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UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA.
ESCUELA POLITÉCNICA SUPERIOR.
INGENIERÍA TÉCNICA FORESTAL.
VARIACIÓN GENÉTICA EN EL CONTENIDO DE FENOLES TOTALES EN
FAMILIAS DE LA POBLACIÓN DE MEJORA DE Pinus radiata DE GALICIA.
INDUCCIÓN MEDIANTE METIL JASMONATO Y RELACIÓN CON LA
RESISTENCIA A Thaumatopoea pityocampa EN LABORATORIO.
PROYECTO FIN DE CARRERA
AUTORA:
DIRECTORES:
YOLANDA MAGDALENA CARRERA
LUÍS SAMPEDRO PÉREZ
XOAQUÍN MOREIRA TOMÉ
JULIO 2009
UNIVERSIDADE DE SANTIAGO DE COMPOSTELA
ESCUELA POLITÉCNICA SUPERIOR DE LUGO
INGENIERÍA TÉCNICA FORESTAL
VARIACIÓN GENÉTICA EN EL CONTENIDO DE FENOLES TOTALES EN
FAMILIAS DE LA POBLACIÓN DE MEJORA DE Pinus radiata DE GALICIA.
INDUCCIÓN MEDIANTE METIL JASMONATO Y RELACIÓN CON LA
RESISTENCIA A Thaumatopoea pityocampa EN LABORATORIO.
TRABAJO DE INVESTIGACIÓN
AUTORA: YOLANDA MAGDALENA CARRERA
DIRECTORES: LUIS SAMPEDRO PÉREZ
XOAQUÍN MOREIRA TOMÉ
TUTORA: Mª JOSEFA LOMBARDERO DÍAZ
Convocatoria: JULIO 2009
AGRADECIMIENTOS
Mi mayor agradecimiento va dirigido a mis padres por su confianza y su esfuerzo
durante tanto tiempo, así como a mi hermano y a mis abuelos, y sobre todo a mi tío José
por toda su ayuda desinteresada. Un agradecimiento especial a todos mis amigos por
haberme apoyado y haber aguantado mis momentos más estresantes (por que ya
sabemos que no es nada fácil). Nombrar también a Teka y a Janis, por alegrarme y
distraerme cuando más lo necesitaba.
Quiero dar las gracias a toda la gente del CINAM-Lourizán por habernos tratado tan
bien, en especial a mis directores Xoaquín Moreira y Luis Sampedro, por haberme
brindado la oportunidad de poder trabajar con ellos.
Título: Variación genética en el contenido de fenoles totales en familias de la población
de mejora de Pinus radiata de Galicia. Inducción mediante metil jasmonato y relación
con la resistencia a Thaumatopoea pityocampa en laboratorio.
Autora: Yolanda Magdalena Carrera
Directores: Luis Sampedro Pérez y Xoaquín Moreira Tomé
Convocatoria: Julio 2009
Este Proyecto Fin de Carrera se ha realizado en el centro de Investigaciones
Ambientales de Lourizán bajo la dirección de los investigadores Luis Sampedro Pérez y
Xoaquín Moreira Tomé, al amparo de los Proyectos de investigación INIA-RTA 05-173
“Eficiencia del uso del fósforo en coníferas de crecimiento rápido. Variabilidad
genética, mejora y repercusiones fitosanitarias” y RTA-100 “Efectos maternos en Pinus
pinaster: influencia del estado nutricional y sanitario de árboles madre en el vigor y
resistencia de sus progenies. Implicaciones en la evaluación temprana dentro de los
programas de mejora”.
ÍNDICE
RESUMEN
1.INTRODUCCIÓN
1.1.- Pinus radiata: importancia forestal de la especie
1.2. El herbívoro: la procesionaria del pino (Thaumatopoea pityocampa)
1.3. Mecanismos de defensa en las plantas: Compuestos fenólicos
1.4. Importancia del Metil-Jasmonato como inductor de defensas
2. JUSTIFICACIÓN, HIPÓTESIS DE TRABAJO Y OBJETIVOS
3. MATERIAL Y MÉTODOS
3.1. Material vegetal y tratamientos
3.2. Diseño experimental
3.3. Aplicación de los tratamientos experimentales y cosechado de las plantas
3.4. Captura, mantenimiento y bioensayo con procesionaria
3.5. Determinación de fenoles totales
3.6. Análisis estadístico
4. RESULTADOS
5. DISCUSIÓN
5.1. Variación genética en el contenido de fenoles
5.2. Inducción del contenido de fenoles en acículas
5.3. Bioensayo con procesionaria
6. CONCLUSIONES
7. BIBLIOGRAFÍA
8. SUMMARY
9. RESUMO
RESUMEN
Pinus radiata Don. es hoy en día una de las coníferas más empleada en las plantaciones
forestales gallegas debido a su alta rentabilidad económica. En los años 80 se instaló un
huerto semillero en el Noroeste de Galicia (Sergude, A Coruña) con el fin de obtener
semilla de alta calidad genética para emplear en repoblaciones. Estos genotipos de P.
radiata presentaban un mayor crecimiento, mayor rectitud del fuste y menor ramosidad,
todas ellas cualidades indispensables para obtener un mayor rendimiento en la
producción de madera. Pero además dentro de este programa de mejora tiene vital
importancia analizar la variación genética contra plagas y enfermedades y cuales son los
genotipos que tienen una mayor capacidad defensiva contra los herbívoros. El primer
objetivo de esta investigación fue estudiar la variación genética en el contenido de
defensas, tanto constitutivas como inducidas, medido como contenido de fenoles totales
en las acículas. Además también evaluamos si la aplicación de metil jasmonato (MJ) y
la realización de heridas mecánicas en los tallos de las plantas son métodos efectivos
para inducir fenoles totales en las acículas. Por último, empleamos bioensayos in vitro
en el laboratorio para estudiar la resistencia a la procesionaria del pino (Thaumatopoea
pityocampa Schiff). Los resultados de este proyecto indicaron que no encontramos
variación genética en el contenido de fenoles totales en las acículas. Por otro lado, ni la
aplicación de MJ ni la realización de heridas mecánicas en los tallos de las plántulas
incrementaron significativamente el contenido de fenoles totales en las acículas. Por
último, la aplicación de MJ a las plántulas no resultó efectiva contra el ataque de la
procesionaria.
Palabras clave: Pinus radiata, fenoles totales, Thaumatopoea pityocampa, variación
genética, defensas constitutivas, defensas inducidas
1. INTRODUCCIÓN
1.1. Pinus radiata: importancia forestal de la especie
El pino insigne o pino radiata (Pinus radiata D. Don) es una conífera de gran interés
forestal y económico, perteneciente al género Pinus y más concretamente a la familia
Pinaceae, la cual comprende una alta variedad de especies y subespecies. Es de talla
media a elevada, de aproximadamente 30 metros de altura. Es originario del suroeste de
los EEUU, principalmente de la costa de California (Figura 1.1).
Por su alta rentabilidad económica, se ha producido una fuerte demanda de esta
especie por lo que se ha extendido artificialmente por todo el mundo mediante
repoblación forestal, y hoy en día es una de las coníferas más utilizadas en plantaciones
productivas a nivel global. Alcanza los máximos de producción en volumen con rapidez
(alcanzando diámetros de más de 50 centímetros en 25 ó 30 años), y la calidad de su
madera es muy adecuada para diversos usos, especialmente para obtención de celulosa y
sierra, Por ello se han propiciado su utilización en muchos países, favoreciendo la
plantación a gran escala en Australia, Sudáfrica, España, Nueva Zelanda y Chile (Figura
1.2). En estos dos últimos países es donde encontramos las mayores plantaciones de esta
especie, puesto que estas exceden del 80% de la superficie total de plantación. Su
producción mundial equivale al 13% del consumo de madera de la Unión Europea.
Figura 1.1. Área de distribución natural de P. radiata
Figura 1.2. Distribución mundial de P. radiata (www.gabarro.com).
Es una especie muy sensible al frío y a las heladas, por lo que prefiere climas
suaves, litorales con abundante humedad atmosférica. En España se encuentra
principalmente en una estrecha franja del Norte de la Península Ibérica, en altitudes
inferiores a los 800 m (Dans et al., 1999). Los bosques de pino insigne son masas de
repoblación artificial, masas puras y coetáneas, que favorecen el ataque de plagas y
enfermedades (Cobos Suarez y Ruiz Urrestarazu, 1990). En general, las masas de pino
radiata, sufren daños importantes causados por múltiples agentes patógenos, tanto
insectos, como hongos, bacterias y virus, que originan fisiopatías o desordenes
funcionales y provocan grandes pérdidas de productividad.
