.
• Proliferación celular in vitro e in vivo.
• Conjugados celulares.
• Determinación de asociaciones moleculares (FRET).
• Fagocitosis – Endocitosis.
• Flujos citoplasmáticos de Calcio.
• Producción de metabolitos del oxígeno (superóxido, peróxido y ON).
Citometría de flujo en Investigación
• Cambios de pH intracelular.
• Actividad de proteasas: degradación de proteínas.
• Expresión de proteínas de membrana en fagosomas.
• Caracterización de vías de señalización.
• Identificación de genes reporteros.
• Estudio de microvesículas.
• Evaluación de los cambios en el potencial de membrana plasmática.
• Cross-match.
• Y más…
Más en detalle:
• Flujos citoplasmáticos de Calcio.
• Proliferación celular in vitro e in vivo.
• Fagocitosis – Endocitosis.
• Maduración de fagosomas: degradación de proteínas, pH, etc.
• Estrés oxidativo: producción de IROs.
• Apoptosis y necrosis.
• Genes reporteros.
• Conjugados celulares y asociaciones moleculares (FRET).
• Potencial de membrana plasmática.
MOVILIZACION DE CALCIO
Movilización de Calcio
El análisis de los transientes de calcio por citometría de flujo:
• Provee información de células individuales.
• Permite identificar una respuesta particular en una población heterogénea.
• Analiza células vivas.
Colorantes utilizados para la detección de
calcio intracelular por citometría de flujo
Colorante
Excitación
(nm)
Emisión
(nm)
LASER
indo-1
346
390/520
UV 5-W argón
UV helio-cadmio
fura red
488
660
argón
fluo-3
488
530
argón
fluo-3/fura red
488
530/660
argón
Marcación de células con Fluo-3
Fluo-3 AM
Hay que evitar el exceso de marca ya que:
1) disminuye la sensibilidad y
2) puede resultar en
compartimentalización del colorante
Fluo-3 AM
Clivaje por esterasas
citoplasmáticas
Fluo-3
Forma sensible a la
unión con el calcio
•Fluo-3 AM: acetoximetil éster (AM) del Fluo-3
Movilización de Calcio
Adquisición de las muestras
Escala lineal:
• para intervalos regulares
• apropiada para señales que oscilan en un rango limitado (0-1.000)
Escala logarítmica:
• para intervalos crecientes
• cubre un rango más amplio de variación de la señal (0-10.000)
EJEMPLOS:
Neutrófilos estimulados con fMLP
PMN
PMN
fMLP 10-7 M
Linfocitos
fMLP 10-9 M
FL1
fMLP 10-7 M
Tiempo (segundos)
EJEMPLOS:
Linfocitos B activados por entrecruzamiento de la Ig de superficie
Anti-ratón (Fab´2)
FL1
Anti-IgM (Fab´2)
Tiempo (segundos)
PROLIFERACION CELULAR
Proliferación linfocitaria
Los linfocitos proliferan activamente en respuesta a estímulos
Linfocitos T/B
Proliferación linfocitaria
Activación policlonal y antígeno especifica de linfocitos
Estímulos más frecuentes:
1) policlonales: mitógenos (PHA, ConA, PWM)
anticuerpos anti-CD3
PMA + ionomicina
LPS
2) específicos: antígenos (toxoide tetánico, hemaglutinina, etc)
