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La preparación de muestras en el
análisis de alimentos
• Dr. Pedro Gutiérrez
• Sales & Application Specialist. Analytical
I Taller Análisis de Alimentos
sigma-aldrich.com
Córdoba, 20 de junio 2012
Agenda
• ¿Por qué preparar la muestra?
• Métodos comúnmente usados.
• Métodos más usados en análisis alimentos
» SPME
» SPE
» d-SPE. QuEChERS
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¿por qué preparar la muestra?
•Compatibilidad de la matriz con sistema cromatográfico
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¿por qué preparar la muestra?
Limpieza de la muestra. Mejoramos selectividad
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¿por qué preparar la muestra?
Concentración. Mejorar la cuantificación
15 mL
muestra
2 mL
eluido
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¿por qué preparar la muestra?
•
Extender la vida del sistema cromatográfico
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¿por qué preparar la muestra?
Compatibilizar la matriz de la muestra con sistema
cromatográfico.
Limpiar la muestra. Mejorar la identificación de los analitos.
Aportar selectividad
Concentrar. Mejorar la cuantificación. Influye en la
exactitud, reproducibilidad y límites de cuantificación.
Extender la vida de las columnas cromatográficas.
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Importancia de la preparación de la muestra.
Tiempo empleado en los procesos analíticos
Análisis
6%
Recolección
6%
Manejo de datos
27%
Preparación de
muestras
61%
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Quelle: LC/GC Magazin
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Importancia de la preparación de la muestra.
Fuentes de error en análisis
Contaminación
4%
Introducción de muestra
6%
Interación
6%
Cromatografía
Preparación de
muestra
30%
7%
Instrumento
8%
Calibración
9%
Columna
11%
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El operador
19%
Source: LC/GC Magazin
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Métodos de preparación de muestra
Poco limpio
•Poco selectivos
o Dilución
o Filtración
o Precipitación
o Dialisis/Ultrafiltración
o Extraccion líquido - Líquido.
o SPME.
o Extracción Sólido - Líquido. (SPE)
o Limpieza dispersiva QuEChERS. (dSPE)
o Inmunoafinidad
Limpios
o Sistemas alta selectividad SupelMIP
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Selectivos
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Técnicas no contadas en detalle.
Filtración
• Filter & Funnel
• Syringe Filter
• Whatman Mini-Uniprep
• Filtration plates (96- & 356-Well)
Nunc
filter plates
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Z558079-1EA
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Técnicas no contadas en detalle.
Extracción Liquido-Líquido
• Works for many samples (solids & liquids, LLE)
• Issues
• Large solvent consumption (Buy & Dispose $)
• Vigorous shaking/mixing
• Waiting for layers to separate (LLE)
– Phase emulsions ?
• Longer Rotovap Times
• Separatory funnel is spacey equipment
– (sample throughput, Automatisation?)
• Automation??
Liquid Liquid Extraction
LLE
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Técnicas no contadas en detalle.
Extracción con líquido automática
• Liquid Handler can automate µLLE
• (not too common, yet)
• Accelerated Solvent Extraction, ASE
• Common now for solid samples
• Replaces Soxhlet
Dionex ASE 350 &150
• Super Critical Fluid Extraction (SFC)
• Solvent mostly CO2 (with modifiers)
ASE Principle
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Técnicas no contadas en detalle.
Purga & Trampa
• VOC (volatile organic compounds)
• Water analysis
• We sell
– Purge traps (our Carbons!)
– Purge &Trap Sample vials
– For a range of instruments
– Tekmar, OI Analytical, CDS, Dynatech
Traps
Sample Vials
Tekmar
Velocity
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Micro Extracción en fase sólida
•SPME
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SPME en el análisis de alimentos
Especialmente recomendado, pero no excluyente:
o Para trabajar en Cromatografía de Gases
o Ideal para volátiles o semivolátiles
o Preferible en espacio de cabeza, pero
también funciona en inmersión.
extracción
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inyección
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Detalle de una fibra de SPME
Color-Coded Screw
Hub
Tensioning Spring
Sealing Septum
Ferrule
Septum-Piercing Needle
Fiber-Attachment Needle
Coated SPME
Fused Silica Fiber
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94-0034
7131344
18
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Procedimiento de extracción en SPME
Pierce
Sample Septum
Expose
Fiber/Extract
Retract Fiber &
Remove
to GC Instrument
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98-0369
7131345
19
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Procedimiento de desorción en SPME
Pierce GC
Inlet Septum
Expose
Fiber/Desorb
to Column
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98-0370
Retract Fiber &
Remove
7131345
20
20 de 49
Mecanismo de Adsorción en SPME
Silica Rod
Liquid Polymer
Analyte
Adsorbed
Aqueous
Solution
Vial
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98-0371
Time
21
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Cantidad absorbida en la fibra en EQUILIBRIO.