Es muy frecuente en repoblaciones efectuadas en Galicia, Asturias, Cantabria y País
Vasco en altitudes inferiores a los 800 metros (Dans et al., 1999). En Galicia fue
introducido a finales del siglo XIX, aunque en los últimos diez años, las plantaciones de
pino insigne han experimentado, un fuerte incremento, y actualmente ocupa una
extensión de aproximadamente 82.000 ha, un 11% de la superficie forestal gallega. Las
ayudas comunitarias para la forestación de tierras agrarias (Reglamento UE 2080/92)
han impulsado fuertemente la presencia de este pino, especialmente en las provincias de
A Coruña y Lugo: A Serra da Gañidoira, entorno de As Pontes, meseta interior
coruñesa, en A Coruña, A Terra Chá, Serras do Buio y Xistral y la parte occidental de
Lugo son las comarcas gallegas con una fuerte presencia de pino insigne.
Figura 1.3. Mapa de España por provincias con el volumen de cortas de P. radiata en el
año 2006.
A consecuencia del extraordinario potencial productivo, a partir de los años 90 se ha
producido un incremento paulatino de plantaciones del pino radiata en la comunidad
autónoma gallega, hasta conseguir una fuerte expansión a gran escala de plantaciones
con esta especie, que ha ocasionado una enorme demanda de semilla. En los años 80 se
empezó un programa de mejora genética de esta especie en Galicia que incluyó la
selección de árboles superiores (“árboles plus”) seleccionados por sus óptimas
características de mayor crecimiento, baja ramosidad y rectitud del fuste. El objetivo
principal de este programa de mejora genética fue obtener semilla de alta calidad para
su uso en repoblación, que conduzca a una mejor calidad de las masas, mejor
aprovechamiento maderero y con ello un mayor potencial económico de la especie. Para
ello se instalaron huertos semilleros clonales en Sergude, en la provincia de A Coruña,
utilizando clones de estos árboles plus. Además, también se instalaron varios ensayos de
familia x fertilización con semilla de dichos huertos semilleros, con el fin de estudiar
diversos parámetros que nos ayuden a crear una estrategia de mejora y conseguir las
nuevas poblaciones mejoradas.
1.2. El herbívoro: la procesionaria del pino (Thaumatopoea pityocampa)
La procesionaria del pino o lagarta (Thaumatopoea pityocampa Schiff), cuyas
orugas se alimentan sobre todas las especies del género Pinus, es uno de los
defoliadores que mayores daños económicos causa en repoblaciones de coníferas. En
Galicia tiene especial predilección por P. radiata y Pinus pinaster Ait. (Cobos Suarez y
Ruiz Urrestarazu, 1990). La presencia y los daños causados por este lepidóptero, están
influidos por el estado fisiológico, condiciones climáticas o a la calidad genética de la
planta, entre otros factores (Hodar et al., 2002; Hodar y Zamora, 2004).
El ciclo de este insecto pasa por cuatro fases: adulto, huevo, oruga, y crisálida. Los
adultos emergen del suelo en forma de polilla en los meses de junio-julio, rápidamente
las hembras atraen a los machos mediante feromonas sexuales, y tras el apareamiento
busca un ramillo adecuado formado por dos acículas de la misma vaina para realizar la
puesta de huevos, los cuales se colocan de forma helicoidal en torno a estas, formando
un canutillo recubierto por las escamas extraídas de la parte final del abdomen de la
hembra, lo que le confiere ese color pajizo (Figura 1.4). Cada puesta está formada por
un número de huevos que generalmente oscila entre 120 y 300, aunque se dieron casos
de colonias de más de 700 ejemplares.
Figura 1.4. Puesta del lepidóptero Thaumatopoea pityocampa (www.miradanatural.es)
Transcurridos 30-40 días, sucediendo desde finales del mes de julio hasta mediados
de septiembre, dependiendo de las zonas, se produce la eclosión de los huevos, dando
lugar al nacimiento de las larvas, las cuales tienen que superar 5 fases para poder
transformarse en crisálidas.
Las larvas de primer estadio, poseen un tamaño que oscila entre 5-6 mm, por lo que,
aunque presentan pilosidad muy fina no se aprecia a simple vista. Forman pequeños
nidos provisionales mediante entrelazados de hilos de seda, viven entre 12 y 15 días
antes de mudar al segundo estadio, el cual dura entre 20-25 días y cuyas orugas medirán
10-12 mm de longitud. Pasado este tiempo, se produce la segunda muda, dando lugar al
tercer estadio, con orugas que suelen medir entre 15-25 mm, aunque el tamaño va a
depender de la disponibilidad del alimento y de las condiciones climáticas, entre otros
factores, en este estadio se desarrollan los dardos urticantes, dichos dardos se agrupan
en el interior de dispositivos formados por repliegues del tegumento. Además se
comienza la fabricación del bolsón de invierno (Figura 1.5). Transcurridos entre 30-50
días, las orugas vuelven a mudar, alcanzando el cuarto estadio, fase de duración más
variable en función de las condiciones climáticas, puesto que coincide con los meses
centrales del invierno. La alimentación es crepuscular y nocturna. Su tamaño oscila
entre 25-35 mm. Durante el cuarto y el quinto estadio larvario los cambios que se
producen en la apariencia de las larvas se refieren al aumento tanto de la longitud como
del número de pelos urticantes. La cuarta muda da lugar al quinto y definitivo estadio,
esta fase suele durar unos 30 días. Cuando las condiciones ambientales son favorables
las larvas maduras abandonan los pinos y se dirigen en procesión de bajada, encabezada
por una hembra, hacia el suelo, en busca de un lugar seco, bien drenado y soleado, para
enterrarse y crisalidar (la temperatura óptima del emplazamiento del enterramiento es de
unos 20 ºC) (Figura 1.6). Dos o tres días antes de producirse esto, las larvas dejan de
comer para que el tubo digestivo quede completamente limpio. Llegados a este punto,
toda la colonia se va enterrando en el suelo, mediante movimientos acompasados a
pocos centímetros, aunque esto va a depender del tipo de suelo en el que se encuentren.
Acto seguido, hilan un capullo individual, y tras profundos cambios alcanzan la fase de
crisálida (Figura 1.7), la cual es muy variable, puesto que puede durar desde unos pocos
meses hasta 4 años, si la crisálida entra en un período de diapausa prolongada,
mecanismo que detiene el desarrollo de la crisálida, para que esta pueda emerger en la
época más adecuada, puesto que depende de la temperatura. Llegado a este punto, la
mariposa emerge del capullo, completando así el ciclo.
Figura 1.5. Bolsón de la procesionaria (www.moineaudeparis.com)
Figura 1.6. Orugas de procesionaria del pino en procesión antes del enterramiento
(www.bkmakro.de)
Es un defoliador invernal que soporta el invierno gracias a la proteccion termica que
le proporciona el vivir en colonias de orugas que tejen un bolsón de seda blanquecino en
el que se refugian del frío y de la depredación, y crecen a lo largo del otoño e invierno.
Las larvas mantienen ese comportamiento gregario durante los cinco estadios larvarios.
Se calientan con la radiación solar, acumulando calor para poder salir a alimentarse de
las hojas de los pinos por la noche, puesto que, el factor limitante más influyente en la
expansión de la procesionaria es el clima (Hodar y Zamora, 2004), debido a
la
sensibilidad que este insecto presenta ante las temperaturas extremas. Es una especie
circunmediterranea, típica de zonas templadas o más bien cálidas, por lo que el ciclo de
desarrollo en las zonas frías da comienzo antes y finaliza más tarde que en las
localidades más cálidas (Dajoz, 1980).
En nuevas repoblaciones forestales las primeras infestaciones nunca son graves, los
primeros bolsones aparecen en número escaso y dispersos. Al año siguiente los bolsones
se distribuirán uniformemente en el 3-4 % de los pinos, un año después pueden verse
afectados el 60-70 % de los pinos y al año siguiente la defoliación puede extenderse a
toda la masa arbórea. Los factores ambientales tienen
una gran influencia en el
crecimiento y en las posibilidades de supervivencia de las plantas, por los que juegan un
papel muy importante en las relaciones insecto-planta, puesto que afectan a la
preferencia del insecto por determinadas variantes de su huésped y a las repuestas de las
plantas al estrés provocado (Kyto et al., 1999; Turtola et al., 2002). El aspecto
fundamental para determinar cual es el mejor momento para aplicar alguna medida de
control, es precisar la duración del ciclo biológico de este lepidóptero, lo cual resulta
muy complicado, debido a la influencia de la climatología en dicho ciclo.
Figura 1.7. Adulto de la procesionaria
Figura1.8. Pupas de procesionaria (flickr.com)
Figura 1.9. Mapa de distribución de la procesionaria del pino (www.eppo.org)
1.3. Mecanismos de defensa en las plantas: Compuestos fenólicos
En la naturaleza, las plantas a lo largo de toda su vida se encuentran con numerosos
ataques de una amplia gama de organismos patógenos, de modo que para poder
sobrevivir, tendrán que detener su entrada mediante una serie de mecanismos de
defensa.
Las coníferas son organismos muy longevos que han colonizado diferentes hábitats.