Métodos para medir proliferación celular
1. Aumento del número celular.
2. Incorporación al ADN de timidina marcada con tritio.
3. Incorporación al DNA de Br-deoxi-uridina y marcación con un
anticuerpo anti-BrdU
4. Marcación con CFSE y seguimiento por citometría de flujo
N° de células
CFSE
Proliferación
Marcación con CFSE
Fluorescencia CFSE
Marcación con CFSE: análisis de datos
autofluorescencia
generaciones
control sin estimular
N° de células
7654321
Fluorescencia CFSE
EJEMPLO
Interacción celular y proliferación en un modelo murino
Citometría de flujo
Video-microscopía
wt
Rac1/2
KO
Benvenuti, F. et al. Science (2004), 305:1150-3
EJEMPLO, doble marcación
PBMC => sorting de CD4+CD25- y CD4+CD25+, estimulación con anti-CD3/CD28 durante 7días
CD4+CD25-
CD4+CD25+
Ensayos in vivo
Estudio de la respuesta
inmune
Estudio de la
migración celular
marcación de linfocitos T
marcación de células
dendríticas u otras
EJEMPLO: respuesta antígeno específica
Respuesta inmune in vivo contra OVA
OVA (popliteo)
wt B6
BSA (popliteo)
ganglio no drenate
n1
60,7%
8,6%
12,5%
n2
56,9%
6,6%
6,9%
i.v.= 2x10e6 OT2-CFSE
footpad= 50 µl de microsesferas
16 h
CD69
CD69
ganglio popliteo :
CFSE
EJEMPLO: respuesta antígeno específica
Transferencia de células dendríticas
ganglio popliteo
n 1:
OVA
CD + OVA: 15’ pulse & 4h
> lavar & marcar con CMTMR
n 2:
OVA
i.v.= 2x10e6 OT2-CFSE
footpad= 1x10e6 OVA-CD o péptido
control
ganglio no drenante
54%
7%
58%
5%
45%
16%
16 h
n 3:
peptide
CD69
visualizacion de CD
CD69
Ganglio popliteo
CFSE
EJEMPLO: estudio de la migración celular
Migración de células dendríticas a órganos linfáticos
wt Ly5.1
i.v. o s.c.= CD inmaduras Ly5.2+
20 h
Bazo y ganglios popliteos:
visualización de CD por marcación Ly5.2
Mittelbrunn, M. et al. Blood (2009), 113:75-84
ENDOCITOSIS- FAGOCITOSIS
Captura de antígenos
ANTIGENOS
PARTICULADOS
ANTIGENOS
SOLUBLES
microesferas de latex
fluorescentes
dextrán fluorescente
EJEMPLO
Fagocitosis y endocitosis en células dendríticas
Microsesfera fluorescentes
FITC
Eventos (nº de células)
Dextrán-FITC
Intensidad de fluorescencia
– dextrán-FITC
+ dextrán-FITC 4°C
+ dextrán-FITC 37°C
% de fagocitosis
FluoProbe 647
15
10
5
0
400
200
100
Dilución de beads (1/dilution)
EJEMPLO
Fagocitosis y endocitosis en células dendríticas
Microsesfera fluorescentes
FITC
Eventos (nº de células)
Dextrán-FITC
Intensidad de fluorescencia
– dextrán-FITC
+ dextrán-FITC 4°C
+ dextrán-FITC 37°C
% de fagocitosis
FluoProbe 647
15
10
5
0
400
200
100
Dilución de beads (1/dilution)
EJEMPLO
Fagocitosis de bacterias
Bacterias fluorescentes
+
PBMC
leucocitos
n° de células
bacterias-FITC
10 min
0°C o 37°C
bacterias
Fluorescencia IP
quenching
(azul tripan o cristal violeta)
fijar
teñir DNA
FL1
lavar y lisar GR
MADURACION DE FAGOSOMAS
Maduración de fagosomas
VIA ENDOCITICA
FAGOCITOSIS
vesículas cubiertas
de clatrina
vesículas
endocíticas
endosomas
tempranos
MVB
endosomas
tardíos
lisosomas
ER
F-actin
microtubulos
calcio
Vieira et al.
