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GCLATIH - Grupo Científico Latino-Americano de Trabajo Sobre Identificación Humana RESÚMENES/RESUMOS POWERPLEX FUSION 6C: ESTUDIOS DE VALIDACIÓN. APLICACIÓN EN LA RESOLUCIÓN DE CASOS FORENSES PABLO MARTÍN MARTÍN INSTITUTO NACIONAL DE TOXICOLOGÍA Y CIENCIAS FORENSES DE MADRID Se comenzará con una pequeña introducción del Kit PowerPlex Fusion 6C. En cuanto a los estudios de validación, en la charla se presentará un resumen de los resultados de validación del kit Fusion 6C, se repasarán los parámetros de validación estudiados en este centro, haciendo especial hincapié en los experimentos realizados para establecer el umbral analítico, así como los estudios de sensibilidad para establecer el umbral estocástico, se comentarán los experimentos de mezclas con el objetivo de comprobar la sensibilidad del componente minoritario. Como transición a la segunda parte de la charla se comentarán los métodos de análisis empleados en nuestro laboratorio: extracción, cuantificación, detección y análisis de datos. Por último, en cuanto a la aplicación del kit en la casuística, se expondrá el comportamiento del kit en la amplificación de muestras que presentan inhibición, en muestras degradadas y en muestras con baja cantidad de ADN. Se mostrarán algunos ejemplos de casuística forense con distintos fluidos (saliva, semen, restos óseos) o soportes (ropas, tomas corporales, etc) en los que se valorarán aspectos de interés forense como mezclas complejas, mezclas con contribuciones minoritarias, muestras antiguas y deterioro de restos biológicos. Por último, se recomendará el de uso un segundo kit complementario en caso de que aparezcan productos inespecíficos, artefactos u otro tipo de resultados no esperados. 1 GCLATIH - Grupo Científico Latino-Americano de Trabajo Sobre Identificación Humana TIPAGEM DE DNA A PARTIR DE IMPRESSÕES DIGITAIS PARA EMPREGO EM PERÍCIA CRIMINAL NO ÂMBITO DA JUSTIÇA MILITAR BRASILEIRA OLIVEIRA, THAÍS PATRÍCIO1; SILVA, DAYSE APARECIDA2; CARVALHO, ELIZEU FAGUNDES2 1INSTITUTO 2LABORATÓRIO DE BIOLOGIA DO EXÉRCITO (IBEX), MINISTÉRIO DA DEFESA, BRASIL. DE DIAGNÓSTICOS POR DNA, IBRAG, UNIVERSIDADE DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO, RIO DE JANEIRO, BRASIL. No âmbito da genética forense, o programa denominado de “Estudos Estratégicos em Defesa Nacional, em Educação e Ensino Militar” tem como metas principais a padronização e validação de metodologias para a análise forense de DNA a partir de vestígios biológicos recolhidos de impressões digitais. Os estudos vêm sendo realizados, há dois anos, a partir da parceria estabelecida entre o Instituto de Biologia do Exército e o Laboratório de Diagnósticos por DNA da Universidade do Estado do Rio de Janeiro. Além de contribuir para o aprimoramento técnico e científico da Subdivisão de Genética e Repositório de Amostras do Exército Brasileiro, a iniciativa tem possibilitado a formação de novos profissionais para atuação em genética forense, bem como a melhoria da capacitação de recursos humanos especializados, no âmbito das aplicações forenses do DNA, área estratégica do Ministério da Defesa. Impressões papilares latentes têm sido comumente usadas por especialistas forenses do Exército Brasileiro como uma ferramenta eficaz para a identificação humana em investigações criminais. Nos casos em que as impressões digitais são consideradas inadequadas para a identificação individual através de datiloscopia, a tipagem de regiões polimórficas do DNA de vestígios biológicos recolhidos das impressões digitais se constitui como uma metodologia alternativa para a continuidade da análise de evidência recolhida em local de crime. Nesse contexto, estudos relacionados com diferentes metodologias de coleta e extração de DNA de vestígios biológicos presentes em impressões digitais observadas em suportes de vidro e de metal encontram-se em andamento. Para isto, através de suabes, foram coletados vestígios de impressões digitais deixadas por voluntários militares em 2 GCLATIH - Grupo Científico Latino-Americano de Trabajo Sobre Identificación Humana superfícies de vidro ou metal, com a utilização de duas soluções: NaCl a 0,9% ou SDS a 2%. O DNA foi isolado por duas distintas metodologias: Solução de Lise (SDS a 