Este éxito se debe, en parte, a la evolución de sus potentes mecanismos de defensa,
puesto que son estas las que ayudan a las plantas a defenderse ante los ataques de los
organismos, esterilizando, sellando y sanando los tejidos dañados e incluso
protegiéndolas contra invasiones futuras que puedan afectarles de forma perjudicial
(Phillips y Croteau, 1999; Trapp y Croteau, 2001).
Para la resistencia de las coníferas, el árbol cuenta con una serie de defensas, como
pueden ser la producción de oleoresina, terpenos o compuestos fenólicos (Klepzig et al.,
1995; Trapp y Croteau, 2001; Rosner y Hannrup, 2004; Franceschi et al., 2005). Se
distinguen dos tipos básicos de estrategias de defensa, las defensas constitutivas y las
defensas inducidas (Matson y Hain, 1985; Franceschi et al., 2005). A pesar de estar
reguladas por factores diferentes deben coordinarse para lograr un efecto óptimo para
poder proporcionar una defensa potente contra los ataques. Las defensas constitutivas e
inducidas, pueden ser de dos tipos: mecánicas o químicas (Matson y Hain, 1985;
Franceschi et al., 2005). Las defensas mecánicas son elementos estructurales que
proporcionan una mayor dureza y espesor a los tejidos, como la presencia de espinas
(puede ser eficaz contra los animales más grandes), pelos, escamas o la impregnación de
tejidos con polímeros como la lignina y la suberina, a los que se les agregan
propiedades mecánicas por mejorar la resistencia a la penetración, degradación e
ingestión, por parte de los invasores, particularmente por los organismos más pequeños.
Las defensas químicas incluyen la producción, acumulación, y liberación de una gran
diversidad de sustancias tóxicas para los organismos patógenos, como por ejemplo la
variedad de alcaloides, fenoles simples o polifenoles (taninos), aceites esenciales y
terpenos en general (generalmente denominados fitoalexinas o antibióticos) que son
capaces de producir y almacenar las células vegetales, en los diferentes tejidos (Fäldt et
al., 2003; Holton et al., 2003).
Las defensas constitutivas, que están presentes en todo momento a lo largo de toda
la vida del árbol aunque este no sea atacado por ningún herbívoro, forman parte de la
estructura física o química basal de la planta. Además, forman la primera línea de
defensa de las plantas deteniendo la invasión inicial de patógenos al organismo. Las
defensas inducidas son reacciones que permiten potenciar las barreras, para mejorar las
defensas constitutivas, induciendo la activación de cambios en una amplia gama de
respuestas tanto químicas como estructurales y procesos que limitan la magnitud del
daño infligido por el organismo invasor, aumentando la secreción de oleoresina,
formando conductos de resina traumática, o aumentando la síntesis de compuestos
fenólicos, como los taninos condensados (Franceschi et al., 2002; Martin et al., 2002;
Heil et al., 2004; Hudgins y Franceschi, 2004). Esta variación en la resistencia de la
planta puede ser debida a factores bióticos y abióticos (Lorio, 1986; Herms y Mattson,
1992). Se activan cuando la célula vegetal detecta la presencia de un patógeno, en un
tejido viviente de la planta. Dicha respuesta puede actuar tanto a nivel local, es decir,
en el tejido que está directamente en contacto con el patógeno (Simms y Fritz, 1990;
Doyle et al., 2002), donde la reacción es más severa, como a nivel sistémico, en los
tejidos no infectados de la planta, donde actúa de modo más suave (Heil y Silva Bueno,
2007).
Estas defensas inducidas pueden actuar contra una infección actual o contra
infecciones futuras. Las defensas inducidas son de resistencia variable, su valor viene
determinado por la naturaleza de los ataques así como por la genética del individuo.
Poseen un componente temporal del sistema que viene determinado por la disposición
de las defensas constitutivas, y consiste en la producción temporal, estacional o
continua de las defensas en los nuevos tejidos y mejorar la producción de las defensas
en los tejidos atacados.
Hay cuatro
pasos o fases en los sistemas de defensa de las plantas, que son
indiferentes de los ataques de los organismos: El primero es una defensa constitutiva
eficaz que puede repeler o inhibir la invasión de tejidos. Si esto no es eficaz, la próxima
fase es matar o aislar el organismo invadido. Una tercera fase de defensa es sellar y
reparar el daño sufrido por la planta, para que ésta pueda continuar su funcionamiento
normal y poder prevenir las infecciones oportunas. Finalmente, adquirida la inducción
de la resistencia sistémica, la planta puede defenderse más fácilmente contra ataques
futuros.
La resistencia a las agresiones bióticas que sufren los pinos se consigue con la
adecuada combinación de estrategias y tipos de defensas. El éxito biológico de las
coníferas, se debe, en parte, a los mecanismos de defensa, como la variación de la
cantidad y composición de compuestos fenólicos, oleorresinas y estructuras estáticas en
el floema secundario, como células lignificadas y oxalato de calcio, cristales que crean
las barreras físicas, entre otros (Franceschi et al., 2005). Los compuestos fenólicos, son
clasificados como metabolitos secundarios de las plantas, por lo tanto, no están
relacionados con el crecimiento ni la reproducción, factores pertenecientes al
metabolismo primario. Los compuestos fenólicos poseen como característica biológica
ser productos secundarios de su metabolismo y como característica química contener al
menos un grupo fenol, es decir, un anillo aromático unido al menos a un grupo
funcional hidroxilo en su estructura molecular se encuentran en todas las plantas
terrestres. Están constituidos por más de 8.000 compuestos presentes en muchas
estructuras diferentes, en los que normalmente varía su concentración (Hartley y Jones,
1997; Dey y Harborne, 1997). Son un grupo heterogéneo, desde el punto de vista
metabólico, de productos biosintetizados, que a pesar de poder ser sintetizados por
diferentes vías, en general, lo hacen por medio de dos vías básicas: la vía del ácido
shikímico, (que participa en la biosíntesis de la mayoría de los fenoles de las plantas
superiores y utiliza como sustratos la eritrosa-4-fosfato y el ácido fosfoenolpirúvico) o
la vía del masónico, la cual es una importante fuente de fenoles en bacterias y hongos
(en las plantas superiores aunque también existe, no es tan utilizada).
Si esta clasificación se hace en base a su esqueleto químico los fenoles se pueden
ser: simples, (con un anillo aromático) o compuestos, los cuales, a su vez, se clasifican
en ligninas (polímeros de fenoles simples), flavonoides (complejos multifenólicos
denominados polifenoles y compuestos por dos anillos fenólicos unidos por una cadena
de tres carbonos: antocianidinas, flavonoles e isoflavinas) y taninos (son polifenoles
hidrosolubles que difieren más que otros compuestos fenólicos por su habilidad de
componer las proteínas precipitadas) (Zou y Cate, 1995; Ayres et al., 1997; Honkanen
et al., 1999; Keinanen et al., 1999; Laitinen et al., 2002; Sallé et al., 2005).
Tienen una gran variedad de papeles en la vida de las plantas, generalmente
atribuidos a los productos secundarios de las plantas, como por ejemplo la
antocianidina, que es el mayor contribuyente a la hora de florecer y dar color a la fruta
y de atraer polinizadores o dispersores de frutos. Muchos de los compuestos fenólicos,
como los taninos, son productos de defensa ante herbívoros y patógenos (Ayres et al.,
1997). Otros como la lignina proveen soporte mecánico a la planta. O en el caso de los
flavonoides y los ácidos salicílicos pueden actuar como agentes alelopáticos (Franceschi
et al., 2005). En las coníferas, los fenoles de la hoja y especialmente los taninos, son
muy valiosos a la hora de proteger a las plantas de los herbívoros o de las infecciones
microbianas, por proporcionar estructuras de apoyo, protección y defensa durante toda
la vida de la hoja (Zou y Cate, 1995; Ayres et al., 1997). Los niveles de concentraciones
de fenoles totales están, en parte, condicionados por las condiciones medioambientales,
como los factores relacionados con la luz, disponibilidad de recursos, época de año,
niveles de nutrientes (siendo el nitrógeno el elemento esencial que controla la síntesis de
fenoles), agua, y presión de herbívoros (Herms y Mattson, 1992). Pero también están
determinados por la genética de la planta (Keinanen et al., 1999).
En el caso de las hojas, la regulación de la síntesis de fenoles es una parte integra de
su desarrollo, pero que hay que tener en cuenta que las concentraciones varían con el
cambio estacional, (son altas durante la formación del brote y bajas durante la expansión
de la hoja), la edad de la hoja (Keinanen et al., 1999; Laitinen et al., 2002). Se ha
propuesto que la estrategia más eficaz para producir fenoles en la defensa contra
herbívoros, son los sintetizados en las hojas jóvenes, porque estas son las de mayor
valor para las plantas y a su vez, son las que ofertan una mayor calidad nutritiva para
los herbívoros que las hojas maduras (Pavia et al., 2002). Sin embargo, las hojas
jóvenes no siempre contienen mayores concentraciones de fenoles que las hojas
maduras, sobretodo si se examinan los compuestos individuales (Estiarte et al., 1994).