Maduración de fagosomas
• degradación de proteínas
• expresión de proteínas en fagosomas
• pH fagosomal
Degradación de proteínas
Estudio de la actividad de proteasas por citometría de flujo
Metodología y análisis de datos
CD + microesferas cubiertas de OVA
+ NH4Cl
Fagosomas
lisis
4 horas a 37°C
Marcación y análisis
por citometría de flujo
Intensidad de fluorescencia
OVA degrada
OVA no degrada
control negativo – NH4Cl
OVA – NH4Cl
OVA + NH4Cl
EJEMPLO
Degradación de proteínas en células dendríticas
Eventos (nº de fagosomas)
2 horas
4 horas
Intensidad de fluorescencia
Incremento en la degradación
Basal
2.4
2.0
1.6
1.2
0.8
0.4
0.0
2
4
Tiempo (horas)
Expresión de proteínas en fagosomas
Estudio de la expresión de marcadores lisosomales/fagosomales
Metodología y análisis de datos
20’ pulse & 30’ incubación a 37ºC
Incubación de CD con
microesferas
Purificación de fagosomas
Fagosomas
Marcación y análisis
por citometría de flujo
Intensidad de fluorescencia
EJEMPLO
Expresión de Lamp2 en fagosomas de células dendríticas
Citometría de flujo
KO
Basal
Mocroscopía electrónica
wt
15 min
200nm
Eventos (n° de fagosomas)
1 hora
KO
Lamp2 por µm de
membrana fagosomal
wt
12
9
6
3
0
2 horas
Expresión de Lamp2
**
15
wt
KO
pH fagosomal
Estudio del pH fagosomal por citometría de flujo
FITC (sensible al pH)
FluoProbe 647 (insensible al pH)
Gate en células conteniendo una sóla bead:
Fagosomas
Fagocitosis &
Citometría de flujo
FluoProbe 647
R2
FITC
baja IFM
bajo pH
FITC
alta IFM
alto pH
EJEMPLO
pH fagosomal en células dendríticas y macrófagos
pH en fagosomas
pH en el tiempo
20’ pulse + 30’ incubación a 37ºC
8
DC
Raw 264.7
Eventos (nº de fagosomas)
8
DC
Mac
7
pH
pH
7.5
7
6
6.5
6
Mac
DC
5
10
FITC
bajo pH
alto pH
60
120
180
Tiempo (minutos)
pH citoplasmático
Colorantes utilizados
pKa
Excitación
(nm)
Emisión
(nm)
Fluorescein diacetate (FDA)
6.3
436/495
525
Carboxyfluorescein diacetate (COFDA)
6.4
441/488
535
Bis-carboxyethyl-carboxyfluorescein
acetoxymethyl ester (BCECF AM)
6.98
439/490
520/620
535
488
Hydroxycoumarin (4-methylumbelliferone)
(4-MU)
7.8
430/470
450/560
350
350
Diacetoxy-dicyanobezene (ADB)
8.0
425/540
350
Carboxy SNARF-1 acetoxymethyl ester
7.5
575/670
514 o 530
Colorante
pH citoplasmático
Consideraciones importantes durante el
estudio del pH intracelular:
Células Jurkat + SNARF-1, en presencia de
nigericina a diferentes pH
• Curva de calibración: células tratadas con
nigericina (ionóforo: pH externo = pH interno).
• Adquisición con amplificación lineal.
Excitación a 514nm
Ratio 670/575
• Trabajar con la relación entre IFM de emisión a
dos longitudes de onda => nos independizamos
de variaciones en la carga del colorante en
células de diferentes tamaños.
Espectro de emisión de SNARF-1
a diferentes pH
Cambios en fluorescencia en respuesta a
nigericina. Células CCRF-CEM+SNARF-1
ESTRÉS OXIDATIVO
Fagocitosis y destrucción de microorganismos
Función desempeñada principalmente por los neutrófilos
Mecanismos de destrucción de microorganismos

Mecanismos microbicidas que no involucran al oxígeno
(oxígeno-independientes)

Mecanismos microbicidas que involucran la producción de
intermediarios reactivos del oxígeno (oxígeno-dependientes)
Mecanismos O2 dependiente
NADPH oxidasa
bacteria
membrana plasmática
neutrófilo
4e-
NOX2
4e-
4O2
4O2-
H+
K+
citosol
2O2
pH 
Cl-
2H2O2
MPO
HOCl + HO-
Adaptado a partir de Roos et al. Science
pH
4H+
catalase
H2O + O2
fusión de
gránulo y
fagosoma
Colorantes utilizados para evaluar IRO
Colorante
Excitación
(nm)
Emisión
(nm)
H2O2:
Dichlorofluorescin diacetate
488
525
Dehydrorhodamine
488
525
O2-:
hydroethidine
488
590
EJEMPLO: estrés oxidativo en neutrófilos
Producción de IRO en neutrófilos
Metodología
Análisis de datos
Incubación de PMN con
DHR (5 min a 37ºC)
paciente
+ PMA
Análisis
por citometría de flujo
n° de células
Lavado y estímulo con PMA
Intensidad de fluorescencia
Control
dador sano + PMA
paciente + PMA
APOPTOSIS
Alteraciones morfológicas en células
apoptóticas
CARACTERISTICAS DE LA APOPTOSIS:
• No hay pérdida de integridad de membrana ni se altera la permeabilidad.
• Hay cambios en la distribución de fosfolípidos: Flip-Flop y Zeiosis.