• para pequeños volúmenes de muestra (2-5ml):
ns =
KVfC0Vs
KVf+Vs
• en volúmenes infinitos de muestra (Vs >> Vf):
K
ns
Vf
Vs
C0
ns =
Constante de distribución fibra/muestra
Moles de analito en la fase estacionaria
Volumen de fase estacionaria
Volumen de muestra
Concentración del analito en la muestra
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KVfC0
f (K) = T, pH, fuerza iónica
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Factores que afectan la cantidad
de analito recuperada
• Influencia sobre el Equilibrio
•
•
•
•
Fase en la fibra
pH
Fuerza iónica
Temperatura
• Influencia sobre la cinética
• Agitación
• (Temperatura)
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Otros factores que influyen en SPME
•Fase y espesor de la fibra
•Técnica usada (Inmersión/Espacio cabeza)
•Modificaciones de la muestra
•Diámetro del liner del inyector
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Extracción en fase sólida
•SPE
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Conceptos en SPE
• Es una forma de cromatografía
• Generalmente formato de jeringa
• en plástico o vidrio
Serological Grade
Polypropylene
or
Glass Tube
• El absorbente es confinado entre dos fritas
(Polietileno, PTFE, Acero)
• Los materiales usados como relleno son muy
similares a los usados en HPLC
Polyethylene, SS or
Teflon® Frits
(20µm pores)
SPE Packing
• Generalmente partícula irregular, pero también
esférica
• Partículas mas grandes que en HPLC (>50µm)
• La distribución del tamaño de partícula mucho
mas amplia que en HPLC.
Luer Tip
• Son de un solo uso
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Equipo para procesar los tubos de SPE (24- and 12- Port)
„Disposable Liner“ (DL)
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No Risk for Cross contamination
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Algunos robots para automatizar SPE
Zymark RapidTrace System
Gerstel SPE
TomTec Quadra System
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de Junio 2012
SPE
215 System
Code 802 & 803 “Tab-less” 1 & 3mL racks
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Los tubos/cartuchos de SPE
SPE tubes are available in two materials:
• Polypropylene (serological grade)
• Most common
• Suitable for most SPE applications
• Inexpensive
• Glass (serological grade)
•
•
•
•
•
Greater solvent resistance than plastic
No phthalates or plasticizers to leach into sample
Can be heated
More expensive than plastic
Common in environmental analysis
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An assortment of Supelco SPE tubes.
Second tubes in from either side are glass.
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Membranas y placas 96 pocillos
Empore™ SPE
ENVI-DiskTM
SPE packing embedded
in glass fiber matrix
96-well plates
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Etapas del proceso en SPE (retención & Elución)
1. Pre-tratamiento de muestra
2. Acondicionado & Equilibrio
3. Carga muestra
4. Lavado
5. Elución
6. Evaporación/concentración
1) Pre-tratamiento de muestra:
Dependiendo de la naturaleza de la muestra (analitos, matriz y proceso de
retención química); puede requerir ajuste pH, centrifugación, filtración, dilución,
tamponado, etc..
2a) Acondicionado:
Se pada disolvente a través del tubo de SPE para mojar los grupos funcionales
ligados al relleno => aseguramos así unas interacciones consistentes.
2b) Equilibrio:
El relleno/fase es tratado con una disolución similar a la matriz de la muestra (en
polaridad, pH, etc.) => Maximizamos la retención de la muestra.
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Etapas del proceso en SPE (retención & Elución)
3) Carga muestra:
Introducción de la muestra = los analitos de interés son retenidos en el relleno.
4) Lavado:
Selectivamente se retiran las interferencias no deseadas, que son co-extraídas con
el analito sin salida prematura del analito de interés.
5) Elución:
Se eluye el analito de interés con un disolvente que anule las interacciones entre el
absorbente y el analíto.
6) Evaporación/concentración:
Evaporación del eluido con el analito. Opcionalmente se reconstituye en la fase
móvil a usar posteriormente.
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Tres estrategias de trabajo en SPE
La elección de una de ellas depende del resultado que se espere de la extraccion.
1. Estrategia de retención y elución
•
•
•
•
La mas común
Retención: Los analitos son retenidos, la matriz no querida es lavada.
Elución: El eluyente provoca cambios que permiten sacar los analitos del tubo.
Los analitos son concentrados vía evaporación del disolvente.
2. Estrategia de retención de Interferencias
•
•
Retiene todo los compuestos no deseados de la matriz y permite al analito pasar por
el tubo durante la etapa de introducción de muestra.