0,05% e 20 mg/ml de proteinase K) + fenol-clorofórmio ou Kit QIAmp® Investigator® DNA (Qiagen). A amplificação por PCR de regiões STR do DNA foi realizada com o multiplex AmpFLSTR® MiniFiler ™ PCR Kit (Life Technologies). Os produtos de amplificação foram submetidos à eletroforese no equipamento ABI PRISM® 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) e os dados analisados com o Software ID GeneMapper® v1.2 (Applied Biosystems). As duas soluções de coleta de vestígios biológicos bem como as preparações de DNA obtidas pelas duas metodologias de extração de DNA se correlacionaram com eficientes tipagens de loci STR dos vestígios biológicos recolhidos de impressões digitais obtidas em suportes de vidro ou de metal, possibilitando a obtenção de perfis genéticos inquestionáveis. Palavras-chave: DNA, Forense, Impressões Digitais, Exército Brasileiro DIVERSIDADE DE TIPOS DE MARCADORES: UMA CHAVE PARA SOLUCIONAR CASOS COM AMOSTRAS DE DNA DEGRADADO POLVERARI, FERNANDA SILVA1,2; AMBROSIO, ISABELA BRUNELLI1,2; BRAGANHOLI, DANILO FAUSTINO1; MARTINEZ, JULIANA1; CICARELLI, REGINA MARIA BARRETTO1 1LABORATÓRIO DE INVESTIGAÇÃO DE PATERNIDADE – NAC, FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS, 2INSTITUTO DE QUÍMICA, UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA, ARARAQUARA, SP, BRASIL. Na rotina de análises forense e de parentesco pode existir uma diversidade de tipos de casos sendo necessária a combinação de diferentes métodos de análise para obtenção de um resultado conclusivo, especialmente com amostras de DNA degradado. Aqui nós apresentamos dois casos de análise de parentesco com DNA degradado, onde além de STRs autossômicos foi também necessária a análise de marcadores sexuais e sequenciamento do mtDNA. O primeiro caso foi uma investigação de paternidade com amostra de sangue proveniente da suposta mãe e uma amostra de osso exumada de um recém nascido do sexo masculino que 3 GCLATIH - Grupo Científico Latino-Americano de Trabajo Sobre Identificación Humana morreu logo após o nascimento. Talvez devido à fragilidade do osso e das condições do enterramento, a análise de marcadores autossômicos não gerou um resultado conclusivo, sendo necessária a análise do mtDNA que indicou uma exclusão de maternidade. O segundo caso é uma investigação de paternidade com amostras de sangue de dois irmãos (um homem e uma mulher), da mãe biológica e amostra de osso do suposto pai. A análise de STRs e INDELs autossômicos indicaram a inclusão de paternidade para a filha mulher, mas houve exclusão de paternidade para o filho homem. Esta exclusão de paternidade foi confirmada pela análise de Y-STRs. Ambos os casos, usando STRs e INDELs autossômicos, Y-STRs e/ou mt DNA mostram a importância da combinação de marcadores para obtenção de resultados robustos, especialmente quando o DNA esta degradado. Palavras-chave: A-STRs; INDELs; mtDNA; Y-STRs; Teste de paternidade; Ossos. Financiamento: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES); Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). IDENTIFICACIÓN DE UNA VÍCTIMA DE UN CASO DE LESA HUMANIDAD DURANTE EL CONFLICTO ARMADO ENTRE LOS AÑOS 1980 AL 2000 LORENA G. BANDA DE LA CRUZ, SUSAN I. POLO SANTILLÁN LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y GENÉTICA DEL INSTITUTO DE MEDICINA LEGAL – MINISTERIO PÚBLICO DEL PERÚ Introducción El presente caso trata de restos de osamentas humanas exhumados en abril del año 2013 de un lugar de entierro en el distrito de Morcolla a 3452 msnm en la provincia de Sucre departamento de Ayacucho en la región centro sur del Perú. Es en esta región donde se registra la mayor cantidad de víctimas y desaparecidas durante el conflicto interno desatado entre la agrupación política PCP-Sendero Luminoso y las fuerzas del orden del país durante los años 1980 al 2000. Las características del suelo de la zona 4 GCLATIH - Grupo Científico Latino-Americano de Trabajo Sobre Identificación Humana de exhumación tienen una formación litológica del tipo sedimentario formado por arenas, gravas y arcillas y de tipo volcánico. Las osamentas recuperadas estaban esqueletizadas, posterior al estudio antropológico respectivo para su individualización se recolecto fragmentos de fémur. Con fines de identificación de los restos hallados se