Flip-Flop
Zeiosis
• Disminución en el tamaño celular.
• Condensación de la cromatina.
EJEMPLO: neutrófilos apoptóticos
Microscopía de fluorescencia:
Tinción: naranja de acridina – bromuro de etidio
células viables
células apoptóticas
Vía de las caspasas
Receptor de muerte, ej: Fas/CD95 y TNFR
(vía extrínseca)
pro-caspasa 8
caspasa 8 activa
pro-caspasa 9
Proteínas antiapoptóticas
Bcl-2, Bcl-XI, Mcl-1, Bfl-1/A,
Bcl-W, Bcl-G
Poteínas proapoptóticas
Bax, Bak, Bad, Bid, Bik,
Bok, Bim, Bcl-XS, Bcl-B, etc
caspasa 9 activa
caspasa 3, 6, 7
citocromo c
• Reorganización del citoesqueleto
• Exposición de fosfatidilserina en la membrana plasmática
• Ruptura del DNA
Herramientas para el estudio de la
apoptosis por citometría de flujo
•
Cambios en el FSC-SSC
•
Cambios mitocondriales: TMR (tetrametilrodamina). Apoptosis muy temprana
•
•
•
•
•
Niveles de moléculas pro-apoptóticas o anti-apoptóticas => con anticuerpos
monoclonales
Nivel de caspasas activas => anticuerpos monoclonales
Detección de fosfatidilserina en la membrana plasmática. Apoptosis temprana
=> Annexina V conjugada.
Fragmentación del ADN. Apoptosis tardía => Ioduro de Propidio (PI) /
Incorporación de análogos de nucleótidos a los extremos 3’ OH terminal
catalizado por TdT exógena, biotinilados o detectados con anticuerpos
monoclonales (Técnica de TUNEL)
Estudiar receptores de muerte en la superficie celular => Fas (CD95),TNFR1 y
otros. Apoptosis por activación.
EJEMPLO: apoptosis temprana y tardía
Inducción de apoptosis:
Células B en medio de cultivo 1% de SBF
Células Jurkat + anti-FAS
EJEMPLO: expresión de Bcl-2 en LLC
Bcl-2: marcación intracitoplasmática
Bcl-2 alto
Control negativo
Bcl-2 bajo
LLC viables
n° de células
LLC apoptóticas
fluorescencia
GENES REPORTEROS
Transfección de células y genes reporteros
CARACTERISTICAS DE LOS VECTORES DE EXPRESION
 Vectores de origen eucariota aptos para la replicación en células de mamíferos.
 Codifican un gen reportero en general GFP.
 Permiten generar proteínas de fusión dada la estructura de los plásmidos.
 Selección de transfectantes estables (resistencia a neomicina).
 Permiten estudios de expresión, localización y dinámica celular.
 Nueva generación adaptados para obtener máxima expresión en células de
mamífero.
Transfección de células y genes reporteros
DESCRIPCION DE LOS VECTORES DE EXPRESION
EJEMPLOS: pmaxFP-Green, pmaxFP-Red, pmaxFP-Yellow
• Señal de poliadenilación de SV40
• Origen de replicación de SV40
• Gen de resistencia a kanamicina/neomicina
• Promotor de CMV
• Gen GFP
células transfectadas
con GFP
Transfección de células y genes reporteros
Procedimiento experimental para la transfección de células
cultivo celular
TRANSFECCION
células + ADN/siARN
selección y cultivo
EJEMPLO: transfección de PBMC
1. Transfección de células con un vector codificando GFP.
2. 24 horas post-transfección se analizaron las células por citometría de flujo.
A: gate de linfocitos
B: a partir de (A) gate en anti-CD3
C: exclusión de células muertas en CD3+
control
GFP
D y E: expresión de GFP en células T vivas
EJEMPLO: animales transgénicos
Proteínas de fusión en modelos murinos
MHC II-GFP
LB
Rab27a-EGFP
CD
INTERACCIONES CELULARES
Determinación de asociaciones moleculares
FRET: “fluorescence resonance energy transfer”
Fundamento:
El espectro de emisión y absorción de los colorantes usados están superpuestos.
La energía emitida tras la excitación de la proteína fluorescente dadora puede directamente
excitar a la proteína fluorescente receptora sólo cuando ambas están lo suficientemente
cerca. Por lo tanto uno de los fluoróforos será excitado como consecuencia de la excitación
previa del otro.
