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Química Biológica 2110. Microbiología y Técnico de Laboratorio. Año 2008.
Trabajo Práctico N° 8: Electroforesis desnaturalizante en geles de poliacrilamida
(SDS-PAGE) de proteínas periplásmicas de P. fluorescens C.
Objetivos:
 Resolver, por medio de electroforesis en gel de poliacrilamida, una muestra de proteínas
y determinar el peso molecular de cada una de ellas.
Introducción:
Son varios los métodos utilizados para separar las proteínas contenidas en una muestra.
En los métodos electroforéticos, las proteínas se separan por acción de un campo
eléctrico. La movilidad depende de la carga eléctrica y del tamaño molecular, es decir, a
igualdad de cargas, la movilidad será menor cuanto mayor sea el peso molecular. Además
de las proteínas, el principio electroforético puede aplicarse a una gran variedad de
sustancias cargadas como: los ácidos nucleicos, polisacáridos, aminoácidos, entre otros,
como ya se ha visto.
En la electroforesis, las proteínas se movilizan a través de una matriz sólida o soporte,
que funciona como tamiz molecular. Existe una gran variedad de soportes, en el caso de las
proteínas, el más utilizado es poliacrilamida. Este soporte es un polímero fabricado con
acrilamida y un agente de entrecruzamiento bis-acrilamida. La polimerización es catalizada
por radicales libres generados a partir del persulfato de amonio (APS) en presencia de
tetrametilenendiamina (TEMED) (Figura 1). De esta manera se forma una red por donde se
desplazarán las proteínas sometidas al campo eléctrico. La separación de las mismas
dependerá de la porosidad gel, a medida que aumenta la concentración de acrilamida el
tamaño de poro disminuye y las proteínas de mayor tamaño son más retenida que aquellas
de menor peso molecular.
Figura 1: Estructura química de la acrilamida
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La electroforesis en geles de poliacrilamida denominada SDS-PAGE, es una
electroforesis desnaturalizante. Al gel y a las muestras se les agrega el detergente aniónico
dodecilsulfato de sodio (SDS). En estas condicciones, el detergente se une a las proteínas
rompiendo todos los enlaces no covalentes en ellas, causando así, su desnaturalización. El
SDS se une en una relación de 1.4 gr. por cada gramo de proteínas y de esta manera, todas
las proteínas se cargan negativamente y migran en el campo eléctrico únicamente por
diferencia en su peso molecular. Estas electroforesis se emplean fundamentalmente para
estimar su peso molecular.
Contrariamente, pueden realizarse electroforesis en condiciones no desnaturalizantes,
conocidas como electroforesis nativas. En estas condiciones, las proteínas no se unen con el
detergente SDS, por lo tanto se separan de acuerdo a su tamaño, forma y carga eléctrica.
Por sus características, suelen utilizarse para determinar proteínas con actividad enzimática
directamente en el gel.
Al finalizar la corrida electroforética el gel debe teñirse para visualizar las bandas
proteicas. Con este propósito pueden utilizarse una gran variedad de colorantes; siendo el
más utilizado el azul de Coomasie R, que dará como resultado la formación de bandas
proteicas azules.
Para la determinación del peso molecular (PM) de las proteínas se utilizan marcadores
de peso molecular. Esto es una mezcla de proteínas de peso molecular conocido que se
resuelven en el mismo gel que las muestras a analizar. De este modo, debido a la relación
lineal que existe entre el peso molecular de la proteína y la movilidad electroforética (Rf),
se puede construir una curva de calibrado (Figura 2), a partir de la cual se puede averiguar
el PM de una proteína desconocida, sabiendo su Rf.
Log PM
Rf
Fig 2: Curva de calibrado generada a partir de la separación electroforética de marcadores de peso
molecular conocidos.