obtuvo muestras de dos grupos familiares directos de dos individuos desaparecidos durante los años 1983 y 1984 que consistieron en muestras de sangre con los cuales se realizó el cotejo correspondiente. Materiales y Método Los fragmentos de restos oseos una vez tratados y pulverizados pasaron por dos procesos de descalcificación, la primera a base de un tampón de EDTA 0.5 M y SDS 10% el cual se incubo durante 24 h a 56 ° C, luego se añade un tampón Tris / HCl 10 mM, EDTA 50 mM, SDS 0.1%, DTT 39 mM y proteinasa K 20 mg/ml. Se aisló el ADN por extracción con el método QIAamp® DNA Investigator Purification Kit (Qiagen). El ADN aislado se concentró y se purificó adicionalmente por ultrafiltración en columnas de Amicon Ultra 15 (Merck, Millipore). Las muestras de sangre de los familiares de los individuos desaparecidos se recogieron en tarjetas FTA (Whatman FTA) y el ADN se purificó por el sistema de Purificacion de FTA (Whatman® FTA® purification reagent). El ADN purificado fue amplificado utilizando el sistema Power Plex 16® System (15 Marcadores Microsatélites STR Autosómicos más 01 marcador para la determinación de sexo) (Promega Corporation) con las condiciones del fabricante. Para la detección de Productos Amplificados se utilizó el Sistema de Electroforesis Capilar y detección por Fluorescencia mediante el Analizador Genético Automatizado ABI HID 3500 (Applied Biosystems). La probabilidad de paternidad se calculó usando el programa estadístico Familias 2.0 utilizando la Base de Datos de Frecuencias Poblacionales Hispanoamericana. Resultado y Discusión En las muestras registradas con código B y C (fragmento de restos óseos) se obtuvieron perfiles genéticos completos. Así mismo se obtuvo perfiles genéticos completos en las muestras de sangre de ambos grupos familiares, como se detalla en la Tabla N°1. 5 GCLATIH - Grupo Científico Latino-Americano de Trabajo Sobre Identificación Humana Tabla N°1 Perfiles Genéticos usando el sistema Power Plex16, B y C restos óseos, H1: Hijo del primer grupo familiar, H2: Hijo del primer grupo familiar y H3: Hijo del segundo grupo familiar. MARCADOR B C H1 H2 H3 D3S1358 15 / 17 15 / 16 14 / 15 17 / 17 16 TH01 7 / 9.3 7 / 9.3 7 7 7 / 9.3 D21S11 31.2 / 31.2 31.2 / 32.2 28 / 31.2 28 / 31.2 31 / 31.2 D18S51 12 / 15 14 / 17 15 / 16 12 / 16 14 PENTA E 12 / 18 13 / 18 18 / 21 12 / 24 16 / 17 D5S818 7 / 11 11 11 7 / 12 7 / 12 D13S317 9 9 9 / 12 9 / 12 10 / 12 D7S820 8 / 10 10 / 11 8 / 11 10 / 11 11 / 12 D16S539 9 / 12 9 / 13 11 / 12 9 / 11 9 CSF1PO 12 12 12 12 12 PENTA D 10 / 11 9 / 12 10 / 13 11 10 / 11 VWA 16 / 17 17 / 18 17 / 18 16 / 18 15 / 16 D8S1179 12 / 14 10 / 14 12 / 14 12 13 TPOX 8 11 8 8 8 / 12 FGA 18 / 24 20 / 25 18 / 22 18 / 22 20 / 25 Amelogenina X/Y X/Y X X/Y X Después de realizar el cotejo de los genotipos de los restos óseos con los genotipos de los dos grupos familiares se obtuvo lo siguiente; el análisis entre el genotipo del resto óseo B con respecto al del hijo 1 determino un índice de Identificación combinado de 21804.5929132977 y una probabilidad de paternidad de 99.995414 %, el análisis entre los genotipos del resto óseo B con respecto al hijo 2 determino un índice de Identificación combinado de 142881.337089639 y una probabilidad de paternidad de 99.999300 %. En el cotejo de los genotipos del hijo 3 y del resto óseo B no se encontró coincidencia en siete marcadores (D3S1358, D18S51, PENTA E, D13S317, D7S820, D8S1179 y FGA). En el cotejo de los genotipos del hijo 3 y el resto óseo C no se encontró coincidencia en siete marcadores (PENTA E, D5S818, D13S317, PENTA D, VWA, D8S1179 y TPOX). Conclusión Numerosos estudios señalan que la densidad del hueso es un factor importante que influye en la preservación del ADN en este tipo de muestras y normalmente se 6 GCLATIH - Grupo Científico Latino-Americano de Trabajo Sobre Identificación Humana encontraría menos degradado en las piezas óseas más densas del esqueleto como el fémur y la tibia. El éxito en la obtención de información genética a partir de restos óseos está condicionado así mismo por el tipo de estructura ósea y el grado de conservación que va a estar condicionado a la forma o tipo de enterramiento, características del ambiente y suelos en el que se encuentra depositado el resto óseo, temperatura, humedad, PH, agentes