FRET permite distinguir células fusionadas de las agregadas. Sólo las células fusionadas
muestran FRET.
FRET: Espectros de excitación y emisión
Dador y aceptor:
Transferencia de la energía de
superposición de espectros
resonancia
FRET intramolecular
APLICACIONES: algunos ejemplos
1- Cambios conformacionales
2- Hidrólisis de proteínas
3- Interacciones ligando-receptor
4- Fusión de vesículas o células
dador
aceptor
EJEMPLO: fusión celular
Análisis de la fusión celular mediada por las proteínas de la envoltura del HIV
Análisis de la fusión celular
Fluorescencia roja
Células multinucleadas o sincicios
Fluorescencia verde
Sincicios (flechas) producidos in vitro por la
fusión entre células linfoides humanas CD4+ y
células que expresan las proteínas de fusión del
VIH (células Env+).
Rojo: células CD4+ no fusionadas
Verde: células Env+ no fusionadas
Azul: sincicios
Huerta et al. J Virol. Methods (2003), 138:17-23
EJEMPLO: fusión celular
Análisis de la fusión celular mediada por las proteínas de la envoltura del HIV
Cocultivos de células CD4+ marcadas con DiI y células Env+ marcadas con DiO
DiI-CD4+ y DiO-Env+
30ug/ml anti-CD4
mutación en gp41
fusión
IFM rojo
14%
1,6%
0,4%
agregados
SSC-H
IFM verde
FSC-H
Huerta et al. J Virol. Methods (2003), 138:17-23
Determinación de asociaciones moleculares
Conjugados celulares
Fundamento:
Los espectros de emisión de los colorantes utilizados para marcar los diferentes tipos
celulares deben estar separados.
Es una metodología rápida y confiable para evaluar interacciones celulares.
Permite analizar gran número de células en corto tiempo a diferencia de la microscopía.
CD
y
LT
APC
LT
EJEMPLO: agregados celulares
Formación de conjugados entre NK efetoras y células blanco
Tiempo: 0 min
Tiempo: 10 min a 37ºC
Fluorescencia roja: células YTS (línea celular NK) marcadas con PKH26
Fluorescencia verde: células blanco marcadas con PKH67
Burshtyn et al. Current Biology (2000), 10:777-780
EJEMPLO: agregados celulares
Formación de conjugados entre NK efetoras y células blanco
NK
target
IP (FL2)
Ioduro de propidio (VIABILIDAD)
MitoTracker (EFECTORAS: NK)
Ioduro de propidio (FL2)
Marcación y citometría de flujo:
MitoTracker green FM (FL1)
MitoTracker (FL1)
MitoTracker: marca mitocondrias en células vivas
EJEMPLO, “RFADCC: Rapid Fluorescent ADCC”
Detección de anticuerpos anti-HIV
CB
PKH26
gp140
PBMC
PBMC
plasma HIV+
PBMC
PBMC
lisis
Gate en PKH26+
Análisis de CFSE
PBMC: células efectoras
CB: células blanco
Gomez-Roman, et al. J Immunol Methods (2006), 308:53-67
EJEMPLO: Expresión de CD107a en NK
Activación y degranulación de células NK
Metodología y análisis de datos
NK+ K562 (1:1) + anti-CD107a
Ejemplo 1
1 h a 37°C
monensina y/o brefeldina
5 h a 37ºc
Marcación:
anti-CD56
anti-CD3
citoquinas
NK: células efectoras
K562: células blanco
Ejemplo 2
control
gp140
Chung, AW. et al. J Immunol (2009), 182:1202-10
POTENCIAL DE MEMBRANA
Potencial de membrana
oxonol (-)
cyanina (+)
- - +
- - - +
+
+ +
+
-
Hiperpolarización
(Valinomicina)
+
+
estado normal
-
+
cyanina (+)
+
+
-
oxonol (-)
Despolarización
(Gramicidina)
Colorantes utilizados para estudiar el
potencial de membrana
+
-
EJEMPLO: cambios en potencial de membrana
Despolarización e hiperpolarización en células
CCRF-CEM
DEPOLARIZACION
HIPERPOLARIZACION
Despolarización de PMN (cyanina)
luego del tratamiento con PMA
GRACIAS