Una posible explicación para esto es que las hojas maduras son valiosas para las plantas
porque ellas proporcionan la mayoría de los hidratos de carbono a las estructuras
reproductoras y a los retoños crecientes y raíces (Krischik y Denno, 1983).
Ante la invasión de los diferentes organismos, la planta sufre una modificación
bioquímica que modifica las concentraciones de los compuestos pertenecientes al
metabolismo secundario, afectando, a su vez, al metabolismo primario, es decir,
mermando así la capacidad de crecimiento y diferenciación de los órganos de la planta.
Defensas de las
coníferas
Defensas
constitutivas
Defensas
inducidas
En corteza y madera
En hojas
En hojas
Físicas
Físicas
Tricomas
Cera
Dureza
Quimicas
Grosor corteza
Quimicas
Terpenos y
Fenoles
Polifenoles
Terpenos
Resina
En corteza y madera
Restauración del peridermo
Respuesta sistémica
generalizada
Reacción hipersensible
Síntesis de resina secundaria
Canales resiníferos traumáticos
Reducción de la calidad nutritiva
Incremento de las sustancias del
metabolito secundario
Reacción hipersensible
Figura 1.10. Esquema de defensas en coníferas
1.4. Importancia del Metil-Jasmonato como inductor de defensas
La aplicación exógena de algunas fitohormonas, como el ácido jasmónico o sus
derivados, tales como Metil-Jasmonato (MJ), pueden alterar tanto el crecimiento como
el desarrollo vegetal provocando en numerosos casos respuestas fisiológicas similares a
las de las hormonas vegetales, induciendo en las plantas reacciones químicas,
anatómicas y fisiológicas relacionadas con las defensas (Thaler et al., 2001; Martin et
al., 2002; Zeneli et al., 2006). El MJ se caracteriza por ser un potente elicitor de
reacciones defensivas en las plantas, tales como la formación de conductos de resina
traumáticos, la acumulación de mono y diterpenos, o la formación de compuestos
fenólicos (Franceschi et al., 2002; Heijari et al., 2005). También se ha demostrado que
puede inhibir la germinación del polen y la semilla (Wilen et al., 1990), o inducir la
acumulación de proteínas de almacenamiento (Mason y Mullet, 1990) y de ARNm que
codifica proteínas en la embriogénesis (Reinbothe et al., 1993). Tal información puede
ser de uso en las estrategias para la manipulación química o genética de la resistencia de
las coníferas.
Aunque fue en la década de los 80 cuando se empezaron a describir los numerosos
efectos de los jasmonatos, tales como la inhibición del crecimiento de la raíz, la
promoción de la senescencia, o la vía de síntesis de estos compuestos (Vick y
Zimmerman, 1984; Staswick, 1992), no fue hasta los últimos años cuando fueron
propuestos como señales implicadas en procesos metabólicos, como desencadenar
respuestas, induciendo cambios químicos y anatómicos en muchas partes de las plantas
(Creelman y Mullet, 1995; Creelman y Mullet, 1997). El hidroperóxido del ácido
linolénico se convierte, mediante la acción de una hidroperóxido ciclasa en un ácido
graso cíclico de 18 átomos de carbono, el 12-oxofitodienoico (12 oxo-PDA)
(Zimmerman, 1978). Este último es reducido a β-oxidado hasta un ácido compuesto de
12 carbonos, el antes mencionado ácido jasmónico (Figura 1.12). El ácido linolénico es
liberado en respuesta a señales traumáticas y es convertido en jasmonato (Farmer y
Ryan, 1992).
COOH
O2
Lipooxigenasa
OOH
COOH
Acido 13-hidroperoxilinolénico
[13-HPOtre]
Hidroperóxidociclasa
COOH
12-oxo-PDA
O
Reductasa
COOH
O
β-oxidación
COOH
O
β-oxidación
COOH
O
β-oxidación
O-glucósidos
H
R
COOH
S
Epimerización
O
H
Oxidac.
Jasmónico
(1R,2S)
COOH
Reducción
Conjugación
Conjugadas
* Metil y glucosil ésteres
* Con aminoácidos
O
COOH
(-) Jasmónico (1R,2R)
Hidroxilaciones
HO
Figura 1.12. Ruta metabólica del metil jasmonato.
2. JUSTIFICACIÓN, HIPÓTESIS DE TRABAJO Y OBJETIVOS
Las respuestas defensivas inducidas comunes a la familia Pinaceae incluyen el
aumento del flujo de resina y la síntesis de fenoles adicionales. En un Proyecto Fin de
Carrera recientemente defendido se ha demostrado que la inducción química mediante
MJ produjo un aumento en la cantidad de resina en los tallos, produciendo una mayor
resistencia a la herbivoría en el laboratorio.
En este trabajo se pretende evaluar la variación genética en caracteres de resistencia
constitutivos e inducidos en juveniles de P. radiata, con el fin de explorar las
posibilidades de mejorar genéticamente la resistencia a insectos en esta especie,
comparando la anatomía de las defensas entre las diferentes familias de coníferas,
obteniendo un buen entendimiento acerca de las estrategias de los mecanismos de
defensa. Nos centraremos en el contenido en fenoles totales en las acículas, cuyo papel
defensivo ha sido demostrado en otros sistemas planta-insecto, y utilizaremos la
aplicación exógena de MJ y la realización de heridas mecánicas en el tallo para elicitar
la inducción de defensas. Por último se pretende valorar la eficiencia de los fenoles
totales como caracteres de defensa, mediante el establecimiento de bioensayos in vitro
con la procesionaria del pino. Los objetivos específicos que se pretenden abordar en el
presente proyecto son los siguientes:
1. Estudiar si existe variación genética en el contenido foliar de fenoles totales, tanto
constitutivos como inducidos, en juveniles de P. radiata.
2. Evaluar si la aplicación exógena de MJ en una concentración baja de 25 mM, y la
realización de heridas mecánicas en el tallo de las plantas son efectivas como agentes
inductores del contenido de fenoles totales en las acículas en plántulas de P. radiata.
3. Estudiar si la aplicación exógena de MJ a las plantas aumenta la resistencia contra
la procesionaria del pino mediante un bioensayo in vitro en el laboratorio.
3.MATERIAL Y MÉTODOS
3.1. Material vegetal y tratamientos
Para conseguir los objetivos de este trabajo, se realizó un experimento con juveniles
de 36 familias de polinización abierta de árboles plus de la población de mejora de P.
radiata en Galicia, procedentes del huerto semillero de Sergude. En Abril del 2006, se
sembraron en macetas de dos litros, rellenas con perlita y cubiertas con una capa de
arena estéril, grupos de dos semillas pertenecientes a la misma familia (medioshermanos, hijos de la misma madre), A cada maceta se le aplicó 12 g de un fertilizante
de liberación lenta Multicote® (N:P:K 15:15:15) y fueron cultivadas en invernadero en
condiciones de temperatura, humedad y luminosidad controladas. Fueron regadas
diariamente con agua, mediante aspersión temporizada. Las plantas se dispusieron en el
diseño de bloques definitivo tras el primer invierno.
3.2. Diseño experimental
El diseño experimental fue split-plot replicado en 4 bloques para compensar la
variación ambiental que podemos encontrar en un invernadero, puesto que a pesar de
estar bajo condiciones controladas de temperatura, luz, riego y humedad, el ambiente no
es homogéneo debido a los factores externos de sol y sombra. Cada bloque está dividido
en tres tratamientos: un control no tratado y dos tratamientos de inducción, uno
mediante la aplicación exógena de MJ y otro basado en la realización de heridas
mecánicas en el tallo (‘mechanical wounding’). Para reducir el esfuerzo experimental,
se utilizó un tamaño muestral diferente para cada uno de los tres objetivos planteados.
Por tanto, cada tratamiento tuvo un número de familias diferente. En los tratamientos
control y MJ se emplearon 36 familias, mientras que para el tratamiento de heridas
mecánicas se emplearon 10 familias elegidas al azar dentro de las 36 totales de las que
consta el estudio.
Para el primer objetivo, analizar si la variación genética influye en la cantidad de
defensas constitutivas e inducidas, se emplearon dos tratamientos, un control no tratado
para estudiar las defensas constitutivas, y un tratamiento de inducción de MJ para
estudiar las defensas inducidas, en 36 familias para un total de 288 plantas (36 familias
x 2 tratamientos x 4 bloques).
Para el estudio del segundo objetivo, comparar los daños físicos (‘mechanical
wounding’ o heridas mecánicas) con la inducción mediante MJ el tamaño muestral se
redujo a 10 familias de las 36, en 3 tratamientos (control, MJ y heridas mecánicas) para
un total de 120 plantas (10 familias x 3 tratamientos x 4 bloques).