En el T.P. realizaremos una variante del SDS-PAGE, conocida como electroforesis de
zona o discontinua, en la cual el gel está formado por 2 secciones de diferente tamaño de
poro y con pH distintos. Las proteínas se desplazarán a través del gel de poros más grandes
(gel de apilamiento) hacia el gel de menor tamaño de poro (gel de resolución). De esta
forma las proteínas se ubicarán en bandas estrechas y bien definidas, y así, se consigue una
mayor resolución de las mismas.
En el presente TP realizaremos la separación de una digestión de albúmina con Tripsina
y se determinará el PM de cada una de las bandas obtenidas.
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Técnica
A.- Preparación del gel:
1.- Armar el equipo de electroforesis y el gel de poliacrilamida.
2.- Preparar el gel de resolución (Lower) o gel de poro fino. Mezclar las siguientes
soluciones para un volumen final de 7 ml:
Solución
Tris-ClH pH 8,8 (1,5 M )
Acrilamida (30%)
SDS (10%)
TEMED
APS 16%
H2O
Volumen final
Volumen
1,77 ml
2,33 ml
70 l
5 l
70 l
2,76 ml
Concentración final
0,38 M
10 %
0,1 %
0,07 %
0,16 %
7 ml
Homogeneizar la solución y colocar en el equipo de electroforesis. Dejar a la luz para
permitir la polimerización.
3.- Preparar el gel de apilamiento (upper) o gel de poro grueso. Mezclar las siguientes
soluciones para un volumen final de 4 ml:
Solución
Tris-ClH pH 6,8 (0,5 M )
Acrilamida (30%)
SDS (10%)
TEMED
APS 16%
H2O
Volumen final
Volumen
1 ml
466 l
40 l
5 l
40 l
2,45 ml
Concentración final
0,125 M
3,5 %
0,1 %
0,07 %
0,16 %
4 ml
Homogeneizar la solución y colocar sobre el gel de resolución. Formar las calles de
siembra colocando el peine, y dejar polimerizar a la luz.
4.- Una vez polimerizado el gel colocarlo en la cuba electroforética y llenarla con buffer de
corrida. El cual contiene: Tris base 3 gr.lt-1, glicina 14.4 gr.lt-1 y SDS 1 gr.lt-1 a pH 8,3.
B.- Preparación de las muestras.
Las muestras que se colocarán en el gel son: albúmina (A) y una digestión tríptica de
álbúmina (A/T) y marcador de peso molecular (M).
1.- Agregar a las muestras, 10 L buffer siembra 4x (0,062 M Tris-ClH pH 6,8; 10%
Glicerol, 10%SDS, 0.0125% azul bromofenol).
2.- Luego de mezclar las muestras con el buffer siembra, colocar en baño de agua a 100°C
por 5 min para permitir la unión del SDS a las proteínas.
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6.- Colocar 40 l de cada muestras en las calles del gel y luego comenzar con la
electroforesis.
7.- Conectar la cuba electroforética a la fuente de poder. Aplicar un voltaje constante de
120 V hasta que el frente de corrida alcance el gel fino.
8.- Cuando el frente a llegado al gel fino cambiar el voltaje a 150 V (voltaje constante).
9.- Dejar corriendo hasta que el frente alcance el final del gel. Luego revelar las bandas
proteicas.
Revelado de las bandas proteicas.
1.- Sacar el gel del equipo, colocarlo en un recipiente y lavar con H2O destilada.
2.- Agregar solución de Coomasie Brillant Blue R-250 de modo que cubra todo el gel.
Colocar el baño de agua a 90°C por 5 min o bien dejar a temperatura ambiente 1 h.
3.- Transcurrido este tiempo retirar el colorante y agregar solución decolorante (H2O:
metanol:AcH en relación 5:4:1), permitir que se cubra bien todo el gel, y colocar en baño
de agua a 90°C hasta decolorar y permitir la visualización de las bandas proteicas.
4.- Analizar el resultado de la electroforesis: visualizar la separación de las proteínas y
comparar con el marcador de peso molecular. Construir la curva de calibrado
correspondiente y calcular el PM de cada una de las bandas de las muestras.
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