biológicos, físicos, presencia de ciertos compuestos en el suelo y otros factores ambientales. Para nuestro caso los restos óseos tienen más de 30 años de antigüedad por lo que se requirió que el proceso sea más minucioso. Como resultado se obtuvo ADN que pudo ser amplificado por PCR. Para la muestra de referencia se obtuvo de familiares más apropiados es decir de primer grado para obtener una alta probabilidad de identificacion (DNA Commission of the International Society for Forensic Genetics: Recommendations regarding the role of forensic genetics for disaster victim identification), para el caso hijos de dos grupos familiares, de los cuales se obtuvo una probabilidad de identificación de 99.995414% para el hijo1 y una probabilidad de paternidad de 99.999300% para el hijo2 de un grupo familiar. PROYECTO DE VALIDACIÓN DE EXTRACCIÓN DIFERENCIAL AUTOMATIZADA EN EL EQUIPO BIOMEK® 3000 DE BECKMAN COULTER™ PARA PROCESAR MUESTRAS FORENSES OSCAR ANTONIO BARRERA VILLALOBOS PROCURADURÍA GENERAL DE JUSTICIA DEL DISTRITO FEDERAL, MÉXICO La extracción diferencial de muestras forenses en casos de violación, es una de las múltiples actividades que se realizan en los laboratorios de análisis genéticos de manera cotidiana. Así mismo, ésta es una de las principales peticiones que cotidianamente son solicitadas en el laboratorio de Genética Forense de la PGJCDMX, por lo cual es necesario dedicar tiempo y recursos materiales y humanos para obtener resultados satisfactorios para la autoridad ministerial y la sociedad en general. 7 GCLATIH - Grupo Científico Latino-Americano de Trabajo Sobre Identificación Humana Debido a lo anterior y ante la necesidad de minimizar tiempos, carga de trabajo, errores humanos y así mismo, con la implementación de sistemas de calidad; en nuestro laboratorio hemos comenzado con un proyecto de validación de extracción diferencial automatizada de muestras forenses producto de violación utilizando el equipo automatizado Biomek 3000® de Beckman CoulterTM, que cuenta con las plataformas instaladas para utilizar el kit de extracción Diferencial Differex, así como la purificación de ADN de muestras forenses por medio del kit DNA-IQ de la casa comercial Promega. Material y Métodos 1. EXTRACCION DIFERENCIAL AUTOMATIZADA DE CELULAS ESPERMATICAS MUESTRAS EMPLEADAS Se utilizaron hisopos con muestras control de un individuo del sexo masculino (células espermáticas) y un individuo de sexo femenino (células epiteliales vaginales). Una alícuota por duplicado de las muestras fue extraída y purificada por medio del kit SV isolation system, así como cuantificada por medio del kit Quantifiler Duo y amplificada para obtener los perfiles genéticos de referencia por medio de los kits Powerplex Fusion (PPF) y Powerplex Y23 (PPY23). PREPARACION DE MUESTRAS El estudio de extracción diferencial se realizó utilizando una cantidad constante de células epiteliales por muestra y utilizando diluciones de la cantidad de células espermáticas presentes en las mismas (1:1, 1:10, 1:100, 1:500 y 1:1000). A partir de las alícuotas anteriores se obtuvieron series de repeticiones de: 5 controles de células espermáticas puras, 5 controles de células epiteliales puras y 5 repeticiones de mezclas de células epiteliales con cada una de las diluciones elaboradas. Se tomaron alícuotas para realizar frotes y evaluar la cantidad de células espermáticas y de células epiteliales en las muestras por observación al microscopio. PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS EN EL EQUIPO AUTOMATIZADO BIOMEK 3000 (LISIS Y SEPARACIÓN DIFERENCIAL POR DIFFEREX SYSTEM PROTOCOL Y PURIFICACIÓN POR MEDIO DE DNA-IQ SYSTEM PROTOCOL) La extracción diferencial se realizó por medio del protocolo Differex como lo indica el proveedor, posteriormente, se realizó la purificación de ADN de las fracciones 8 GCLATIH - Grupo Científico Latino-Americano de Trabajo Sobre Identificación Humana espermáticas y epiteliales de las muestras por medio del protocolo DNA IQ for Differex en el equipo Biomek 3000. 