Download 810 EFECTOS DE INHIBIDORES DE TRIPSINA DE SEMILLAS DE

EFECTOS DE INHIBIDORES DE TRIPSINA DE SEMILLAS DE Opuntia. Streptacantha
SOBRE PROTEASAS DE VARIOS INSECTOS PLAGA.
Trypsin inhibitors effect from seeds of Opuntia streptacantha on several insect pest proteases.
J. A. Torres-Castillo1, C. Mondragón-Jacobo2 y A. Blanco-Labra1. 1 Centro de Investigación y de
Estudios Avanzados del I.P.N. Unidad Irapuato. Km. 9.6 Libramiento Norte Carr. Irapuato-León
A. P. 629. Irapuato, Gto., México 36821. 2 CE-Bajio INIFAP. Km. 6.5 Carr. Celaya S. M.
Allende, Gto. México. Correspondencia electrónica: [email protected],
[email protected].
Palabras Clave: Proteasas digestivas, Insectos plaga, Inhibidores enzimáticos, Inhibidores de
proteasas.
Introducción
Los inhibidores de proteasas son proteínas o péptidos con la capacidad de unirse al sitio
catalítico de la proteasa para atenuar o abatir la actividad hidrolítica de manera muy puntual y
dirigida. Se ha sugerido que los inhibidores de proteasas funcionan como proteínas de reserva en
semillas y que estos se van degradando conforme crece el embrión. También se ha observado
que estas proteínas pueden tener otras funciones como la regulación endógena o defensa contra
depredadores o patógenos (Muzquiz et al., 2004)
El papel de los inhibidores de proteasas como elementos de defensa ha sido reforzado por
una cantidad importante de trabajos realizados en torno a este tema, ahora se sabe que estos son
inducidos por diferentes factores: en respuesta a daño mecánico, en respuesta a elicitores
provenientes de insectos, a algunos compuestos implicados en la respuesta de defensa en plantas,
como son el ácido jasmónico y el metil jasmonato, o compuestos relacionados al estrés abiótico
como es el caso del ácido absícico (Koiwa et. al 1997; Tamayo et al., 2000, Moura et al, 2001;
Cassareto et al., 2004).
Se ha demostrado que este tipo de proteínas tienen la capacidad de inhibir la actividad
enzimática de muchas proteasas digestivas de insectos plaga, por lo que se les ha utilizado en
diferentes trabajos para demostrar su efecto adverso sobre el desarrollo de insectos. Se les ha
considerado como agentes para el control de plagas. Por lo cual, la búsqueda de este tipo de
proteínas podrá permitir ampliar las opciones para inhibir enzimas de insectos determinados. En
este trabajo se ha analizado el efecto de inhibidores de tripsina provenientes de O. streptacantha,
contra enzimas de algunos insectos plaga (Torres, 2009)
Materiales y Método
Se trabajó utilizando una fracción enriquecida de inhibidores de tripsina provenientes de
semillas de Opuntia streptacantha. Las semillas fueron provistas de la colección del Campo
experimental del Norte de Guanajuato, en San Luis de La Paz, Guanajuato perteneciente al
Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias. La purificación y los
ensayos enzimáticos fueron realizados en el laboratorio de Mecanismos de Defensa de Plantas del
Departamento de Bitecnología y Bioquímica del Cinvestav-Unidad Irapuato. Los insectos fueron
obtenidos del insectario del Cinvestav-Unidad Irapuato. Las larvas de Lanifera cyclades fueron
810
colectadas en plantas infestadas dentro del Campo Experimental del Norte de Guanajuato de
INIFAP.
Resultados
La actividad inhibitoria presente en semillas de O. streptacantha fue detectada contra
serin proteasas de tipo tripsina, no obstante cabe aclarar que en ocasiones un solo inhibidor puede
reconocer proteasas de otro tipo funcional o puede no tener efecto significativo, debido a
modificaciones en el sitio de reconocimiento dentro de la estructura de la proteasa. En este
experimento se evaluó la actividad contra extractos con actividad proteolítica provenientes de
intestinos de diferentes insectos: Prostephanus truncatus (horadador mayor del maíz),
Periplaneta americana (cucaracha americana), Gryllus sp (grillo de jardín), Galleria mellonella
(palomilla de la cera), Manduca sexta (oruga del tabaco), Callosobrunchus maculatus (gorgojo),
Triboluim castaneum (gorgojo rojo de la harina), Acanthocelides obtectus (gorgojo) y
Gnathocerus maxillosus (gorgojo). Partiendo de referencias bibliográficas sabemos que los
primeros cinco insectos cuentan con serin proteasas intestinales, y los últimos cuatro cuentan
principalmente con cisteín proteasas intestinales. En el experimento se monitoreó la hidrólisis de
un sustrato sintético (BapNa) para serin y cisteín proteasas. Se desarrollaron reacciones
enzimáticas en presencia y ausencia del inhibidor. La diferencia en las absorbancias de cada
reacción entre las dos reacciones permitió calcular los porcentajes de inhibición. La enzima
estándar incluída en el experimento fue la Tripsina de páncreas bovino, la cual se usó como
referencia para la actividad inhibitoria. El porcentaje de inhibición más alto se alcanzó con la
tripsina bovina con un 80% y con los extractos intestinales del horadador mayor del maíz, la
cucaracha americana y el grillo de jardín. No se obtuvo inhibición con el resto de los insectos.