Para el estudio del tercer objetivo, estudiar la efectividad del tratamiento de
inducción en la resistencia contra la procesionaria, se empleó un bioensayo “in vitro” en
el laboratorio, con muestras de acículas y larvas de procesionaria en tarrinas. Para este
objetivo se emplearon dos tratamientos (un control no tratado y un tratamiento de
inducción mediante la aplicación exógena de MJ). En ambos tratamientos c se
emplearon 36 familias para un total de 288 plantas (36 familias x 2 tratamientos x 4
bloques).
3.3. Aplicación de los tratamientos experimentales y cosechado de las plantas
A los dos años (Julio 2008) se aplicaron los distintos tratamientos experimentales de
inducción de defensas (heridas mecánicas y aplicación del MJ).
El tratamiento de MJ se aplicó planta por planta mediante pulverización de
aproximadamente 6 ml de una solucion 25 mM de MJ en agua destilada con Tween
20® al 0.1% v/v. A las plantas control se le aplicó de idéntica forma agua destilada.
Las heridas mecánicas se realizaron con una herramienta (sacabocados) practicando
una pequeña herida en la mitad del tallo que profundizase hasta el xilema.
Un mes después de la aplicación de los tratamientos de inducción se cosecharon las
dos plantas de cada maceta. Una de las plantas cosechadas se conservaba en frío (-20ºC)
para su posterior análisis del contenido de fenoles, mientras que de la otra se muestreaba
un grupo de acículas para emplear en el bioensayo con procesionaria.
Se midieron la altura y diámetro de todas las plantas tanto en el momento de la
aplicación como al final del experimento (un mes después).
3.4. Captura, mantenimiento y bioensayo con procesionaria
Para conseguir nuestros objetivos capturamos diversos bolsones de procesionaria en
diferentes pinos de la isla de Arousa (SW Galicia). Manipulamos los bolsones y
seleccionamos las orugas con diferentes estadios larvarios.
La realización del bioensayo “in vitro” consistió en recluir seis orugas de peso
conocido en tarrinas de 750 ml, con una muestra de acículas de los pinos jóvenes
previamente pesada. Se mantuvieron en un lugar fresco, seco y oscuro (evitando así, que
las orugas se estresaran y obtener el mínimo número de mortandad) .El levantamiento
del experimento se realizó 48 horas después, momento en el que evaluamos la tasa de
ingestión por diferencia de peso en mg (peso acículas inicialmente menos al final del
bioensayos).
Selección de pinos con
la plaga de
procesionaria
Cosechamos los
bolsones
En cada placa metemos (15-20 g)
de acículas de cada individuo,
durante 48 horas. Pasado ess
tiempo pesamos las acículas.
Manipulación de los
bolsones de
procesionaria
Pesamos de 3 en 3 las
larvas en una placa petri
Figura 3.1. Manejo de la procesionaria
3.5. Determinación de fenoles totales
Para estudiar el contenido de defensas constitutivas e inducidas procedemos al
análisis de los fenoles totales por unidad de peso seco de acículas (mg de fenoles g-1
peso seco de acículas), cuantificando el contenido de fenoles totales mediante una
valoración colorimétrica siguiendo el método propuesto por Baraza et al. (2004) basado
en el método del reactivo Folin-Cicocalteau (Makar, 2000). Para ello se tomó una
muestra representativa de 2-3 g de peso fresco de las acículas de cada planta, se
molieron en un mortero con nitrógeno líquido hasta reducirlas a polvo, y se secaron a
40 ºC durante 48 horas en una estufa de aire forzado.
Para realizar la extracción de los fenoles, se pesó 0,3-0,5 g de materia seca y molida
de cada una de las muestras de acículas molidas, se les añadió 10 ml de metanol al 50%,
se agitaron, se sometieron a un baño de ultrasonidos durante 15 minutos, para eliminar
las pequeñas burbujas de aire en la muestra, y, acto seguido, se introdujeron 20 minutos
en la ultracentrifugadora a 2500 rpm, compactando las pequeñas partículas. De este
modo, se facilitaba la extracción en estado líquido del extracto de metanol con una
pipeta, dejando los restos de acículas en fase sólida para meter en la estufa a 65 ºC
durante 48 h y calcular el peso seco de acículas. El extracto original tiene una
concentración de 50 mg ml-1, la cual se debe diluir hasta obtener la concentración
deseada en la disolución, pudiendo realizar así su lectura a través de una valoración
calorimétrica en microplacas con el espectrómetro a 740 nm. Para ello diluimos con la
ayuda de un diluidor automático 0,4 ml de extracto con 9,6 ml de agua destilada, lo que
nos da una dilución de 2 mg ml-1, de la cual tomamos una muestra de 2 ml del extracto
diluido, y le añadimos 1 ml de agua destilada, lo que dio lugar a la concentración
deseada. A la par, se prepararon seis patrones con concentraciones conocidas, a partir de
una disolución madre de 20 mg ml-1 obtenida de diluir 0,5 g de acido tánico en 25 ml de
agua destilada. Cinco de los seis patrones se prepararon diluyendo la disolución
estandar de 20 mg ml-1 hasta conseguir las siguientes concentraciones: 62,5; 31,25;
15,625; 7,813; y 3,9063 μg ml-1. El sexto patrón es un blanco en el que se coloca agua
destilada. En cada microplaca se pusieron 200 μL de cada patrón replicado 6 veces y 19
muestras replicadas 3 veces, y en todos los pocillos de las microplacas se adicionaron
20 μL de reactivo Folin-Ciocalteau, transcurridos unos minutos, 40 μL de Na2CO3 20%,
por lo tanto el volumen final de cada uno de los pocillos sería de 260 μL. Para que la
mezcla pueda adquirir diferentes tonalidades de azul, proporcional a la concentración de
fenoles contenida en las muestras, deben de transcurrir 2-2,5 h. Posteriormente se
procederá a determinar la absorbancia mediante un lector de microplacas con un filtro
de 740nm, mediante la cual se pudo estipular la ecuación que relaciona ambas variables,
a través de una regresión lineal de la recta de los patrones en cada microplaca, y al fin
poder evaluar la concentración de ácido tánico de cada muestra expresada en mg.
La ecuación de la recta es:
y=a*x+b
Donde y es la absorbancia, a y b son
parámetros deducidos para cada recta y x es la concentración de fenoles totales
medidos.
Como las concentraciones logradas con este cálculo no corresponden a los 200 μL
de extracto, sino a los 260 μL de muestra de extracto mezclado con los reactivos
presentes en cada pocillo, se aplicó la relación
C * V = C´ * V´
, para poder
precisar la concentración de cada muestra. Donde C es la concentración en el pocillo
(mg mL-1), V es el volumen del pocillo (260 μL), C´ es la concentración en la alícuota
(mg mL-1), y V´ el volumen en la alícuota (200 μL). El cálculo de los mg equivalentes
de ácido tánico por cada gramo de muestra de acícula seca, se obtuvo con la siguiente
operación: C´ * 10 mL CH3OH / 0,5 g muestra seca.
Tomamos muestras
de acículas (1-2 g)
de cada planta
Tomamos (0,3-0,5g)
de cada muestra
Extracción de fenoles totales
con metanol al 50%
Realizamos la molienda manual de
cada muestra
Se secan 48 horas en
estufa a 40º
Durante 15 minutos en baño
de ultrasonidos
Hasta obtener
pequeñas partículas
20 minutos en la
centrifuga a 2500rpm
Para separamos las partículas de acículas de los fenoles y el
metanol, decantamos el sobrenadamte
Pasa a la siguiente
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Diluimos la concentración
de las muestras
Pipeteado de
muestras y patrones
en microplacas
Incorporamos Reactivos a las
microplacas para que
desarrollen el color
Con un diluidor automático
Preparamos patrones de ácido tánico con concentraciones
conocidas
Lectura de las microplacas con el
espectrómetro a 740 nm
Figura 3.2. Análisis de los fenoles totales
3.6. Análisis estadístico
La evaluación del efecto de los factores de estudio (genotipo, tratamiento y
bloque) sobre la expresión de las defensas en las plantas se realizó empleando como
variable de medida el contenido de polifenoles totales (mg equivalentes de acido tánico
g-1 peso seco de tallo).
El análisis para identificar los efectos consistió en un modelo mixto de análisis
de varianza de acuerdo con el diseño split-plot, empleando el procedimiento PROCMIXED
del
programa
SAS
System,
de
acuerdo
con
el
modelo:
Yijk = µ + Bi + Tj + T*Bji +Gk + T*Gjk + G*Bki + εijk + (Pins)
Donde µ es la media general, B es el efecto de los bloques, con la que se
compensan las variables microambientales sobre las variables de medida de la planta; T
es el efecto del tratamiento de inducción, T*B es la interacción entre los tratamiento y el
bloque, G es el efecto de los genotipos, T*G es la interacción entre los tratamientos y el
genotipo, G*B es la interacción entre el genotipo y los bloques; ε es el error aleatorio y
Pins es el peso del insecto aplicado a cada planta, empleado como covariable en el
análisis de los bioensayos.