2. CUANTIFICACION Y NORMALIZACIÓN AUTOMATIZADA DE LAS MUESTRAS Tras la extracción diferencial y purificación de las muestras, se realizó la cuantificación de las fracciones espermáticas (M) y epiteliales (F) por medio del kit de Promega Plexor HY, preparada por medio del protocolo automatizado para PCR en tiempo real Plexor HY en el equipo Biomek 3000 y cuantificada en el equipo Stratagene Mx3005P qPCR System de la marca Agilent. La normalización de las muestras para el proceso de amplificación se obtuvo a través de los datos obtenidos por medio del software Plexor Analysis Software de Promega. 3. AMPLIFICACION AUTOMATIZADA DE MUESTRAS DE EXTRACCION DIFERENCIAL Para la amplificación automatizada las muestras, se realizó tomando solamente tres réplicas al azar de los controles de células espermáticas, controles de células vaginales, mezclas de células epiteliales con diluciones de células espermáticas y blancos de reactivos. La amplificación se ajustó a 0.5ng/µL de ADN autosómico y/o masculino y realizó por medio de los kits de amplificación de STRs Powerplex Fusion (PPF) y Powerplex Y23 (PPY23) de Promega, preparados por medio del protocolo automatizado para amplificación NormSTR en el equipo Biomek 3000 y amplificados en el equipo GeneAmp PCR System 9700 de la marca Applied Biosystems. cío). 4. ELECTROFORESIS DE LAS MUESTRAS DE EXTRACCION DIFERENCIAL Para determinar los alelos de los diferentes marcadores de los sistemas Powerplex Fusion (PPF) y Powerplex Y23 (PPY23), se realizó un corrimiento electroforético y escaneo génico, utilizando el equipo Genétic Analyzer ABI PRISM 3130xl operado por medio del software Data Collection y procesando los datos obtenidos a través del software Gene Mapper ID v3.2. Resultados Hemos podido observar a través de éste procedimiento que la mínima cantidad de células espermáticas necesarias para obtener un perfil genético autosómico completo y diferenciado es a partir de 10 células espermáticas por campo, así mismo 9 GCLATIH - Grupo Científico Latino-Americano de Trabajo Sobre Identificación Humana a, a partir de esta concentración, hemos obtenido perfiles genéticos autosómicos y haplotipos con una altura y balance adecuado. CASO VILLATORO: “AL SILENCIO DEL MICRÓFONO, EL ADN GRITA” ZINTIA MOYA LABORATORIO SEROLOGÍA- GENÉTICA FORENSE, MINISTERIO PÚBLICO, HONDURAS El caso del secuestro seguido de asesinato del periodista Ángel Alfredo Villatoro fue un caso emblemático y de gran impacto social, hecho ocurrido entre el 9 al 15 de mayo de 2012 en Tegucigalpa, Honduras con el hallazgo del cuerpo. Haciendo especial hincapié en los análisis genéticos realizados a los indicios encontrados en el allanamiento de la casa donde se pudo comprobar por medio de la obtención del perfil genético del Sr. Villatoro que fue el lugar donde se mantuvo en cautiverio. DESCRIPCION DEL CASO A partir del allanamiento de la casa en mención geolocalizada mediante triangulación telefónica realizada por el cuerpo de investigación criminal de la policía nacional y la ropa que vestía el día del hallazgo del cuerpo. Se analizaron 22 diferentes indicios divididos en 2 dictámenes conforme al avance cronológico de la investigación. Cabe mencionar que los indicios consistentes en un vaso de vidrio y una botella plástica eran de especial importancia para la vinculación de la escena (casa) con el ofendido en cautiverio. Estos indicios de cantidad mínima de muestra (saliva) fue posible procesarlos mediante el kit de extracción y purificación DNA IQ SYSTEM. Se realizó la amplificación por medio de PCR y posteriormente electroforesis capilar en el ABI PRISM 310 ANALIZADOR GENETICO. El perfil genético obtenido coincidió con el perfil genético del Sr. Villatoro RESULTADOS 10 GCLATIH - Grupo Científico Latino-Americano de Trabajo Sobre Identificación Humana De los 14 indicios procesados provenientes de la casa, se obtuvo el perfil genético del señor Ángel Alfredo Villatoro en una botella plástica y en un vaso de vidrio que permitió al equipo de investigación confirmar el lugar de cautiverio procediendo con la captura de 3 personas. Las cuales orientaron para la detención de 3 personas más que conformaban la banda de secuestradores “Los Osorio” desarticulando dicha banda con la sentencia penal por este caso de sus líderes los hermanos Osorio. ANÁLISIS DE MARCADORES UNI Y BI-PARENTALES EN MEZCLAS: RESULTADOS DEL EJERCICIO DE INTER-COMPARACIÓN DEL GHEP ULISES TOSCANINI PRICAI-FUNDACIÓN FAVALORO. BUENOS AIRES, ARGENTINA Desde 1992, el Grupo de Habla Española