Los datos de los ensayos se esquematizan en la figura 1.
Estos datos nos permiten ver que la actividad inhibitoria tiene una especificidad marcada
hacia serin proteasas determinadas, a pesar de que G. mellonella y M. sexta cuentan con serin
proteasas, su actividad no fue afectada por la actividad inhibitoria de O. streptacantha. Por su
parte, también se confirma que la actividad inhibitoria no afecta enzimas de otro tipo
mecanístico, por ejemplo, las císteín proteasas presentes en los extractos de C. maculatus, T.
castaneum, A. obtectus y G. maxillosus.
Efecto de la actividad inhibitoria sobre el extracto de proteasas intestinales del
insecto Lanifera cyclades, un insecto plaga del nopal. El gusano blanco (Lanifera cyclades), es
una plaga incidente sobre algunas especies de nopal, el principal daño lo ocasionan las larvas, que
barrenan el interior de los cladodios, esto ocasiona el debilitamiento de las plantas. Es de
importancia estudiar los mecanismos endógenos de la planta para tratar de encontrar una
resistencia que perdure y sea compatible con el ambiente; entre dichos mecanismos figuran los
inhibidores de proteasas, por lo tanto se decidió probar algunos inhibidores de proteasas
provenientes de semillas de nopal contra los extractos proteolíticos del gusano blanco.
Para tratar de detectar la actividad proteolítica del gusano blanco se probaron tres
sustratos sintéticos, el BapNa (sustrato para serin y cisteín proteasas), el BTEE (sustrato para
quimotripsina) y el BAEE (sustrato para tripsina). Ninguno de los anteriores nos sirvió para
detectar actividad proteolítica, por lo cual se decidió trabajar con un sustrato más general, el cual
fue la gelatina. Se midió la hidrólisis de gelatina a través de sus productos de degradación. En
esta técnica, la gelatina (sustrato) se somete a hidrólisis por un periodo de incubación en
presencia de proteasas, al termino de la incubación se añade ácido tricloroacético a la mezcla,
811
% de inhibición
esto ocasiona que todas las proteínas no hidrolizadas precipiten, lo único que queda en solución
son los productos de hidrólisis de la gelatina, que generalmente son péptidos pequeños que se
detectan a 280 nm y a través de su absorbancia se calcula cuanta hidrólisis de gelatina se alcanzó
en ese periodo de incubación y a diferentes valores de pH.
Porcentaje de inhibición de inhibidores de
O. streptacantha sobre diferentes proteasas
de insectos.
Fig. 1. Efecto de la actividad inhibitoria de serin proteasas presente en una fracción de intercambio iónico sobre los
extractos con actividad proteolítica de diferentes insectos plaga.
Se detectó actividad proteolítica para el gusano blanco a pH 6 y pH 7; sin embargo al
momento que se realizó el ensayo de inhibición utilizando los inhibidores de las semillas de O.
streptacantha y de O. ficus-indica no se detectó efecto sobre las actividad proteolítica de los
intestinos del gusano blanco. Este ensayo nos da idea de que las proteasas son insensibles a los
inhibidores y que probablemente el insecto ya ha desarrollado una estrategia para evitar este tipo
de compuestos, por lo tanto es capaz de invadir a ciertas especies de nopal.
Literatura citada
Casaretto, J. A., Zúñiga, G. E. and Corcuera, L. J. 2004. Abscisic acid and jasmonic acid affect proteinase
inhibitor activity in barley leaves. Journal of Plant Physiology No. 161, 389-396.
Koiwa H, Bressan, R.A. and P.M. Hasegawa. 1997. Regulation of protease inhibitors and plant defense.
Trends in Plant Science. Vol. 2, Pp. 379-384.
Moura D.S. and C. A. Ryan. 2001. Wound-Inducible Proteinase Inhibitors in Pepper. Differential
Regulation upon Wounding, Systemin, and Methyl Jasmonate. Plant Physiol. Vol. 126, Pp. 289298
Muzquiz M., Welham T., Altares P., Goyoaga C., Cuadrado C., Romero C., Gillamon E. and Domoney C.
2004. The effect of germination on seed trypsin inhibitors in Vicia faba and Cicer arientinum. J
Sci Food Agric. Vol. 84, Pp. 556-560.
Tamayo M.A., M. Rufat, J. M. Bravo and B. San Segundo. 2001. Accumulation of a maize proteinase
inhibitor in response to wounding and insect feeding, and characterization of its activity toward
digestive proteinases of Spodoptera littoralis larvae. Planta. Vol. 211, No. 1. Pp. 62-71
Torres Castillo J. A., Varela Martínez K., Blanco-Labra A. y Mondragón Jacobo C. 2009. Protease
Inhibitors Present in Opuntia spp. Acta Horticulturae. Vol 811. Pp. 293-298.
812