Antes de realizar los análisis se comprobó que los datos cumpliesen los
requisitos del ANOVA: homogeneidad de las varianzas, que los residuos sigan una
distribución normal y la independencia de los datos observados.
4. RESULTADOS
Los resultados del análisis estadístico de las mediciones del contenido de fenoles
totales realizados según los factores de diseño para los objetivos 1 y 2 se muestran en
las tablas 1 y 2. En ellas observamos los grados de libertad del numerador (GLnum), los
grados de libertad del error en el denominador (GLdenom), el valor del estadístico F y
la probabilidad (p) de aceptar la hipótesis nula para el correspondiente valor de F y sus
grados de libertad para cada uno de los efectos.
Para el primer objetivo, analizar si la variación genética influye en la capacidad de
inducir defensas, observamos que el efecto de la pertenencia a una u otra familia de P.
radiata y la interacción entre el tratamiento de T y la familia (TxG) no resultaron
significativas en el contenido de fenoles totales en las acículas de los pinos (Tabla 4.1,
Figure 4.1). Por otro lado, la aplicación experimental del tratamiento de MJ tampoco
afectó de manera significativa al contenido de fenoles totales en las acículas (Tabla 4.1,
Figura 4.2).
Tabla 4.1. Resumen del análisis de varianza según el modelo mixto para el contenido de
fenoles totales en acículas de plantas de 2 años de edad pertenecientes a 36 familias de
polinización abierta de P. radiata sometidas a dos tratamientos de inducción de
defensas (control y 25 mM MJ).
Efecto
GLnum
GLden
F
p
B
3
3
0,55
0,680
MJ
1
3
0,25
0,649
G
35
102
1,10
0,344
MJxG
35
102
0,89
0,650
BxG
105
102
0,75
0,923
60
n.s.
mg g-1 d.w.
Fenoles totales
50
40
30
20
10
0
0 1 10 11 12 16 17 19 21 22 32 33 34 35 37 41 44 45 46 47 49 50 51 64 68 69 73 74 76 77 78 79 80 83 84 86
Familia de P. radiata
Figura 4.1. Contenido de fenoles totales en las acículas de plantas de 2 años de edad
pertenecientes a 36 familias de P. radiata. Los datos mostrados son las lsmeans ± error
estándar. N = 8.
n.s.
35
mg g-1 d.w.
Fenoles totales
40
30
25
20
15
10
5
0
Control
MJ
Figura 4.2. Contenido de fenoles totales en las acículas de plantas de 2 años de edad de
P. radiata sometidas a dos tratamientos de inducción de defensas (control y 25 mM
MJ). Los datos mostrados son las lsmeans ± error estándar. N = 144.
Para el segundo objetivo, comparar el efecto de la inducción mediante daños físicos
(‘mechanical wounding’) con la inducción mediante MJ, observamos que el realizar
estas heridas mecánicas y aplicar MJ a las plantas no afectó significativamente al
contenido de fenoles totales de los pinos (Tabla 4.2). A pesar de que, las plantas a las
que se realizaron heridas mecánicas presentaron un mayor contenido de fenoles totales
que las plantas tratadas con MJ y, esta a su vez que las plantas control, las diferencias
no resultaron significativamente diferentes (Figura 4.2). Por otro lado, en este grupo de
familias tampoco observamos diferencias significativas en el contenido de fenoles
totales entre las diferentes familias de P. radiata (Tabla 4.2).
Tabla 4.2. Resumen del análisis de varianza según el modelo mixto para el contenido de
resina en el tallo de plantas de 2 años de edad pertenecientes a 10 familias de
polinización abierta de P. radiata sometidas a tres tratamientos de inducción de
defensas (control, 25 mM MJ y daños físicos o mechanical wounding).
Efecto
GLnum
GLden
F
p
B
3
6
0,14
0,934
MJ
2
6
0,99
0,425
G
9
55
0,98
0,465
MJxG
18
55
0,57
0,906
BxG
27
55
0,74
0,805
n.s.
35
mg g-1 d.w.
Fenoles totales
40
30
25
20
15
10
5
0
Control
MJ
MW
Figura 4.2. Contenido de fenoles totales en las acículas de plantas de 2 años de edad de
P. radiata sometidas a tres tratamientos de inducción de defensas (control, 25 mM MJ y
daños físicos o mechanical wounding, MW). Los datos mostrados son las lsmeans ±
error estándar. N = 40.
Para el tercer objetivo, estudiar si la inducción experimental de defensas es efectiva
contra el ataque de la procesionaria del pino, observamos que la aplicación de MJ no
afectó significativamente a la tasa de ingestión del herbívoro con respecto al control.
Además, y en contra de lo esperado, el herbívoro comió más en las acículas de las
plantas tratadas con MJ, con defensas incrementadas, que de las plantas control, aunque
las diferencias no fueron estadísticamente significativas (Figura 4.3).
mg comidos por la procesionaria
3.0
F1,3 = 0,63; n.s.
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
Control
MJ
Figura 4.3. Efecto de la inducción de respuestas defensivas en juveniles de P. radiata
mediante la aplicación de 25 mM MJ sobre la cantidad consumida (mg) por la
procesionaria del pino en un bioensayo in vitro. Los datos mostrados son las lsmeans ±
error estándar. N = 144.
5.DISCUSIÓN
5.1 Variación genética en el contenido de fenoles
En nuestro estudio no encontramos variación genética en el contenido de fenoles
totales en las acículas, sugiriendo de este modo que no existen genotipos superiores en
cuanto a la producción y acumulación de fenoles totales en las acículas. Algunos
estudios han encontrado variación genética en algunos sistemas defensivos de coníferas,
como por ejemplo en la cantidad de ácidos resiníferos y otros terpenoides del grupo de
los estilbenoides (Harju et al., 2008), en la densidad de canales resiníferos (vanAkker et
al., 2004) y de resina
(Rosner y Hannrup, 2004; O'Reilly-Wapstra et al., 2006;
Donaldson and Lindroth, 2007), y en el contenido de determinados fenoles (Keinanen et
al., 1999). Aunque ninguno de estos trabajos fue realizado en P. radiata, nosotros
esperábamos encontrar en alguna medida cierta variación genética en el contenido de
polifenoles foliares.
Aunque el método de análisis de fenoles que empleamos presenta una muy buena
precisión y un nivel de detección adecuado, es posible que la ausencia de control
genético en nuestro caso pueda ser achacable a un tamaño muestral bajo dentro de cada
familia. Sin embargo, en un estudio previo (Rodríguez-Morales, 2008), tampoco ha
encontrado variación genética en el contenido de fenoles totales en hojas de P. pinaster
juveniles. Es posible por tanto que la variación genética en el conjunto total de estos
compuestos defensivos en las poblaciones gallegas de estas especies sea en efecto baja.
Aunque esto no descarta que exista variación genética en el contenido de algunas
especies fenólicas con una relevancia defensiva más marcada (Keinanen et al., 1999).
5.2 Inducción del contenido de fenoles en acículas
En contra de lo esperado, no hemos encontrado un incremento de la concentración
de fenoles totales tras la aplicación de MJ o de daños mecánicos. La eficacia del MJ
como elicitador de respuestas inducidas equivalentes a las de la herbivoría real en
juveniles de coníferas está ampliamente ilustrado en la literatura reciente, incluyendo
una mayor densidad de canales resiníferos, un mayor flujo de resina, o una mayor
densidad del parénquima polifenólico en el floema (Martin et al., 2002; Hudgins et al.,
2004; Hudgins y Franceschi, 2004; Miller et al., 2005). En nuestro trabajo hemos
empleado concentraciones de MJ más bajas que las empleadas en dichos estudios, pero
que habían sido demostradas efectivas en la inducción de resina y fenoles en P. pinaster
(Blanco, 2007; Costas, 2007; Rodríguez-Morales, 2008; Moreira et al., 2009). El
empleo de concentraciones muy elevadas de MJ esta muy criticado en el ámbito
científico, pues las respuestas pueden no ser naturales, y por esa razón hemos empleado
las concentraciones más bajas posibles con las que hemos encontrado respuesta. La
ausencia de respuesta al 25 mM MJ en P. radiata empleado en este experimento sugiere
que esta especie es menos sensible a este compuesto que P. pinaster. Una posibilidad
alternativa es que P. radiata no presente una inducción de fenoles tan marcada como P.
pinaster u otras especies en respuesta a la herbivoría. En este sentido, la concentración
de fenoles totales que encontramos son mucho mas altas que las observadas en P.
pinaster de edades similares (Rodríguez-Morales, 2008). En esta circunstancia, sería
posible que una concentración constitutiva muy alta de fenoles en P. radiata estuviese
asociada a una baja inducibilidad.