y Portuguesa de la Sociedad Internacional de Genética Forense (GHEP-ISFG) organiza anualmente un Ejercicio de Intercomparación denominado “Estudio de polimorfismos de ADN en manchas de sangre y otras muestras biológicas”, destinado a laboratorios que realizan pruebas de paternidad y de investigación forense con el objetivo de avanzar en la estandarización de los métodos y proporcionar un punto de encuentro para discutir las estrategias de análisis y diferentes metodologías empleadas por los participantes. El Ejercicio es coordinado por el Servicio de Garantía de Calidad del Departamento de Madrid del Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias Forenses (Ministerio de Justicia, España). Cada ejercicio anual comprende un Nivel Básico (acreditado bajo ISO/IEC 17043:2010) y un Nivel Avanzado. En ambos niveles se incluye un Módulo de Parentesco y un Módulo Forense. En este trabajo presentamos las características generales del Ejercicio de Intercomparación del GHEP-ISFG y los resultados obtenidos del análisis de marcadores STRs de cromosomas autosómicos y sexuales, y de ADN mitocondrial en dos muestras incluidas en los módulos forenses del Ejercicio de Intercomparación 2014: (a) una muestra constituida por una mezcla 2:1 (v/v) saliva:sangre (M4), y (b) una mezcla 4:1 (v/v) saliva:semen (M8). Las discrepancias no debidas a errores de nomenclatura o transcripción representaron un 6,5% (M4) y un 11 GCLATIH - Grupo Científico Latino-Americano de Trabajo Sobre Identificación Humana 4,7% (M8) en STRs autosómicos, 15,4% (M4) y 7,8% (M8) para X-STRs, y 1,2% (M4) y 0,0% (M8) para Y-STRs. La principal causa de error fue la presencia de “drop-out alleles” y “drop-in alleles”, observándose diferentes criterios entre los laboratorios con relación a la inclusión de picos minoritarios y bandas “stutters”. Los kits comerciales de uso común en marcadores autosómicos mostraron diferencias en la asignación de microvariantes en el locus D12S391. Además, el análisis de electroferogramas remitidos por los participantes permitió revelar que la proporción de los contribuyentes detectada en las mezclas fue variable entre los laboratorios. Con respecto a los resultados de ADN mitocondrial, además de las discrepancias importantes para reportar heteroplasmías no hubo acuerdo en los resultados para la muestra M4: mientras algunos laboratorios informaron solo un haplotipo para la región control, otros reportaron perfiles inesperados, probablemente debido a problemas de contaminación. Para la muestra M8, la mayoría de los laboratorios solo detectaron el haplotipo correspondiente a la saliva. Aunque el GHEP-ISFG posee ya una vasta experiencia en el Ejercicio de Intercomparación, el presente estudio permitió revelar desafíos aún existentes en relación al análisis e interpretación de mezclas de fluidos biológicos. En general, estos resultados ponen énfasis en la necesidad de esfuerzos futuros guiados a acciones de capacitación con el fin de mejorar el análisis de mezclas entre los genetistas forenses. ANÁLISIS DE MTDNA MEDIANTE EL USO DE COMPONENTES DE SISTEMAS DE IDENTIFICACIÓN GENÉTICA DE TIPO STRS COMERCIALES YADIRA LIZETHE LÓPEZ RAMÍREZ1, MARIANA RUIZ HERNÁNDEZ1, MARÍA EUGENIA AMBRIZ FRANCO ROMERO1, RAÚL FLORES LEÓN1, MAGNER ARMANDO RINCÓN SOTO, MAURO LÓPEZ ARMENTA1 1 LABORATORIO DE GENÉTICA, INSTITUTO DE CIENCIAS FORENSES DEL TRIBUNAL SUPERIOR DE JUSTICIA DE LA CIUDAD DE MÉXICO La recuperación de muestras mínimas críticas en un escenario del delito representa para los investigadores forenses uno de los mayores desafíos debido a las dificultades inminentes que trae consigo este tipo de muestras. El hallazgo de pelos únicos sin raíz 12 GCLATIH - Grupo Científico Latino-Americano de Trabajo Sobre Identificación Humana es uno los ejemplos más frecuentes de muestras mínimas críticas, en tales circunstancias el uso de marcadores de ADN mitocondrial o mtDNA puede significar la diferencia entre un resultado exitoso y el fracaso si lo que se pretende es el análisis de marcadores nucleares. Sin embargo, el análisis de mtDNA es una de las tareas más laboriosas y de mayores cuidados en el ámbito de la genética forense. Aunque novedosos métodos de extracción se han implementado para este fin, son los costos en equipo e insumos una limitante