Como si fuera una filtración química
3. Extrategia de fraccionado (Forma de retención y elución)
•
Retención de analitos y elución secuencial de las diferentes clases de analitos
modificando pH o % disolvente orgánico del eluyente
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Diagrama. Estrategia de retención y elución
(Filtered) sample with internal standard (IS) → Analytes of interest in suitable matrix
1) Apply
sample to
SPE tube
2) Apply
wash solvent
3) Apply
elution solvent
4) Evaporate
elution solvent,
reconstitute in e.g.
mobile Phase
Original sample
(analytes & IS
in a matrix)
HPLC or
GC analysis
A dilute
solution of
analytes & IS
in the
elution solvent
Must first condition
& equilibrate SPE
tube
Matrix
fraction
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2012
= waste
Analyte
fraction
Purified &
concentrated
analytes & IS
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Diagrama. Estrategia de retención de Interferencias
Sample with Internal Standard in Matrix → Matrix adsorbed → Analytes & IS pass
2) Apply
elution solvent
3) Evaporate
elution solvent,
reconstitute
Must first condition
& equilibrate SPE
tube
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Diagrama. Estrategia de fraccionado
Form of Bind and Elute Strategy with multiple elution steps
1) Apply
sample to
SPE tube
2) Apply
Wash
solvent
3) Apply
elution
solvent 1
3) Apply
elution
solvent 2
4) Evaporate
elution solvent,
reconstitute
Original Sample
(analyte & IS
In matrix)
Fraction 1
HPLC or
GC analysis
A dilute
solution of
analyte and IS
in elution solvent
Must first condition
& equilibrate SPE
tube
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Fraction 2
HPLC or
GC analysis
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Extracción en fase sólida dispersiva
•d-SPE
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SPE dispersiva: Método QuEChERS
Quick
Easy
Cheap
Effective
Rugged
Safe
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M. Anastassiades, S. Lehotay et al.,
J. AOAC Int. 86 (2) 412-431, 2003
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¿Como funciona el método QuEChERS?
Homogenización
Muestras
congeladas y
se adiciona
CO2 sólido
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¿Como funciona el método QuEChERS?
Extracción
Pesar 10 g de muestra
homogenia en un tubo
de centrifuga de 50 mL
con tapa
Añada 10 mL de
Acetonitrilo & 100 µL
patron interno
Agitar vigorosamente
durante 1 min.
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¿Como funciona el método QuEChERS?
Extracción
Agite vigorosamente 1min
Añade el sulfato magnesico y las sales tampon
Tampon EUR:
Trisodium citrat dihydrate; disodium
hydrogencitrate sesquihydrate, sodium chloride
Tampon AOAC:
Acetato sódico
Importante: Añadir la muestra primero al vial y
después las sales para prevenir la
aglomeración de las sales
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¿Como funciona el método QuEChERS?
Extracción
5 min centrifugación
Si es necesario: tome 1 ml de extracto
crudo para los pesticidas ácidos
Fase acetonitrilo
(para ser usada para los análisis)
Precipitado orgánico
Agua de la muestra
Sales
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¿Como funciona el método QuEChERS?
Transferir la fase acetonitrilo a un tubo de centrifuga con
sulfato magnesico y PSA (Primary Secondary Amine).
Si es necesario:
Añadir GCB (Graphitic Carbon Black) para extractos muy
pigmentados y/o C18 en muestras con alto contenido en
lipidos.
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Agitar
Purificación
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¿Como funciona el método QuEChERS?
5 min centrifugación
Usar el
sobrenadante claro
para cromatografía
Acidificar con acido
formico al 5 % hasta
pH 5
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¿Como funciona el método QuEChERS?. Resumen
Pesar 10 g de muestra
Añade 10 mL de Acetonitrilo
Añade patrón interno
Agitar
Añadir 4 g MgSO4 y 1 g NaCl,
Adjuste pH 5 - 5,5 con tampon citrato
Agitar & centrifugar
Opción: Plaguicidas
ácidos por LC-MSMS
Añadir MgSO4 y PSA/(GCB) a la alicuota
Agitar & centrifugar
Acidificar extracto a pH ~ 5
Opción: plaguicidas
ácidos debiles por
LC-MSMS
GC-MSD y LC-MSMS
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Fundamento del método QuEChERS: absorbente PSA
• PSA - Primary Secondary Amine
• two pKa [10.1 and 10.9]
•
• Better interaction due to two pKa values
• Removal of
•
•
•
•
fatty acids
organic acids
polar pigments
sugars
Also available in tubes
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Método QuEChERS: consideraciones
Homogenizar con hielo seco
Extracción: pH ajustado a 5 – 5,5
Tomar alícuota de los plaguicidas ácidos antes de añadir PSA
Usar GCB para muestras coloreadas (clorofilas y carotenoides)
Usar C18 para muestras conteniendo lípidos
Tomar alícuota para los plaguicidas ácidos débiles antes de
acidificar
• Acidificar el extracto purificado a pH = 5
• Muestras con bajo contenido en agua (< 80 %) ejem. grano,
miel, te, hierbas, especias y fruta seca, se pueden analizar por
este método adicionando agua.
•
•
•
•
•
•
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El único inconveniente …
Publicidad
• Sales y absorbentes prepesados ahorran tiempo y
dinero
• Reactivos de gran pureza de
SiAl
• Conveniente y fiable
La preparación lleva unos 30 min.
La pesada de las sales y de los
absorventes es la parte mas
tediosa
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Muchas gracias por la atención
• Más información en nuestro servicio técnico: [email protected]
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Muchas gracias por la atención
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