Sin embargo, el hecho de que el MJ haya resultado efectivo en la inducción del
contenido de resina en el tallo en las plantas de este mismo experimento (Fernández,
2009), sugiere que posiblemente la concentración de MJ empleada esté por debajo del
nivel efectivo para la inducción de fenoles. Esto sería un resultado muy interesante pues
indicaría que el MJ induce con más fuerza las rutas metabólicas implicadas en la síntesis
de resina que aquellas otras implicadas en la síntesis de fenoles. En este sentido, se ha
observado en plantas anuales que diferentes elicitadores como MJ, acido salicílico y
etileno presentan diferentes efectos sobre la síntesis de diversos compuestos defensivos,
indicando en cierta medida una especificidad en la respuesta a la aplicación de diversos
mensajeros químicos (Baldwin, 1998).
Una posibilidad alternativa que ayudase a explicar los resultados observados sería
la existencia de factores no controlados. En este sentido, en los últimos días del periodo
experimental detectamos la presencia de thrips en las plantas que podría haber
modificado las concentraciones de fenoles en las hojas, y alterado el diseño
experimental. Es una posibilidad que no podemos confirmar ni rechazar con nuestro
diseño.
5.3 Bioensayo con procesionaria
No detectamos en el bioensayo con larvas de procesionaria diferencias familiares en
la preferencia de consumo ni entre plantas inducidas y plantas control. Nuestra hipótesis
es que la cantidad de polifenoles determinaría la tasa de ingestión de hojas por las larvas
de procesionaria. En este sentido, este resultado está de acuerdo con la falta de
inducción en la respuesta defensiva, y con la ausencia de diferencias familiares en el
contenido de polifenoles totales. Los bioensayos con insectos herbívoros se utilizan con
frecuencia para detectar si la inducción de compuestos defensivos tiene repercusiones
funcionales sobre la preferencia de los herbívoros. En el laboratorio del CINAM de
Lourizán se ha desarrollado con éxito otros bioensayos empleando el curculiónido
comedor de corteza Hylobius abietis en P. pinaster (Costas, 2007; Moreira et al., 2009),
pero no se había probado aún con procesionaria. Este insecto defoliador sí ha sido
usado por otros autores como Hodar et al. (2002) o Hodar et al. (2004) para identificar
diferencias en la preferencia de consumo. Este autor ha sugerido recientemente que las
larvas del 4º y 5º instar muestran muy pocas diferencias en la preferencia entre plantas,
y que sin embargo, las larvas de los primeros estadios sí que son sensibles a diferencias
entre plantas (Hodar, datos no publicados). Dado que las larvas jóvenes carecen de los
pelos urticantes alergénicos que poseen las larvas más viejas, las larvas de los primeros
estadios serían las preferibles para bioensayos.
6. CONCLUSIONES
1.- La aplicación exógena de 25 mM MJ no resultó efectiva como inductor del
contenido de polifenoles totales en las hojas de juveniles de P. radiata. Si se observa
una pequeña tendencia a un incremento de los fenoles tras la inducción con heridas
mecánicas, pero que no llega a ser estadísticamente significativa.
2.- No existieron diferencias familiares en la cantidad constitutiva de fenoles totales
foliares entre las 36 familias de P radiata analizadas.
3.- Los bioensayos con larvas de procesionaria del 4º instar no mostraron diferencias
significativas en el consumo de pinos control y pino tratados con MJ, ni tampoco entre
las diferentes familias ensayadas.
4.- Se sugiere la realización de nuevos ensayos con una concentración mayor de MJ
para descartar la posibilidad de que la concentración aplicada (25 mM) esté por debajo
de los niveles efectivos para la inducción de fenoles. También debería comprobarse si la
inducción de defensas fenólicas es mas específica de otros elicitadores químicos
distintos al MJ, como por ejemplo los inductores de las rutas metabólicas relacionadas
con el acido salicílico. Parece deseable realizar los bioensayos con larvas de
procesionaria en el 1º y 2º estadio larvario, pues las empleadas en el presente bioensayo
(4º instar) son extremadamente urticantes, por lo que todas las precauciones que se
tomen son pocas para evitar las molestias derivadas de las erupciones cutáneas.
7. BIBLIOGRAFÍA
Ayres, M.P., Clausen, T.P., McLean Jr., S.F., Redman, A.M., Reichardt, P.B., 1997.
Diversity of structure and antiherbivore activity in condensed tannins. Ecology 78,
1696–1712.
Baldwin, I.T., 1998. Jasmonate-induced responses are costly but benefit plants under
attack in native populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of
the United States of America 95, 8113-8118.
Baraza, E., Gomez, J., Hodar, J., Zamora, R., 2004. Herbivory has a greater impact in
shade than in sun: response of Quercus pyrenaica seedlings to multifactorial
environmental variation. Canadian Journal of Botany 82, 357-364.
Blanco, D., 2007. Contido de resina en xuvenis de Pinus pinaster Ait. Efecto da
dispoñobilidade de fósforo nas defensas constitutivas e inducidas con metil
xasmonato. PFC Escuela Politécnica Superior de Lugo (Universidade de Santiago
de Compostela), p. 41.
Cobos Suarez, J.M., Ruiz Urrestarazu, M.M., 1990. Phytosanitary problems of the
species Pinus radiata D. Don in Spain, with special reference to the Basque
country. Boletin de Sanidad Vegetal, Plagas 16, 37-53.
Costas, R., 2007. Preferencia de consumo del curculiónido Hylobius abietis sobre Pinus
pinaster en bioensayos:variación intraespecífica, efecto de la inducción de defensas
con metil jasmonato y comparación interespecífica con P. radiata. PFC Escuela
Universitaria de Ingeniería Técnica Forestal (Universidade de Vigo), p. 50.
Creelman, R.A., Mullet, J.E., 1995. Jasmonic acid distribution and action in plants:
regulation during development and response to biotic and abiotic stress. Proceedings
of the National Academy of Sciences of the United States of America 92, 41144119.
Creelman, R.A., Mullet, J.E., 1997. Biosynthesis and action of jasmonates in plants.
Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 48, 355-381.
Dajoz, R., 1980. Ecologie des insectes forestiers. Gauthier Villars Ed., Paris, France.
Dans, F.V., Fernández, F.A., Romero, A.G., 1999. Manual de selvicultura del pino
radiata en Galicia. Proxecto Columella. Area Forestal, Serie Manuales Técnicos.
Universidad de Santiago de Compostela, Santiago, Spain.
Dey, P.M., Harborne, J.B., 1997. Plant Biochemistry. Academic Press, Nueva York.
Donaldson, J.R., Lindroth, R.L., 2007. Genetics, environment, and their interaction
determine efficacy of chemical defense in trembling aspen. Ecology 88, 729-739.
Doyle, R.D., Grodowitz, M., Michael Smart, R., Owens, C., 2002. Impact of herbivory
by Hydrellia pakistanae (Diptera: Ephydridae) on growth and photosynthetic
potential of Hydrilla verticillata. Biological Control 24, 221-229.
Estiarte, M., Filella, I., Serra, J., Penuelas, J., 1994. Effects of nutrient and water stress
on leaf phenolic content of peppers and susceptibility to generalist herbivore
Helicoverpa armigera (Hubner). Oecologia 99, 387-391.
Fäldt, J., Martin, D., Miller, B., Rawat, S., Bohlmann, J., 2003. Traumatic resin defense
in Norway spruce (Picea abies): Methyl jasmonate-induced terpene synthase gene
expression, and cDNA cloning and functional characterization of (+)-3-carene
synthase. Plant Molecular Biology 51, 119–133.
Farmer, E.E., Ryan, C.A., 1992. Octadecanoid precursors of jasmonic acid activate the
synthesis of wound-inducible proteinase inhibitors. Plant Cell 4, 129-134.
Fernández, C., 2009. Contenido de resina total en familias de la población de mejora de
Pinus radiata de Galicia. Variación genética, inducción mediante metil jasmonato y
relación con la resistencia a Hylobius abietis en laboratorio. PFC Escuela
Politécnica Superior de Lugo (Universidade de Santiago de Compostela), p. 47.
Franceschi, V., Krekling, T., Christiansen, E., 2002. Application of methyl jasmonate
on Picea abies (Pinaceae) stems induces defense-related responses in phloem and
xylem. American Journal of Botany 89, 578-586.
Franceschi, V., Krokene, P., Krekling, T., 2005. Anatomical and chemical defenses of
conifer bark against bark beetles and other pests. New Phytologist 167, 353–376.
Harju, A.M., Venalainen, M., Laakso, T., Sranpaa, P., 2008. Wounding response in
xylem of Scots pine seedlings shows wide genetic variation and connection with the
constitutive defence of hertwood. Tree Physiology 29, 29, 19-25.
Hartley, S.E., Jones, C.G., 1997. Plant chemistry and herbivory, or why the world is
green. In: Crawley, M. (Ed.), Plant ecology. Cambridge, Mass, Blackwell, pp. 284324.
Heijari, J., Nerg, A.-M., Kainulainen, P., Viiri, H., Vuorinen, M., Holopainen, J.K.,
2005. Application of methyl jasmonate reduces growth but increases chemical
defence and resistance against Hylobius abietis in Scots pine seedlings.