en laboratorios emergentes que buscan emplearse en la identificación humana. Nuestra investigación se centra en el análisis de mtDNA procedente de muestras de pelo sin raíz mediante el uso de mezclas maestras de sistemas de identificación genética de tipo STRs comerciales, encontrando que el uso de sus químicas no sólo es una alternativa viable sino que es rápida y efectiva, dejando abierto el espectro de sistemas de identificación no convencionales necesarios en la resolución de caso complejos. A fin de evaluar su factibilidad fueron empleados en la extracción y purificación de ADN los sistemas Tissue and Hair Extraction y DNA IQ™ respectivamente, mientras que en amplificación componentes de los sistemas de identificación genética PowerPlex 16, Y23 y Fusion con uso de primers, marcaje y método de análisis estándar para mtDNA . Los resultados observados dejan claro el potencial que dicho procedimiento de análisis tiene en el manejo de muestras difíciles. Palabras clave: Extracción, purificación, mtDNA, pelo, STRs. VALIDACIÓN DE SOFTWARE PARA CÁLCULOS ESTADÍSTICOS UTILIZADOS EN LA IDENTIFICACIÓN HUMANA BASADA EN ADN MARCO DAVID GARCÍA KING, MISHEL MARIE STEPHENSON OJEA FUNDACIÓN DE ANTROPOLOGÍA FORENSE DE GUATEMALA - FAFG La Fundación de Antropología Forense de Guatemala estableció un laboratorio de genética forense con el objetivo de poder utilizar el análisis de ADN en la identificación de personas desaparecidas. Esto mediante la comparación del ADN de los restos recuperados con el de los familiares que los están buscando. La 13 GCLATIH - Grupo Científico Latino-Americano de Trabajo Sobre Identificación Humana comparación de ADN se ve fortalecida al incorporar un resultado estadístico que indique la certeza y el poder de la evidencia genética para concretar la identificación. Estos resultados pueden tornarse complicados, principalmente cuando se tiene más de una víctima, o los parentescos son complicados. Asimismo, la comparación de grandes volúmenes de muestras dificulta la obtención de coincidencias de ADN de forma manual, por lo que la utilización de un software diseñado para realizar estas comparaciones y cálculos facilita la identificación de personas por ADN. El laboratorio, para los análisis de relaciones parentales y familiares, cuenta con la acreditación ISO 17025:2005 para laboratorios de ensayo y calibración, y por lo tanto debe validar que el software sea adecuado para el uso de acuerdo a la configuración utilizada en el laboratorio. Por esta razón se validaron los cálculos de relaciones de parentesco realizados utilizando dos software comerciales: DNA-VIEW y M-FISys, así como la realización de cálculos de paternidad de forma manual. Esto se hizo mediante la comparación de las fórmulas algebraicas y resultados obtenidos en diferentes escenarios planteados, incluyendo mutaciones, alelos nulos y posibles pérdidas de alelos. De esta forma se comprobó la forma en que se obtienen los resultados para cada comparación y su validez para el fin propuesto de identificación humana por ADN. NUEVO MÉTODO Y KIT PARA LA IDENTIFICACIÓN FORENSE HUMANA: FÁCIL, RÁPIDO, SIMPLE Y NO DESTRUYE LA MUESTRA. ENSAYO EN CONDICIONES REALES CARRASCO PATRICIO1, CAROLINA INOSTROZA1, GASTON BOCAZ 2, MANUEL WONG2. 1FACULTAD 2SERVICIO DE ODONTOLOGÍA, UNIVERSIDAD DE LOS ANDES, SANTIAGO, CHILE. MÉDICO LEGAL DE CHILE, UNIDAD DE REGISTRO NACIONAL DE ADN, SANTIAGO, CHILE. Antecedentes: No hay kits que permiten la determinación de la identificación forense humano de los dientes de forma rápida, eficaz y sin destruir la muestra. En caso de accidentes aéreos, desastres naturales o terrorismo la disponibilidad de tejido susceptible de ser utilizado en el análisis forense podría limitarse a los huesos y los 14 GCLATIH - Grupo Científico Latino-Americano de Trabajo Sobre Identificación Humana dientes. Los kits clásicos utilizan huesos y dientes y destruyen la muestra, son difíciles de manejar lo que implica un alto riesgo de contaminación y un mayor tiempo en la entrega del perfil genético. El nuevo kit es único porque ofrece resultados en horas, no destruye la muestra y es más fácil de manipular con un bajo riesgo de contaminación. Objetivo: Probar la metodología y el kit en condiciones reales de uso. Métodos: En 5 cadáveres de 1 mes, 4 hombres y 1 mujer entre 47-83 años de edad, se obtuvieron 6 dientes. 11 muestras para el ensayo y el ADN genómico se extrajo con la nueva metodología forense y kit (Patente Alcance NºUS-20160123853). También se obtuvieron muestras controles de sangre en filtros FTA y muestras de mucosa oral. El ADN de los controles se obtuvo con el equipo y kit Maxwell 16 (Promega), los perfiles genéticos se obtuvieron con el kit GlobalFiler ™ STR Kits (Thermo Fisher Sci.). Al final de la metodología, los dientes fueron devueltos a los cadáveres. El éxito fue calculado en relación a los 24STRs obtenidos a partir de los controles de sangre y muestras bucales los que fueron comparados a los resultados de las dentales. El tiempo utilizado para generar el perfil genético fue calculado para la pulpa dental y el cemento radicular. Resultados: Las muestras de control dieron perfiles genéticos completos (24 STRs). Análisis de los 5 cuerpos humanos permitió la identificación de 3 de ellos con 24 STRs, los otros 2 cuerpos dieron perfiles genéticos incompletos entre los 7 y 16 STRs. Las 6 muestras dentales generaron 11 ADN genómico, dieron 7 perfiles genéticos completos y 4 perfiles genéticos parciales, 64% de éxito. El tiempo utilizado para obtener el perfil genético fue de 20 horas para la pulpa dental y 12 horas para el cemento radicular. Discusión: La puesta a prueba del kit y la metodología en condiciones reales demostró la eficacia en la obtención de perfiles genéticos útiles para la identificación forense, sin destruir la muestra dental. El tejido de la pulpa dental y el cemento radicular han demostrado ser útiles en la obtención de perfiles genéticos completos, sin embargo, la metodología aplicada al cemento radicular entrega resultados en un tiempo más corto. 15 GCLATIH - Grupo Científico Latino-Americano de Trabajo Sobre Identificación Humana DESEMPENHO E INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS NO ION PGM DOS KITS EA 24PLEX STR E MTDNA EM AMOSTRAS COMPLEXAS. CAROLINA BOTTINO1,2, ROSANE SILVA3, RODRIGO MOURA-NETO4 1 INSTITUTO DE PESQUISA E PERICIAS EM GENÉTICA FORENSE, POLICIA CIVIL DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO 2 PROGRAMA DE DOUTORADO EM BIOTECNOLOGIA, INSTITUTO NACIONAL DE METROLOGIA, QUALIDADE E TECNOLOGIA 3 INSTITUTO DE BIOFÍSICA CARLOS CHAGAS FILHO, UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO 4 INSTITUTO DE BIOLOGIA, UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO Plataforma de Sequenciamento Paralelo Massivo (SPM) permite a análise simultânea de milhares a milhões de fragmentos de DNA, gerando grandes quantidades de dados em um prazo relativamente curto em comparação com o método de Sequenciamento de Sanger. O objetivo deste estudo é analisar o desempenho e a interpretação dos dados gerados (1) para genotipagem STR com um protótipo do painel de 24 plex, e o (2) sequenciamento total do mtDNA com um protótipo de painel de 162 amplicons, ambos gentilmente cedidos pela Thermo-Fisher Scientific, usando a plataforma Ion Torrent PGM™. Amostras de Material de Referência Certificado de DNA (NIST SRM 2391c e SRM 2392) foram amplificados com um painel STR 24 plex e um painel de mtDNA e sequenciados no Ion PGM™. Usamos, também, amostras de casos reais da Polícia Civil do Estado do Rio de Janeiro, com resultados inconclusivos e previamente analisados na plataforma de ABI 3500. Considerou-se o número de alelos discriminados e a percentagem de picos “stutters”, razão de leituras (RR) e variantes de alélicas observadas. Foram observados perfis de DNA completo com 37 pg. Sequenciamento com profundidade de leitura de 10.000 permitiu a observação de variação intra-alélicas em 5 loci. Este estudo mostra que SPM aplicado a genotipagem de STR melhora a precisão e a deconvulação de misturas. Amostra de DNA quantificadas por qPCR foram analisadas quanto ao DNA mitochondrial. Quantidades de DNA nuclear na ordem de 100 pg foram suficientes 16 GCLATIH - Grupo Científico Latino-Americano de Trabajo Sobre Identificación Humana para se obter o sequenciamento completo do NIST SRM 2392. Amostras complexas também foram estudadas, mesmo com elevado index de degradação, obtendo-se perfil compativel entre as amostras de referência e questionada. Financiamento: CAPES Pro-Forense 17