Entomologia Experimentalis et Applicata 115, 117–124.
Heil, M., Baumann, B., Andary, C., Linsenmair, E.K., McKey, D., 2004. Extraction and
quantification of "condensed tannins" as a measure of plant anti-herbivore defence?
Revisiting an old problem. Naturwissenschaften 89, 519-524.
Heil, M., Silva Bueno, J.C., 2007. Within-plant signaling by volatiles leads to induction
and priming of an indirect plant defense in nature. Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America 104, 5467-5472.
Herms, D.A., Mattson, W.J., 1992. The dilemma of plants: to grow or defend. The
Quarterly Review of Biology 67, 283-335.
Hodar, J.A., Zamora, R., 2004. Herbivory and climatic warming: a Mediterranean
outbreaking caterpillar attacks a relict, boreal pine species. Biodiversity and
Conservation 13, 493-500.
Hodar, J.A., Zamora, R., Castro, J., 2002. Host utilization by moth and larval survival of
pine processionary caterpillar Thaumetopoea pityocampa in relation to food quality
in three Pinus species. Ecological Entomology 27, 292-301.
Hodar, J.A., Zamora, R., Castro, J., Baraza, E., 2004. Feast and famine: previous
defoliation limiting survival of pine processionary caterpillar Thaumetopoea
pityocampa in Scots pine Pinus sylvestris. Acta Oecologica 26, 203-210.
Holton, M.K., Lindroth, R.L., Nordheim, E.V., 2003. Foliar quality influences treeherbivore-parasitoid interactions:effects of elevated CO2, O3, and plant genotype.
Oecologia 137, 233–244.
Honkanen, T., Haukioja, E., Kitunen, V., 1999. Responses of Pinus sylvestris branches
to simulated herbivory are modified by tree sink/source dynamics and by external
resources. Functional Ecology 13, 126-140.
Hudgins, J.W., Christiansen, E., Franceschi, V.R., 2004. Induction of anatomically
based defense responses in stems of diverse conifers by methyl jasmonate: a
phylogenetic perspective. Tree Planters' Notes 24.
Hudgins, J.W., Franceschi, V.R., 2004. Methyl jasmonate-induced ethylene production
is responsible for conifer phloem defense responses and reprogramming of stem
cambial zone for traumatic resin duct formation. Plant Physiology 135, 2134–2149.
Keinanen, M., Julkunen-Tiitto, R., Mutikainen, P., Walls, M., Ovaska, J., Vapaavuori,
E., 1999. Trade-offs in phenolic metabolism of silver birch: effects of fertilization,
defoliation and genotype. Ecology 80, 1970-1986.
Klepzig, K.D., Kruger, E.L., Smalley, E.B., Raffa, K.F., 1995. Effects of biotic and
abiotic stress on induced accumulation of terpenes and phenolics in red pines
inoculated with bark beetle-vectored fungus. Journal of chemical ecology 21, 601626
Krischik, V.A., Denno, R.F., 1983. Individual, population, and geographic patterns in
plant defense. In: Denno, R.F., McClure, M.S. (Eds.), Variable plants and
herbivores in natural and managed systems. Academic Press, Boston, pp. 463-512.
Kyto, M., Niemela, P., Annila, E., Varama, M., 1999. Effects of forest fertilization on
the radial growth and resin exudation of insect-defoliated Scots pines. Journal of
Applied Ecology 36, 763-769.
Laitinen, M.-L., Julkunen-Tiitto, R., Rousi, M., 2002. Foliar phenolic composition of
European white birch during bud unfolding and leaf development. Physiologia
Plantarum 114, 450-460.
Lorio, P.L., Jr., 1986. Growth-differentiation balance: a basis for understanding
southern pine beetle tree interactions. Forest Ecology and Management 14, 259-273.
Makar, H.P.S. 2000. Quantification of tannins in tree foliage: a laboratory manual.
FAO/IAEA Working Document, Viena.
Martin, D., Tholl, D., Gershenzon, J., Bohlmann, J., 2002. Methyl jasmonate induces
traumatic resin ducts, terpenoid resin biosynthesis, and terpenoid accumulation in
developing xylem of Norway spruce stems. Plant Physiology 129, 1003-1018.
Mason, H.S., Mullet, J.E., 1990. Expression of two soybean vegetative storage protein
genes during development and in response to water deficit, wounding, and jasmonic
acid. Plant Cell 2, 569-579.
Matson, P.A., Hain, F.P., 1985. Host conifer defense strategies: A hypothesis. In,
Proceedings First IUFRO Conference on the Role of Host-Pest Interaction in the
Population Dynamics of Forest Insects, Banff, Alberta.
Miller, B., Madilao, L.L., Ralph, S., Bohlmann, J., 2005. Insect-induced conifer
defense. White pine weevil and methyl jasmonate induce traumatic resinosis, de
novo formed volatile emissions, and accumulation of terpenoid synthase and
putative octadecanoid pathway transcripts in Sitka spruce. Plant Physiology 137,
369–382.
Moreira, X., Sampedro, L., Zas, R., 2009. Defensive responses of Pinus pinaster
seedlings to exogenous application of methyl-jasmonate: Concentration effect and
systemic response. Environmental and Experimental Botany (en prensa).
O'Reilly-Wapstra, J.M., Iason, G.R., Thoss, V., 2006. The role of genetic and chemical
variation of Pinus sylvestris seedlings in influencing slug herbivory. Oecologia 152,
82-91.
Pavia, H., Toth, G.B., Aberg, P., 2002. Optimal defense theory: elasticity analysis as a
tool to predict intraplant variation in defenses. Ecology 83, 891-897.
Phillips, M.A., Croteau, R.B., 1999. Resin-based defenses in conifers. Trends in Plant
Science 4, 184-190.
Reinbothe, S., Reinbothe, C., Parthier, B., 1993. Methyl jasmonate-regulated translation
of nuclear-encoded chloroplast proteins in barley (Hordeum vulgare L. cv. salome).
Journal of Biological Chemistry 268, 10606-10611.
Rodríguez-Morales, B., 2008. Efecto de la disponibilidad de fósforo y variabilidad
genética en las defensas constitutivas e inducidas con metil jasmonato: Contenido
foliar de fenoles en juveniles de Pinus pinaster. PFC Escuela Politécnica Superior
de Lugo (Universidade de Santiago de Compostela), p. 56.
Rosner, S., Hannrup, B., 2004. Resin canal traits relevant for constitutive resistance of
Norway spruce against bark beetles: environmental and genetic variability. Forest
Ecology and Management 200, 77-87.
Sallé, A., Monclus, R., Yart, A., Lieutier, F., 2005. Effect of phenolic compounds on the
in vitro growth of two fungi associated with Ips typographus. Forest Pathology 35,
298–304.
Simms, E.L., Fritz, R.S., 1990. The ecology and evolution of host-plant resistance to
insects. Trends in Ecology & Evolution 5, 356-360.
Staswick, P.E., 1992. Jasmonate, genes, and fragrant signals. Plant Physiology 99, 804807.
Thaler, J.S., Stout, M.J., Karban, R., Duffey, S.S., 2001. Jasmonate-mediated induced
plant resistance affects a community of herbivores. Ecological Entomology 26, 312324.
Trapp, S., Croteau, R., 2001. Defensive resin biosynthesis in conifers. Annual Review
of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 52, 689-724.
Turtola, S., Manninen, A.M., Holopainen, J.K., Levula, T., Raitio, H., Kainulainen, P.,
2002. Secondary metabolite concentrations and terpene emissions of Scots pine
xylem after long-term forest fertilization. Journal of Environmental Quality 31,
1694-1701.
vanAkker, L., Alfaro, R.I., Brockley, R., 2004. Effects of fertilization on resin canal
defences and incidence of Pissodes strobi attack in interior spruce. Canadian
Journal of Forest Research 34, 855-862.
Vick, B.A., Zimmerman, D.C., 1984. Biosynthesis of Jasmonic acid by several plant
species. Plant Physiology 75, 458-461.
Wilen, R.W., Mandel, R.M., Pharis, R.P., Holbrook, L.A., Moloney, M.M., 1990.
Effects of abscisic acid and high osmoticum on storage protein gene expression in
microspore embryos of Brassica napus. Plant Physiology 94, 875-881.
Zeneli, G., Krokene, P., Christiansen, E., Krekling, T., Gershenzon, J., 2006. Methyl
jasmonate treatment of mature Norway spruce (Picea abies) trees increases the
accumulation of terpenoid resin components and protects against infection by
Ceratocystis polonica, a bark beetle-associated fungus. Tree Physiology 26, 977988.
Zou, J., Cate, R.G., 1995. Foliage constituents of douglas fir (Pseudotsuga menziesii
(Mirb.) Franco (Pinaceae)): Their seasonal variation and potential role in douglas fir
resistance and silviculture management. Journal of Chemical Ecology 21, 387-402.